Name: 基于复用等温放大诊断平台检测 Zika、基孔肯亚和登革热1 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: 学习使用环介导等温扩增技术检测寨卡、基孔肯亚和登革热病毒的多重即时诊断平台。该方法利用靶标特异性链置换探针，可在单一反应管中实现高灵敏度、高特异性的病毒检测，适用于尿液、血液、唾液及蚊虫组织等多种生物样本，为资源有限环境下的现场诊断提供了简便、经济的解决方案。

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本工作部分由 FDOH-7ZK15 和 NIAID 1R21AI128188-01 资助。本出版物所报告的研究部分得到美国国家过敏与传染病研究所以及佛罗里达州卫生部生物医学研究计划的支持。本内容仅由作者负责，不一定代表美国国立卫生研究院（NIH）或佛罗里达州卫生部的官方观点。谨此感谢 Dynamic Combinatorial Chemistry LLC 对本项目的支持与贡献。
登革病毒1型（毒株BOL-KW010）由佛罗里达州卫生部实验室局惠赠。寨卡病毒及基孔肯雅病毒亚洲系由美国疾病控制与预防中心慷慨提供。基孔肯雅病毒印度洋系由罗伯特·泰什（Robert Tesh，新兴病毒与节肢动物传播病毒世界参考中心，经德克萨斯州加尔维斯顿市德克萨斯大学医学分部）提供给佛罗里达大学佛罗里达媒介生物实验所（UF-FMEL）。我们感谢S. Bellamy、B. Eastmond、S. Ortiz、D. Velez、K. Wiggins、R. ZimLer和K. Zirbel在感染实验中提供的协助。我们还感谢M. S. Kim提供Q-paper。

