Name: 静电基础:优化解决方案和设备参数 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-21T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: 学习静电纺丝技术优化溶液参数和设备设置，制备用于组织工程的纳米纤维支架。该方法可调控纤维形貌与排列，促进细胞生长和迁移，适用于生物材料研究。

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本工作由美国国立卫生研究院（NIH）K08 EB003996项目和美国瘫痪退伍军人研究基金会资助项目2573支持。

1. 选择一种聚合物
<ol>
<li>根据您的需求（例如，可生物降解、热塑性或可交联）选择一种聚合物（例如聚-L-乳酸（PLLA）、聚己内酯（PCL）、聚苯乙烯（PS）或尼龙）及其相应的溶剂。根据所选材料选择适当的个人防护装备。</li>
<li>根据您的应用选择合适的基底（例如玻璃、塑料、金属或硅片）。</li>
</ol>
2. 选择采集者
<ol>
<li>根据您的具体要求选择收集器的几何形状。随机排列的纤维可收集在静止的平板上，而取向排列的纤维则可收集在快速旋转的轮盘、滚筒或金属棒上，也可收集在平行板之间。</li>
<li>收集器必须具有导电性，并且需与转轴保持绝缘，以便在接地时不会同时使邻近物体、实验台面等其他部分接地。</li>
</ol>
3. 	经验法估算临界缠结浓度1
<ol>
<li>配制几种不同浓度的候选聚合物溶液（例如，4、10、15、20、30 wt%），选择一种能够流动的浓度开始实验（溶液应为黏性液体，而非凝胶状）。</li>
<li>设置静电纺丝装置2,3,4,5（见图1）
<ol>
<li>装载注射泵，并设定泵速，使从针尖擦去的液滴能够立即被补充。</li>
<li>将收集器接地，并将高压导线夹在导电板上（导电材料的小方片，如铝箔，针头从中穿过）。</li>
<li>启动转轮旋转。</li>
<li>在打开电源前，确保电源输出电压设定为零。</li>
</ol>
</li>
<li>观察射流
<ol>
<li>缓慢升高电压，同时观察针尖处溶液液滴的变化。</li>
<li>调节电压以获得一条长而稳定的射流。若无法获得稳定射流，可调整聚合物溶液的浓度。参见表1中的示例。</li>
</ol>
</li>
</ol>
4. 故障排除 - 气流：
<ol>
<li>难以观察到液流
<ol>
<li>使用深色哑光背景，并将单向光源（如手电筒）放置在观察者与液流之间（见图2）。</li>
</ol>
</li>
<li>从注射器尖端滴落
<ol>
<li>如果聚合物溶液直接向下滴落，未被转轮吸引，请确保导电板与针尖接触良好，且收集器已接地。</li>
<li>如果注射器尖端的聚合物溶液液滴朝向转轮倾斜但未形成连续液流，可提高电压。通过调节距离和电压，可优化液流质量，直至出现稳定的液流。针对4% PLLA溶液和8×8 cm导电板，建议的距离与对应电压参见图3。</li>
</ol>
</li>
<li>注射器尖端出现大块凝结物
<ol>
<li>当聚合物溶液在针尖处积聚并硬化时，使用固定在非导电棒上的纸巾轻轻擦拭去除凝结物。</li>
</ol>
</li>
<li>液流振荡或“摆动”
 
当液流快速上下摆动时，应降低电压或增加注射器尖端与转轮之间的距离。若液流仍持续摆动，可尝试使用更高浓度的聚合物溶液，或添加少量蒸发较慢的溶剂。</li>
<li>液流过短或不连续
 
在转轮高速旋转条件下，能够清晰观察到稳定液流并与转轮充分接触时，所得纤维的均匀性和取向性最佳。当液流较短且不连续时，可通过增加聚合物溶液浓度、添加更多低挥发性溶剂以及调节电压来改善液流的长度和稳定性。</li>
</ol>
5. 故障排除——纤维形态6,7,8（参见图4）
<ol>
<li>珠状结构 
当纤维中出现珠状结构时，应增加聚合物溶液的浓度，并确保导电板与针头持续接触，同时接地的金属丝刷与滚轮保持持续接触。</li>
<li>带状结构与纤维融合 
当纤维呈现带状或发生融合时，应使用更高浓度的聚合物，或采用蒸发速率更高（更易挥发）的溶剂。</li>
<li>卷曲或波浪状纤维 
当纤维出现波浪或卷曲形态时，应提高滚轮转速，或将针尖与收集器之间的距离增大。同时，检查导电板和收集器是否发生振动。</li>
<li>孔隙率9 
若需要形成孔隙结构，应使用易快速挥发的溶剂；若不希望产生孔隙，可尝试添加少量比主溶剂挥发性更低的共溶剂。</li>
<li>取向性10 
当收集器转速较低或静止时，纤维的取向性较差。可通过提高滚轮转速来改善纤维的排列取向。</li>
</ol>
6. 代表性结果：
请参见图4以查看典型纤维结果的示意图。
<img src="/files/ftp_upload/2494/2494fig1.jpg" alt="静电纺丝示意图、射流的流动与鞭动机制、纤维制备装置。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 典型的静电纺丝装置。聚合物溶液（蓝色）由注射泵（橙色）推出。高压直流电源（绿色）将快速旋转的滚轮收集器（灰色）接地，用于收集取向纳米纤维。在注射器与收集器之间的聚合物射流包含一个稳定的流动段和一个快速振荡的鞭动段。
<img src="/files/ftp_upload/2494/2494fig2.jpg" alt="激光衍射实验装置；光束通过狭缝用于研究波的干涉；光学原理。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 可观察到射流从注射器尖端喷出；而缠绕射流过小，无法看见。
估算聚左旋乳酸（PLLA）的临界缠结浓度
<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>PLLA（% wt/v）</td>
 <td>观察现象</td>
 <td>浓度调整</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.5</td>
 <td>滴落；无连续流</td>
 <td>增加</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2.0</td>
 <td>喷出小液滴；无连续流</td>
 <td>略微增加</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4.0</td>
 <td>稳定连续流</td>
 <td>良好</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6.0</td>
 <td>喷出大液滴或珠状物</td>
 <td>略微降低</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>12.0</td>
 <td>尖端结块；无连续流</td>
 <td>降低</td>
 </tr>
</tbody>
</table>
表1. 展示聚左旋乳酸（PLLA）临界缠结浓度近似测定的一个示例。尝试多种聚合物浓度，并观察产生的射流情况，直至获得稳定的射流。
<img src="/files/ftp_upload/2494/2494fig3.jpg" alt="电压与距离关系图；静电放电分析显示射流稳定区域。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 注射器尖端与收集器之间的距离必须与施加的电压相平衡，以获得稳定的射流。过高的电压会导致射流发生振荡或“摆动”，从而产生取向较差的纤维。当电压过低时，无法形成射流，溶液仅从注射器尖端滴落。图中上方的紫色阴影区域表示在不同注射器至收集器距离下，聚左旋乳酸（PLLA）能够形成稳定射流的电压范围。
<img src="/files/ftp_upload/2494/2494fig4.jpg" alt="电纺纳米纤维的扫描电镜图像，展示用于材料分析的纤维形貌。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 
图4. 电纺纤维可呈现多种形貌，包括串珠状结构（A）、带状结构（B）、卷曲结构（C）、多孔团块（D）、良好取向（E）和取向不良（F）。

