计算机辅助大型胰岛质量，粒度分布和结构的可视化和量化

该程序的总体目标是在有限的样本中收集无偏见的代表性数据，并精确分析组织复杂的三维结构。这是通过首先捕获免疫组织、化学染色胰腺切片的虚拟切片来实现的。然后用 image J 软件中的 IHC 虚拟切片宏对虚拟切片进行量化，并使用为 Mathematica 编写的脚本分析数据。

接下来，使用 Image J 对虚拟切片进行 3D 重建，该过程的最后一步是使用幻灯片软件捕获单个胰岛图像堆栈，并使用立体检查器在三个维度上手动映射图像堆栈。最终，可以通过 3D 成像和手动映射的组合方法获得精确的孔眼结构以及每个孔眼单元的 3D 坐标。这种方法可以帮助回答肥胖和糖尿病研究领域的关键问题，例如生理条件和生理条件的路径如何影响胰腺、β 细胞质量、孔眼分布和结构。

该技术的意义延伸到肥胖和糖尿病梅利炎的诊断或治疗，因为更好地了解 β 细胞质量的变化将有助于治疗干预的开发和评估。尽管本研究中描述的方法专门提供了对胰腺动态免疫组织化学分析的见解，但也可以应用于一系列其他生物体和组织。这种方法的视觉演示至关重要，因为计算机辅助分析步骤很难学习。

因为在二维和三维中分析如此大的数据集很复杂。通过将一张干净的载玻片放在荧光显微镜的支架中，该载玻片包含免疫组织化学染色胰腺的整个切片来开始此过程。打开 stereo investigator 软件，然后单击 acquisition 来可视化样本。

然后是实时图像。使用显示荧光强度的视频直方图窗口确定每个通道的曝光水平。在此示例中，通道 2 用于 DAP P，通道 3 用于 RFP，通道 4 用于 RFP，通道 5 用于 sci 5，通道 6 用于 SCI 7。

使用相机设置窗口，调整曝光水平，使荧光强度逐渐减弱。在视频直方图的右端，可以使用显微镜聚焦轮聚焦图像。在创建虚拟切片之前，通过单击屏幕远离样品的点来绘制样品的轮廓，这将标记一个参考点。

然后在轮廓完成后单击样品的轮廓。右键单击并选择 close contour 以连接轮廓的起点和终点，通过选择采集来捕获样品的虚拟切片，然后采集虚拟切片。当虚拟切片窗口选项打开时，选择 High speed acquire 以及禁用 manual。

通过取消选中 manual 旁边的框进行对焦。保存文件。通过右键单击并选择 Add to focus site list 来校准 prefo。

在虚拟切片预览中手动聚焦多个随机部分 聚焦多个站点后，通过右键单击并选择来启动虚拟切片。使用 prefo 启动虚拟切片：在第一个样本的虚拟切片完成后，切换到下一个通道并相应地调整曝光度。对每个通道重复此过程，以执行孔眼的量化，使用名为 I-H-C-V-S 的图像 J 宏处理图像，该宏首先准备加载的图像进行分析，然后量化孔眼的特征，例如细胞组成。

I-H-C-V-S 宏将堆栈拆分为各自的颜色通道。在图像 J 中，将每个图像转换为 8 位黑白蒙版。在自动强度之后，对单独的通道图像进行阈值处理，并以算术方式将单独的通道图像一起添加到复合蒙版中。

Image J 对合成图像的内置颗粒分析将识别感兴趣区域或 ROI，同时排除小于一个 β 细胞的颗粒。ROI 的量化。使用图像 J 会生成单元格参数的电子表格。

将聚合结果保存到 Excel 电子表格中。存储每个孔眼的面积周长圆度、fer 直径和孔眼中心等数据，以及图像中标记的相应数字。这些参数的计算分析可以按照书面协议中的描述进行为了揭示包括孔眼分布和频率分析在内的信息，通过运行脚本来执行虚拟切片的 3D 重建，该脚本将目录中的所有 JP 两个图像转换为 TIF 文件，这是用于构建和量化虚拟切片的三维堆栈的格式。