注意：蚊子是本研究中唯一直接使用的动物。用于饲养感染蚊子的鸡的管理程序已获得佛罗里达大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准，方案编号为#201507682。病毒扩增和蚊子感染研究在佛罗里达州维罗海滩佛罗里达医学昆虫学实验室的生物安全三级（BSL-3）设施中进行。RT-LAMP实验在佛罗里达州阿拉楚阿由FfAME与Firebird Biomolecular Sciences LLC共享的生物安全二级（BSL-2）实验室中进行。
1. 引物和链置换探针的设计
<ol>
	<li>从布罗德研究所数据库中提取登革热1型病毒序列23；寨卡病毒和基孔肯雅病毒的序列来自美国国家过敏与传染病研究所病毒病原体数据库与分析资源24.
	<ol>
		<li>使用软件 MUSCLE v3.8.31 为目标序列创建多序列比对（MSAs）25利用生成的多序列比对结果，在目标序列的保守区域内搜索LAMP引物组，并避免非相关或非特异性目标，例如目标序列不同亚型之间的差异。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>遵循在线描述的LAMP引物设计规则（http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/），并在引物中允许使用混合碱基以覆盖病毒的多样性26为避免引物组之间的交叉反应，使用 NCBI BLAST 将生成的 LAMP 引物与 NCBI RNA 病毒数据库进行比对27使用 NCBI BLAST 进一步比对每组引物，以排除在多重检测中可能发生二聚体化的引物。</li>
	<li>针对链置换探针的双链部分，筛选其与任何病毒基因组序列及蚊类基因组序列的交叉反应性。分别使用荧光素酰胺（FAM）、HEX染料和5-羧基四甲基罗丹明（TAMRA）染料修饰靶标结合探针的5'端，用于检测寨卡病毒、基孔肯雅病毒和登革病毒1型。
	<ol>
		<li>包含用于尿液样本的阳性对照引物组。设计靶向人线粒体DNA的LAMP引物。在5'端用TET标记链置换探针。用淬灭基团标记与荧光标记探针部分互补的淬灭探针例如，3'端带Iowa Black-FQ淬灭基团）表1).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 病毒分离株与感染蚊虫样本
<ol>
	<li>使用寨卡病毒（波多黎各株）、基孔肯雅病毒（留尼汪株或英属维尔京群岛株）和登革病毒1型（基韦斯特株）的分离株。通过蚀斑试验测定病毒滴度。28 或定量RT-PCR29使用市售RNA提取试剂盒提取病毒RNA。 
	注意： 表2 表示本研究中使用的每种病毒分离株的病毒滴度。</li>
	<li>遵循 Yaren 发表的文章 等 有关感染的详细方案 埃及伊蚊 感染寨卡病毒和基孔肯雅病毒的女性20参见 表2 用于检测感染寨卡病毒的蚊子样本的病毒滴度。</li>
</ol>
3. 与热不稳定尿嘧啶DNA糖基化酶偶联的RT-LAMP
<ol>
	<li>10倍引物混合液的配制。
	<ol>
		<li>通过加入无核酸酶水配制每种引物和探针的100 µM储存液（参见步骤1）。充分涡旋混匀，并于-20 °C保存备用。</li>
		<li>针对寨卡病毒、登革热病毒1型或线粒体DNA靶标配制10倍引物混合液时，将16 µL FIP、16 µL BIP、2 µL F3、2 µL B3、5 µL LF、2 µL LB、3 µL LB-荧光标记探针、4 µL淬灭探针和50 µL无核酸酶水混合，总体积为100 µL。</li>
		<li>针对基孔肯雅病毒配制10倍引物混合液时，将16 µL FIP、16 µL BIP、2 µL F3、2 µL B3、5 µL LB、2 µL LF、3 µL LF-荧光标记探针、4 µL淬灭探针和50 µL无核酸酶水混合，总体积为100 µL。 
		注：上述探针浓度对应最终反应体系中荧光探针为300 nM，淬灭探针为400 nM。或者，在实时检测分析中可使用80 nM荧光标记探针及其200 nM淬灭探针。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在0.25 mL PCR管中加入5 µL 10倍引物混合液（对于三重反应，每种10倍引物混合液各加5 µL）、5 µL 10倍等温扩增缓冲液（1倍缓冲液成分为：20 mM Tris-HCl缓冲液，pH 8.8，50 mM KCl，10 mM (NH4)2SO4，8 mM MgSO4，0.1% Tween-20，1 mM DTT）、7 µL dNTP混合物（dATP、dCTP和dGTP各10 mM；dTTP和dUTP各5 mM）、16单位DNA聚合酶、15单位逆转录酶、80单位重组核糖核酸酶抑制剂、2单位热不稳定UDG、1–2 µL不同量的病毒RNA，并加水至总体积为50 µL（参见材料表）。</li>
