基于多重等温扩增的诊断平台用于检测寨卡病毒、基孔肯雅病毒和登革病毒1型

本实验的总体目标是展示一种无需复杂样品前处理和昂贵仪器设备的多重即时检测诊断平台的使用方法，该平台可应用于多种生物样品。该方法有助于解决即时检测诊断领域中的关键问题，例如在单个反应管中同时检测多种目标物。通过采用环介导等温扩增技术并结合靶标特异性链置换探针，可高效检测三种不同的病毒。

该技术的主要优势在于采用等温扩增而非PCR，所需样本前处理步骤极少，并可应用于多种临床样本。首先使用打孔器将Q纸裁剪成3毫米×4毫米的小矩形。然后用微型研杵将可能感染寨卡病毒的埃及伊蚊（Aedes aegypti）雌蚊在每张纸上碾碎。

用移液器将20微升1摩尔的氨水溶液滴加到每张纸片上。五分钟后，用20微升50%乙醇洗涤每张纸片，随后用20微升无核酸酶水洗涤。在生物安全二级（BSL-2）生物安全柜中将纸片风干约一小时。

干燥后，用镊子将每张纸完全浸入含有100微升RT-LAMP反应混合液的溶液中，并在65至68摄氏度下孵育45分钟。使用带有LED光源和橙色或黄色滤光片的3D打印观察盒，读取并记录来自寨卡病毒的荧光信号。首先，在含有冻干RT-LAMP试剂的每个反应管中加入90微升1.1倍重悬缓冲液，并通过振荡使其溶解。

然后在1,000 × g条件下短暂离心。离心后，向反应管中加入10 µL含有病毒RNA的尿液样本，并用移液器吹打混匀。若检测蚊子，将含有蚊虫尸体的Q纸条与10 µL纯化水一同加入反应管中，代替尿液样本。

将封闭的试管放入预设温度为 65 至 68 摄氏度的加热块中，孵育 30 至 45 分钟。孵育结束后，保持试管封闭，以防污染后续实验，然后放入观察箱中。打开观察箱背面的开关。

通过橙色滤光片观察样本，并用手机摄像头拍摄图像，手机应保持在使图像占视野80%的距离。观察完成后，关闭开关。若需后续观察，应将密封的试管避光保存，最好冷藏。

无论是单重还是多重检测，RT-LAMP 产物在琼脂糖凝胶电泳中均呈现为串联体条带。以水作为样本的阴性对照样品仅显示引物自身形成的条带，其中包括使用未感染雌性蚊子提取的总核酸作为模板的非特异性靶标对照。使用5'端FAM标记的探针检测寨卡病毒时可观察到绿色荧光。

基孔肯雅病毒的探针在5'端NT位置用HEX标记，呈现亮黄绿色荧光。登革病毒1型的探针在5'端NT位置用TAMRA标记，呈现橙红色荧光。将含有蚊子的两份样本直接浸入RT-LAMP反应混合物中，在65摄氏度孵育30分钟后，若存在寨卡病毒，则观察到明显的绿色荧光。

使用九份体积的重悬缓冲液与一份体积的尿液样本，可在30分钟内产生可见的绿色荧光，并可通过任意手机摄像头拍摄图像。该技术开发后，为临床诊断领域的研究人员探索用于检测尿液、血液、唾液或蚊虫尸体中蚊媒病毒的即时检测平台铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分理解如何在多种生物样本中以多重方式使用等温扩增系统（本例中为LAMP）来检测寨卡病毒及其他虫媒病毒。