基于复用等温放大诊断平台检测 Zika、基孔肯亚和登革热1

该程序的总体目标是展示多路检测即时诊断平台的使用，该平台不需要大量的样品制备和昂贵的仪器，并且可用于各种生物样品。该方法可以帮助回答即时诊断领域的关键问题，例如在单个反应管中检测不同的靶标。通过使用环介导的等温扩增与靶标特异性链置换探针相结合，可以有效地检测三种不同的病毒。

该技术的主要优点是它使用等温扩增而不是 PCR，并且需要最少的样品制备，并且可以应用于一系列临床样品。首先使用打孔机将 Q 纸片材切割成 3 毫米 x 4 毫米的小矩形。然后用微杵将可能感染寨卡病毒的埃及伊蚊雌性蚊子压碎到每张纸上。

20 微升一摩尔氨水溶液移液到每张纸上。5 分钟后，用 20 μL 50% 乙醇洗涤每张试纸，然后用 20 μL 无核酸酶水洗涤。在 BSL-2 生物安全柜中风干纸张约一小时。

干燥后，使用镊子将每张纸完全浸入 100 微升 RT-LAMP 反应混合物中，并在 65 至 68 摄氏度下孵育 45 分钟。使用带有 LED 光源和橙色或黄色滤光片的 3D 打印观察箱读取和记录寨卡病毒产生的荧光。首先向每个含有冻干 RT-LAMP 试剂的反应管中加入 90 μL 的 1.1 倍再水化缓冲液，然后摇动溶解。

然后以 1， 000 倍重力短暂旋转。离心后，向反应管中加入 10 μL 加标病毒 RNA 的尿液样品，并通过移液混合。如果检测蚊子，请添加一个装有蚊子尸体的矩形 Q 纸以及 10 微升纯净水，而不是尿液。

将封闭的试管放入预设为 65 至 68 摄氏度的加热块中，孵育 30 至 45 分钟。孵育后，保持试管关闭以防止污染未来的分析并放入观察箱中。打开观察箱背面的开关。

通过橙色滤光片观察样品，并通过手机摄像头捕获图像，该摄像头保持在图像填充 80% 视野的距离。可视化完成后，关闭开关。将密封管存放在黑暗中，如果以后需要观察，最好冷藏。

在单重和多重情况下，RT-LAMP 产物在琼脂糖凝胶上运行时都显示为一个字母的串联体。含有水作为样品的阴性对照样品仅给出了引物本身的条带，包括非特异性靶对照，其中从未感染的雌性蚊子中提取的总核酸用作模板。使用探针观察到寨卡病毒的绿色荧光，因为 FAM 标记了 5 个引物 NT。

浅绿色、黄色荧光被分配给基孔肯雅热，其中探针是用 HEX 标记的 5 个引物 NT。橙红色荧光用于登革热 1，其中其探针是用 TAMRA 标记的五个引物 NT。将两张含有蚊子的试纸直接浸没在 RT-LAMP 混合物中，在 65 摄氏度下孵育 30 分钟后，在寨卡病毒存在下观察到亮绿色荧光。

使用 9 体积的再水化缓冲液和 1 体积的尿液样本，可在 30 分钟内产生可见的绿色荧光，并且任何手机摄像头都可以捕捉图像。开发后，这项技术为临床诊断领域的研究人员探索即时护理平台以检测尿液、血液、唾液或蚊子尸体中的蚊媒病毒铺平了道路。看完这个视频后，你应该对如何使用等温扩增系统（在本例中是灯）在各种生物样品中以多重方式检测寨卡病毒和其他虫媒病毒有了很好的了解。