	<li>在此阶段设置阴性对照实验，用水替代病毒RNA的体积。将样品在65–68 °C孵育45分钟至1小时，然后取每份样品5 µL在含溴化乙锭（0.4 µg/mL）的1X TBE缓冲液配制的2.5%琼脂糖凝胶上电泳分析。使用25 bp或50 bp DNA ladder作为凝胶分子量标记。 
	注：添加非靶标特异性模板为可选步骤。</li>
	<li>为检测病原RNA的存在，可通过改变反应温度和/或镁离子浓度对每对引物及其无模板对照进行测试，因为每组RT-LAMP引物设计时均适用于不同的反应温度（65 °C至68 °C）或镁离子浓度（最终6至10 mM）。实验应在室温下配制。</li>
</ol>
4. 使用病毒RNA加标尿液进行RT-LAMP
<ol>
	<li>在总体积为 50 µL 的反应体系中，测试 RT-LAMP 引物在不同终浓度尿液（0%、10%、20% 和 50%）中的表现。对于 10% 的终尿液浓度，将 1 µL 病毒 RNA 加入 5 µL 尿液中；对于 20% 的终尿液浓度，将 1 µL 病毒 RNA 加入 10 µL 尿液中；对于 50% 的终尿液浓度，将 1 µL 病毒 RNA 加入 25 µL 尿液中。</li>
	<li>为在 10% 尿液条件下实时监测 RT-LAMP 反应，使用配备不同荧光滤光片的实时 PCR 仪器（参见材料表）。
	<ol>
		<li>检测 Zika 病毒 FAM 标记扩增子的荧光信号时，使用 483 至 533 nm 的滤光片；检测基孔肯雅病毒 HEX 标记扩增子时，使用 523 至 568 nm 的滤光片；检测登革热病毒 1 型 TAMRA 标记扩增子时，使用 558 至 610 nm 的滤光片；检测线粒体 DNA TET 标记扩增子时，使用 523 至 568 nm 的滤光片。 
		注：FAM 的激发和发射最大值分别为 495 nm 和 520 nm；HEX 的激发和发射最大值分别为 538 nm 和 555 nm；TAMRA 的激发和发射最大值分别为 559 nm 和 583 nm；TET 的激发和发射最大值分别为 522 nm 和 539 nm。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 96 孔板，并用透明塑料封膜密封，随后在 65–68 °C 下孵育 60–90 分钟，利用光循环仪每 30 秒记录一次荧光信号。初始使用 80 nM 的荧光标记探针，随后测试 300 nM 的荧光标记探针。
	<ol>
		<li>通过在 10% 终尿液浓度中加入系列稀释的病毒 RNA，确定各靶标的检测下限。 
		注：使用实时 RT-LAMP 确定最佳反应温度、镁离子浓度、荧光标记探针浓度及反应时间。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为通过肉眼观察链置换探针产生的荧光，使用光循环仪中激发波长为 470 nm 的蓝色 LED 光源（任何内置蓝色光源的凝胶电泳观察箱均可使用，参见材料表），并在室温避光条件下用手机摄像头拍摄图像。 
	注：当需使用蓝色 LED 通过肉眼观察三种颜色的荧光时，应使用 300 nM 的荧光标记探针。</li>
</ol>
5. 使用Q-Paper技术对寨卡病毒感染蚊虫进行RT-LAMP检测
<ol>
	<li>根据先前发表的方法并稍作修改，制备季铵盐修饰的滤纸（Q-paper）30。
	<ol>
		<li>将1 g直径为3.5 cm的纤维素滤纸圆片（参见材料表）浸入50 mL的1.8%氢氧化钠水溶液中，活化15分钟。</li>
		<li>通过真空抽滤收集活化后的滤纸圆片，然后将其浸入40 mL含有0.28 g (2,3-环氧丙基)三甲基氯化铵的水溶液中，在室温下过夜反应。 
		注：保持(2,3-环氧丙基)三甲基氯化铵与滤纸的质量比为0.28:1。</li>
		<li>通过真空抽滤收集所得的阳离子化滤纸，并用50 mL的1%乙酸溶液进行中和。</li>
		<li>用乙醇洗涤滤纸三次，并在通风橱内持续气流条件下自然晾干。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用打孔器或剪刀将Q-paper裁剪成小矩形（3 mm × 4 mm）。用微型研杵在每张纸上研磨可能感染寨卡病毒的埃及伊蚊（Ae. aegypti）雌蚊。</li>
	<li>向每张纸中加入20 µL的1 M氨水溶液（pH ≈ 12），静置5分钟。随后用20 µL的50%乙醇洗涤一次，再用20 µL无核酸酶水洗涤一次。在BSL-2生物安全柜中晾干约1小时。 
	注：此时样品可在-20 °C保存过夜，直至使用。</li>
	<li>使用镊子将每张纸放入100 µL的RT-LAMP反应体系中，在65–68 °C孵育45分钟。确保纸片完全浸没于溶液中，不得漂浮。使用蓝光LED光源配合橙色或黄色滤光片观察并记录来自寨卡病毒的荧光信号。</li>