此处，使用了名为 I MJ two two tiff 的脚本。将脚本复制到包含 JP 两个映像的目录中。通过在控制台中键入点斜杠 I am JP two two TIFF，然后按 Enter，使用 Linux shell 运行脚本。

当所有捕获的图像都从 JP 2 转换为 TIFF 文件后，它们就可以用于图像 J 中的分析了。使用图像 J，打开第一个样品的所有图像，在本例中来自人类胎儿胰腺，并通过选择图像、颜色、 ，然后合并频道。当所有样本都已合并为单个图像时，对每个样本重复此过程。通过使用多边形选择工具选择不需要的区域来清理图像。

通过选择 edit （编辑），然后填充 来填充它们。将每个图像转换为 RGB 彩色图像。最后，从图像中创建一个堆栈，然后它们可以进一步与 stack reg 插件对齐。

最终，合并通道并组合图像会创建整个胰腺中所有孔眼的 3D 蒙太奇。要收集图像堆栈，请将整个安装胰腺孔眼置于显微镜下。如果使用水浸物镜，请加水。

打开幻灯片簿软件，在焦点控制窗口中按 control 加 shift 加 E 来访问捕获和对焦控制。将物镜设置为 20 倍或 40 倍，具体取决于孔眼的大小。要使用显微镜目镜定位孔眼，请将 bin 设置为 2 次，并将滤光片设置为 user 1。

在焦点控制窗口中，发射选择应设置为 100%中性密度的眼睛应设置为一键 GFP ey，然后打开地板以在幻灯片簿中可视化样品，返回焦点控制窗口并将过滤器设置为固定。然后点击 G-F-P-D-S。使用纵杆使孔眼在摄像机中尽可能居中一个窗口。

聚焦到孔眼中心附近某个地方的深度，在那里可以很容易地辨别细胞。在焦点控制窗口中，选择 zab。使用范围控件滚动到孔眼的最上层深度，在其中可以清楚地辨别特征，然后单击 set top。

滚动到孔眼底部，然后单击 set（设置）。底部单击 go。要返回到捕捉窗口中的参考点，请单击 高级，然后单击 alternate to channel 模式。

将 bin factor 设置为 2 倍，将 capture type 设置为 3D，单击使用 top 和 bottom positions 并在捕获后返回到中心体积。将步长设置为 3。将过滤器集设置为 filter set 框下方的 live。

选择 DAP、E-D-S-U-G-F-P-D-S-U-R-F-P-D-S-U 和 SCI 5 DSU。对于每个选项，请单击 Adjust exposure （调整曝光度） 下的 Find best （查找最佳）。然后单击 测试 以确保所选曝光度合适。

单击 start 开始捕获。捕获完成后，根据需要调整色阶，并将 RFP 的显示颜色更改为白色。保存幻灯片并转到视图导出 TIFF 系列。

键入幻灯片的名称，并在末尾加上短划线并保存。会创建数十个单独的 TIF 文件，因此将每个孔眼图像堆栈保存在单独的文件夹中可能会有所帮助。要映射影像堆栈，请打开 stereo investigator 软件。

通过在图像缩放菜单中打开图像堆栈来可视化图像。将图像之间的距离设置为 3 微米，以校正 2 次弯曲。在幻灯片簿中，选择"覆盖 X 和 Y 缩放"，并使用指定的 x 和 Y 缩放源。

为 X 和 Y 中心输入 0.65，并通过单击缩放按钮放大图像，然后在宏窗口市场中感兴趣的 ilis 中间至少有一个单元格。使用适当的标记 β 细胞将显示为绿色。Alpha 单元格将显示为红色，delta 单元格将显示为白色。