</ol>
6. RT-LAMP 试剂的冻干处理（反应体积为 100 µL）
<ol>
	<li>根据第 3.1 节配制 10X LAMP 引物混合液，并根据第 3.2 节配制含 dUTP 的 dNTP 混合液。将引物混合液和 dNTP 储存于 -20 °C，待用。</li>
	<li>配制 10 mL 酶透析缓冲液以去除甘油：混合 100 µL 1 M Tris-HCl（pH 7.5）、500 µL 1 M KCl、2 µL 0.5 M EDTA、100 µL 10% Triton X-100、100 µL 0.1 M DTT 和 9.198 mL 无核酸酶水。将透析缓冲液储存于 4 °C。 
	注意：使用前确保所有缓冲液试剂溶液均经过滤（0.2 微米滤器），并储存于 4 °C。
	<ol>
		<li>使用截留分子量为 10 kDa 的超滤膜（见材料表）。向超滤膜中加入 350 µL 透析缓冲液、4 µL（32 单位）DNA 聚合酶、2 µL（30 单位）逆转录酶和 2 µL（80 单位）RNase 抑制剂，于 4 °C 以 14,000 x g 离心 5 分钟。</li>
		<li>向超滤膜中再加入 350 µL 透析缓冲液，再次以 14,000 x g 离心 5 分钟。清空收集管后重复此步骤，再以 14,000 x g 离心 3 分钟。</li>
		<li>洗脱时，将超滤膜倒置并放入新的收集管中，以 1,000 x g 离心 2 分钟。测量洗脱液体积；若少于 8 µL，用透析缓冲液补足至 8 µL。将洗脱液储存于 4 °C，并立即进行下一步操作。 
		注意：本方案适用于单管冻干，但建议每次使用同一超滤膜至少同时处理 10 个反应管，并使用相同体积的透析缓冲液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在 0.5 mL 微离心管中混合 10 µL 10X LAMP 引物（单重反应）或每种 10X 引物混合液各 10 µL（三重反应）、14 µL dNTP 混合液、8 µL 透析后的酶混合液、2 µL（2 单位）热不稳定 UDG 和 66 µL 无核酸酶水（三重反应使用 46 µL），打开管盖。可另加一个用针扎孔的管盖，以便蒸汽逸出。</li>
	<li>立即将管子在 -80 °C 冷冻 2 小时，然后冻干 4 小时。用铝箔覆盖冻干室以避光。试剂干燥后，移除带孔的管盖，盖上原管盖，将含冻干试剂的管子避光储存于 4 °C。 
	注意：如有需要，试剂可过夜冻干。</li>
</ol>
7. 使用含寨卡病毒的尿液和蚊虫样本测试冻干 RT-LAMP 试剂
<ol>
	<li>使用以下试剂盒中的物品（参见材料表）用于寨卡病毒检测：带有橙色滤光片（长通滤光片，起始波长约540 nm）的3D打印观察盒、观察盒用的2节AAA电池、标有ZV的冻干反应管（用于寨卡病毒检测），以及装在1.5 mL螺口管中的1.1X复溶缓冲液。</li>
	<li>通过混合以下组分配制50 mL的1.1X复溶缓冲液：5.5 mL随DNA聚合酶提供的10X等温扩增缓冲液（参见材料表）、3.3 mL 100 mM MgSO4、110 µL 0.5 M DTT，以及41.09 mL无核酸酶水。充分混匀后，将该溶液分装为每管1 mL至1.5 mL螺口管中，4 °C保存备用。</li>
	<li>向每个反应管（0.5 mL）中加入90 µL的1.1X复溶缓冲液。确保液体完全覆盖管底的冻干试剂（通过振荡混合使其溶解，然后短暂离心（1,000 × g））。向反应管中加入10 µL掺入病毒RNA的尿液样本（详见第4.1节）。
	<ol>
		<li>若检测蚊虫样本，则加入承载蚊虫尸体的Q纸小片（按第5.2和5.3节所述步骤制备），并用10 µL纯化水代替尿液样本。 
		注：也可用10 µL唾液或血清样本代替尿液。若样本为提取的DNA或RNA，则向复溶后的混合液中加入2–5 µL样本，并用无核酸酶水补足至终体积10 µL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>盖紧反应管盖。将反应管放入预热至65–68 °C的金属浴/水浴（或培养箱）中。孵育30–45分钟，但不得超过1小时。孵育结束后，从加热设备中取出反应管。为防止后续实验受到污染，确保这些反应管保持封闭状态。</li>
	<li>将反应管放入观察盒中；温度将降至环境温度（建议为25 °C）。打开观察盒背面的开关，通过橙色滤光片观察样本，并用手机相机拍摄图像，手机应保持适当距离，使图像占据视野的80%左右。 
	注：在低光照环境中可获得更清晰的可视化效果。</li>
	<li>完成观察后，关闭开关。若需后续再次观察，应将密封的反应管避光保存，建议冷藏。</li>
</ol>

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多位作者及其所属机构拥有与该检测方法相关的知识产权。

包括寨卡病毒、基孔肯雅病毒和登革病毒在内的蚊媒病毒对公共卫生构成威胁，近期寨卡病毒的暴发凸显了开发低成本即时检测方法的迫切需求，不仅用于患者诊断，也用于蚊媒监测。等温扩增技术被开发为比基于PCR的系统更经济的替代方案。特别是基于逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）的平台已被应用于检测多种病原体。然而，等温扩增平台的应用主要局限于单一目标检测。本文报道的方法采用一种改良的RT-LAMP技术，可在单个反应体系中同时检测三个不同的目标，反应在中等温度范围（65–68 °C）下进行，该温度条件已被证明特别有利，因为高于60 °C的温度可使寨卡病毒及其他病毒失去感染性30,35。
此外，本文提供的数据显示，RT-LAMP 能够耐受可能存在于各种生物液体中的抑制性物质15。这使得病毒RNA无需经过额外的RNA纯化步骤，可直接将样本加入反应体系中进行扩增。根据样本类型的不同，需确定允许添加的最大样本体积，以避免抑制反应或引起背景荧...

蚊媒病毒性感染，包括登革热、基孔肯雅热和寨卡病毒，正在不断上升，亟需立即采取管理策略。登革热病毒和基孔肯雅热病毒已在许多热带地区呈地方性流行，而寨卡病毒目前正蔓延至西半球1。寨卡病毒与登革热病毒同属黄病毒科（Flaviviridae），起源于非洲，包含一个亚洲型和两个非洲型基因谱系2。尽管寨卡病毒早在1947年即被发现，但在随后的半个世纪中，人类感染病例一直呈零星分布，直到近年来在太平洋地区和美洲暴发。首次报告的寨卡热疫情发生于2007年密克罗尼西亚联邦的雅普岛，随后于2013年和2014年在法属波利尼西亚暴发。美洲地区的首次大规模疫情则发生于2015年的巴西。
寨卡病毒、基孔肯雅病毒和登革病毒主要通过埃及伊蚊（Aedes aegypti）和白纹伊蚊（Aedes albopictus）传播。然而，寨卡病毒还存在其他间接的人际传播途径，可能通过性接触、母婴垂直传播以及哺乳传播3,4,5。最初认为寨卡热仅引起轻微病症，但后来发现其与成人吉兰-巴雷综合征、新生儿小头畸形以及可持续数月甚至数年的慢性肌肉骨骼疾病相关。由于寨卡病毒感染的症状与其他蚊媒传播病毒相似，其诊断具有挑战性6。这些病毒常见的共感染现象使鉴别诊断更加困难7,8。因此，迫切需要快速、可靠地检测寨卡病毒及其他病毒的核酸，以实现实时流行病学监测、及时启动防控措施，并有效管理患者诊疗9。
目前针对这些病毒的诊断检测包括血清学检测、病毒分离、病毒测序以及逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）。常规血清学方法通常存在敏感性不足的问题，且对于既往感染过其他黄病毒的患者，可能出现交叉反应，使检测结果复杂化。
因此，核酸检测仍然是检测和区分这些病毒最可靠的方法。寨卡病毒及其他蚊媒病毒的检测通常采用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）或实时RT-PCR，可在多种生物液体中进行，例如血清、尿液、唾液、精液、乳汁和脑脊液10,11。相较于血液样本，通常更优先选择尿液和唾液样本，因为这些样本的PCR抑制作用更小、病毒载量更高、病毒存留时间更长，且采集和处理更为方便12,13。然而，基于RT-PCR的诊断检测需要复杂的样本前处理步骤，并依赖昂贵的热循环设备，因此在即时检测（point-of-care）场景中应用受限。
逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）作为一种强大的逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）替代方法，因其高灵敏度和特异性14、对生物样本中抑制物质的耐受性15，以及在单一温度下运行的特性而受到关注。该特性显著降低了检测的复杂性和相关成本，使其适用于资源有限的环境。经典的RT-LAMP方法包含六条引物，可结合靶标RNA内的八个不同区域。该反应在60 °C至70 °C的恒定温度下进行，依赖于逆转录酶和具有强链置换活性的DNA聚合酶。
在RT-LAMP的初始阶段，正向和反向内引物（FIP和BIP，图1A）与外侧正向和反向引物（F3和B3）共同形成哑铃结构，该结构是指数级LAMP扩增的起始结构。环引物（LF和LB）可结合哑铃结构的单链区域，进一步加速扩增反应，并导致形成具有多个重复环的串联多联体16。基于浊度检测或DNA嵌入染料读数的传统LAMP检测方法并不完全适用于寨卡病毒的现场快速检测，尤其是在需要一定程度多重检测能力的情况下17,18,19。在这些系统中实现多重检测较为困难，因为容易因非靶标扩增而产生假阳性结果。
为解决这些问题，文献在经典RT-LAMP体系中引入了一个额外组分，即&#34;链置换探针&#34;20,21,22。每条探针包含一个序列特异性的双链区和一个单链引物区。带有单链区的探针在其5'端标记荧光团，而其互补探针则在3'端修饰淬灭基团。在无靶标存在时，由于互补探针链发生杂交，使荧光团与淬灭基团紧密靠近，因此不产生荧光信号。当靶标存在时，荧光标记探针的单链部分会与其在靶标上的互补序列结合，并被链置换聚合酶延伸。随后，反向引物介导的聚合酶进一步延伸，导致淬灭链与其互补的荧光标记链分离，从而释放荧光信号(图1B)。采用该设计，信号在哑铃结构形成后才产生，从而降低了假阳性信号出现的可能性。
置换探针的双链部分可以是任意序列，当进行多重检测时，同一序列可与不同的荧光基团-淬灭基团组合联用。采用这种设计，受病毒污染的尿液、血清或压在纸上的蚊虫样本可直接加入检测体系，无需样本前处理。在30至45分钟内即可产生肉眼可见的三色荧光信号，信号通过一个使用蓝色LED和橙色滤光片的3D打印观察盒进行可视化。将RT-LAMP试剂冻干后，该检测试剂盒可在无需冷藏的低资源环境中部署使用。