中心的细胞，如果样品已用 DPI 染色，细胞核将显示为蓝色，使用标记物 2 标记 β 细胞。标记 5 用于标记 alpha 单元格，标记 6 用于标记 delta 单元格。标记至少一个单元格后，使用顶部菜单中的图标显示正交视图，选中 Z 过滤器和对称。

范围应设置为 15.00。从 0.0 Z 轴开始，使用鼠标滚轮滚动孔眼，并使用适当的标记标记每个单元格，每个单元格仅在其深度中心标记一次。标记完每个 Z 级别后，可以取消选中 Z filter 复选框。

这将显示所有 Z 级别中的所有标记。标记每个单元格后，将文件另存为 DAT 文件。然后转到文件导出跟踪。

将跟踪另存为 TXT 文件。最后，单击 New data file 以清除工作区，然后再尝试映射新的孔眼。从免疫组织化学染色的胰腺样品中制备虚拟切片，可以一起检查整个胰腺中的α、β和δ内分泌细胞作为胰岛胰岛素免疫组织化学染色可以用绿色看到，胰高血糖素用红色看到，生长抑素用白色看到，dap用蓝色看到。

然后，在自动阈值处理后，图像转换为 8 位掩码。此处显示的是合并合成图像。但是，使用虚拟切片的孔眼分布还可以在单独的通道中进行单独分析。

在这里，显示了每个通道的视图，以揭示 delta 细胞、β 细胞和 α 细胞。在复合掩膜上执行颗粒分析，显示每个孔眼结构编号并以蓝色突出显示。复合掩模的颗粒分析以数据表的形式输出，其中包含 Islas 面积、周长、圆度和检测到的每个孔眼的各种直径等参数，这些参数的 ID 与复合掩模上的编号标签相对应。

对这些图像的大规模分析导致产生总孔眼数量和大小分布直方图，以及 alpha、beta 和 delta 细胞区域的详细比较。孔眼映射和细胞组成和结构的数学分析可以从上传到立体研究器的人体孔眼的 3D 重建图像堆栈中揭示单个焦平面。在这里，β 细胞在绿色中，α 细胞在红色中，δ 细胞在白色中，细胞核在蓝色中。

在捕获不同的孔眼后，在不同的海洋平面上标记 α、β 和 δ 细胞，以 10 微米的间隔显示三个不同焦平面的荧光图像和相应的地图数据。一旦在各个平面上标记了 α、β 和 delta 细胞，孔眼就可以在 3D 中可视化。此处显示的是根据孔眼映射获得的坐标对四分之一切片孔眼的 3D 重建。

此外，对映射的孔眼进行自动数学分析可以显示细胞组成和结构。这里显示了单个细胞群中两个细胞之间细胞距离的相对频率。还显示了两个不同细胞群之间细胞距离的相对频率。

还显示了 alpha 到 alpha、beta 到 beta 和 delta 到 delta 单元的单元到单元距离分布的累积概率。可以对这些概率执行 cole OV smirnov 或 KS 检验，以获得相应的 KS 距离。掌握后，可以在 4 小时内完成整个组织切片的大规模成像和分析。

一块组织块的 3D 重建可以在 30 分钟内完成。最后，如果执行得当，3D 成像和手动映射可以在 4 小时内完成。在尝试此程序时，重要的是要从切片的高质量免疫组织化学染色开始。

后续分析的准确性将完全取决于原始数据。此外，请确保您的计算机至少有 8 GB 的 RAM 来处理此类大规模分析开发后。这项技术为研究人员铺平了道路，不仅在肥胖和糖尿病领域，而且在许多其他使用标准病理分析的领域也得到了广泛应用。

当样本数量有限时，它可能特别有用。观看此视频后，您应该对如何使用标准技术在有限的样本量中收集无偏的代表性数据有很好的了解。仅选择一个特定区域可能无法代表全貌，正如我们使用胰腺孔眼分布研究所显示的那样。