<table><tbody><tr><td>SafeBlue 照明仪/电泳系统，MBE-150-PLUS</td><td>Major Science</td><td>MBE-150</td><td>凝胶电泳</td></tr><tr><td>G:BOX F3</td><td>Syngene</td><td>G:BOX F3</td><td>凝胶成像</td></tr><tr><td>LightCycler 480 仪器 II，96 孔</td><td>Roche Applied Science</td><td>05 015 278 001</td><td>实时 PCR</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-0.5 离心过滤单元，含 Ultracel-10 膜</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC501096</td><td>透析用超滤膜</td></tr><tr><td>Eppendorf 5417C 离心机</td><td>Marshall Scientific</td><td>EP-5417C</td><td>离心机</td></tr><tr><td>Myblock Mini Drybath</td><td>Benchmark Scientific</td><td>BSH200</td><td>干浴器</td></tr><tr><td>FreeZone Plus 6 升级联控制台冷冻干燥系统</td><td>Labconco</td><td>7934020</td><td>冻干机</td></tr><tr><td>所有引物和探针</td><td>IDT</td><td>定制</td><td>RT-LAMP 引物和探针</td></tr><tr><td>dNTP 混合物</td><td>Bioline</td><td>BIO-39049</td><td></td></tr><tr><td>脱氧尿苷三磷酸（dUTP）</td><td>Promega</td><td>U1191</td><td></td></tr><tr><td>Bst&amp;nbsp;2.0 WarmStart&amp;nbsp;DNA 聚合酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0538L</td><td>酶</td></tr><tr><td>WarmStart RTx 逆转录酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0380L</td><td>酶</td></tr><tr><td>鼠源 RNase 抑制剂</td><td>New England Biolabs</td><td>M0314L</td><td>酶</td></tr><tr><td>南极热不稳定 UDG</td><td>New England Biolabs</td><td>M0372L</td><td>酶</td></tr><tr><td>50 bp DNA 阶梯标记物</td><td>Promega</td><td>G4521</td><td>标记物</td></tr><tr><td>LightCycler 480 96 孔白色多孔板</td><td>Roche Applied Science</td><td>4729692001</td><td>实时 RT-LAMP 分析</td></tr></tbody></table>

基于多重等温扩增的诊断平台用于检测寨卡病毒、基孔肯雅病毒和登革病毒1型

Multiplexed Isothermal Amplification Based Diagnostic Platform to Detect Zika, Chikungunya, and Dengue 1

寨卡病毒、登革热病毒和基孔肯雅病毒通过蚊子传播，引起的疾病症状相似。然而，这些病毒在人与人之间的传播潜力不同，且需要截然不同的治疗方法。因此，近期寨卡病毒的暴发迫切需要开发能够快速区分患者及捕获蚊子体内这些病毒的工具，以选择正确的治疗方案，并实时了解和管理其流行病学情况。
遗憾的是，目前的诊断检测方法（包括2016年获得紧急使用授权和快速审批资格的检测）均依赖于通过逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）来检测病毒RNA，该方法需要专用仪器、经过培训的操作人员以及复杂的样本前处理。因此，这些检测必须送往&#34;经批准&#34;的参考实验室进行，耗时较长。事实上，2016年8月，美国疾病控制与预防中心（CDC）曾要求被蚊子叮咬并出现提示寨卡病毒感染皮疹的孕妇，在无法接受的情况下等待2至4周才能获知是否感染。我们迫切需要能够在现场进行、资源需求少、且可由经过培训但无需持证的专业人员操作的检测方法。
本视频展示了一种符合上述要求的检测方法，可用于尿液或血清（针对患者）以及研磨后的蚊虫尸体（用于环境监测），且无需复杂的样本前处理。蚊虫尸体被截留在含有季铵盐基团的滤纸（Q-纸）上，随后通过氨处理以控制生物危害。处理后的样本无需进行RNA提取，可直接加入含有冻干试剂的检测管中，试剂无需冷链运输和储存。采用一种改良的逆转录环介导等温扩增技术，配合靶标特异性的荧光标记可置换探针，可在30分钟内产生三色荧光信号作为读出结果。信号通过带有橙色滤光片的手持式电池供电设备进行观察。检测过程中采用密封管防止扩增产物的前向污染，同时在扩增体系中加入dUTP和热不稳定的尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）以进一步控制污染。

最初，对每对RT-LAMP引物的性能进行评估 （表1） 及其相应的病毒RNA底物以及阴性对照通过凝胶电泳进行评估。RT-LAMP引物设计用于靶向寨卡病毒和登革病毒1型的NS5区域（RNA依赖性RNA聚合酶）以及基孔肯雅病毒的nsP2区域（非结构蛋白P2）。模板为从在非洲绿猴肾（Vero）细胞中培养的病毒储备液中提取的总RNA。在某一情况下，从一名感染基孔肯雅病毒的女性体内提取了总核酸（DNA和RNA） 埃及伊蚊 （表2）.
图 2A 展示了使用这些样本进行 RT-LAMP 所得的一些代表性结果。在单重和多重（三重）反应中，RT-LAMP 产物在琼脂糖凝胶电泳中均呈现为串联重复片段组成的梯状条带。以水作为样本的阴性对照仅出现引物自身形成的条带，其中包括非特异性靶标对照，该对照以未感染的埃及伊蚊（Ae. ...

目前用于检测寨卡病毒、基孔肯雅病毒和登革病毒的多重诊断方法需要复杂的样品制备过程和昂贵的仪器设备，难以在资源有限的环境中应用。我们展示了一种基于等温扩增技术并结合靶标特异性链置换探针的诊断方法，可高灵敏度、高特异性地检测并区分这些病毒。

寨卡病毒、登革热病毒和基孔肯雅病毒通过蚊子传播，可引起症状相似的疾病。然而，它们具有不同的……

本实验的总体目标是展示一种无需复杂样品前处理和昂贵仪器设备的多重即时检测诊断平台的使用方法，该平台可应用于多种生物样品。该方法有助于解决即时检测诊断领域中的关键问题，例如在单个反应管中同时检测多种目标物。通过采用环介导等温扩增技术并结合靶标特异性链置换探针，可高效检测三种不同的病毒。该技术的主要优势在于采用等温扩增而非PCR，所需样本前处理步骤极少，并可应用于多种临床样本。首先使用打孔器将Q纸裁剪成3毫米×4毫米的小矩形。然后用微型研杵将可能感染寨卡病毒的埃及伊蚊（Aedes aegypti）雌蚊在每张纸上碾碎。用移液器将20微升1摩尔的氨水溶液滴加到每张纸片上。五分钟后，用20微升50%乙醇洗涤每张纸片，随后用20微升无核酸酶水洗涤。在生物安全二级（BSL-2）生物安全柜中将纸片风干约一小时。干燥后，用镊子将每张纸完全浸入含有100微升RT-LAMP反应混合液的溶液中，并在65至68摄氏度下孵育45分钟。使用带有LED光源和橙色或黄色滤光片的3D打印观察盒，读取并记录来自寨卡病毒的荧光信号。首先，在含有冻干RT-LAMP试剂的每个反应管中加入90微升1.1倍重悬缓冲液，并通过振荡使其溶解。然后在1,000 × g条件下短暂离心。离心后，向反应管中加入10 µL含有病毒RNA的尿液样本，并用移液器吹打混匀。若检测蚊子，将含有蚊虫尸体的Q纸条与10 µL纯化水一同加入反应管中，代替尿液样本。将封闭的试管放入预设温度为 65 至 68 摄氏度的加热块中，孵育 30 至 45 分钟。孵育结束后，保持试管封闭，以防污染后续实验，然后放入观察箱中。打开观察箱背面的开关。通过橙色滤光片观察样本，并用手机摄像头拍摄图像，手机应保持在使图像占视野80%的距离。观察完成后，关闭开关。若需后续观察，应将密封的试管避光保存，最好冷藏。无论是单重还是多重检测，RT-LAMP 产物在琼脂糖凝胶电泳中均呈现为串联体条带。以水作为样本的阴性对照样品仅显示引物自身形成的条带，其中包括使用未感染雌性蚊子提取的总核酸作为模板的非特异性靶标对照。使用5'端FAM标记的探针检测寨卡病毒时可观察到绿色荧光。基孔肯雅病毒的探针在5'端NT位置用HEX标记，呈现亮黄绿色荧光。登革病毒1型的探针在5'端NT位置用TAMRA标记，呈现橙红色荧光。将含有蚊子的两份样本直接浸入RT-LAMP反应混合物中，在65摄氏度孵育30分钟后，若存在寨卡病毒，则观察到明显的绿色荧光。使用九份体积的重悬缓冲液与一份体积的尿液样本，可在30分钟内产生可见的绿色荧光，并可通过任意手机摄像头拍摄图像。该技术开发后，为临床诊断领域的研究人员探索用于检测尿液、血液、唾液或蚊虫尸体中蚊媒病毒的即时检测平台铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分理解如何在多种生物样本中以多重方式使用等温扩增系统（本例中为LAMP）来检测寨卡病毒及其他虫媒病

multiplexed-isothermal-amplification-based-diagnostic-platform-to

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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电化学检测Shewanella oneidensis MR-1中胞外电子传递的氘动力学同位素效应

学习使用环介导等温扩增技术检测寨卡、基孔肯亚和登革热病毒的多重即时诊断平台。该方法利用靶标特异性链置换探针，可在单一反应管中实现高灵敏度、高特异性的病毒检测，适用于尿液、血液、唾液及蚊虫组织等多种生物样本，为资源有限环境下的现场诊断提供了简便、经济的解决方案。

基于多重等温扩增的诊断平台用于检测寨卡病毒、基孔肯雅病毒和登革病毒1型

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