<ol><li>Shenoy, S. L., Bates, W. D., Frisch, H. L., Wnek, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+chain+entanglements+on+fiber+formation+during+electrospinning+of+polymer+solutions%3A+good+solvent%2C+non-specific+polymer-polymer+interaction+limit%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer%22%5BJournal%5D)">Role of chain entanglements on fiber formation during electrospinning of polymer solutions: good solvent, non-specific polymer-polymer interaction limit.</a> Polymer. 46, 3372-3384 (2005).</li>
<li>Gertz, C. C., Leach, M. K., Birrel, L. K., Martin, D. C., Feldman, E. L., Corey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+neuritogenesis+and+maturation+of+primary+spinal+motor+neurons+in+response+to+nanofibers%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Accelerated neuritogenesis and maturation of primary spinal motor neurons in response to nanofibers.</a> Dev. Neurobiol. 70, 589-603 (2010).</li>
<li>Lin, D. Y., Johnson, M. A., Vohden, R. A., Chen, D., Martin, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailored+nanofiber+morphologies+using+modulated+electrospinning+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Mat.+Res.+Soc.+Symp.+Proc%22%5BJournal%5D)">Tailored nanofiber morphologies using modulated electrospinning for biomedical applications.</a> Mat. Res. Soc. Symp. Proc. 736, D3.8.1-D3.8.6 (2003).</li>
<li>Corey, J. M., Gertz, C. C., Wang, B. S., Birrell, L. K., Johnson, S. L., Martin, D. C., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+design+of+electrospun+PLLA+nanofiber+scaffolds+compatible+with+serum-free+growth+of+primary+motor+and+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Biomater%22%5BJournal%5D)">The design of electrospun PLLA nanofiber scaffolds compatible with serum-free growth of primary motor and sensory neurons.</a> Acta. Biomater. 4, 863-875 (2008).</li>
<li>Corey, J. M., Lin, D. Y., Mycek, K. B., Chen, Q., Samuel, S., Feldman, E. L., Martin, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aligned+electrospun+nanofibers+specify+the+direction+of+dorsal+root+ganglia+neurite+growth%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Aligned electrospun nanofibers specify the direction of dorsal root ganglia neurite growth.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 83, 636-645 (2007).</li>
<li>Tan, S. -H., Kotaki, M., Ramakrishna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+parameter+study+for+ultra-fine+fiber+fabrication+via+electrospinning+process%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer%22%5BJournal%5D)">Systematic parameter study for ultra-fine fiber fabrication via electrospinning process.</a> Polymer. 46, 6128-6134 (2005).</li>
<li>Yang, F., Murugan, R., Wang, S., Ramakrishna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospinning+of+nano%2Fmicro+scale+poly%28L-lactic+acid%29+aligned+fibers+and+their+potential+in+neural+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Electrospinning of nano/micro scale poly(L-lactic acid) aligned fibers and their potential in neural tissue engineering.</a> Biomaterials. 26, 2603-2610 (2005).</li>
<li>Li, W., Laurencin, C. T., Caterson, E. J., Tuan, R. S., Ko, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+nanofibrous+structure%3A+A+novel+scaffold+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Electrospun nanofibrous structure: A novel scaffold for tissue engineering.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 60, 613-621 (2002).</li>
<li>Kim, C. H., Jung, Y. H., Kim, H. Y., Lee, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+collector+temperature+on+the+porous+structure+of+electrospun+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol.+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of collector temperature on the porous structure of electrospun fibers.</a> Macromol. Res. 14, 59-65 (2006).</li>
<li>Wang, H. B., Mullins, M. E., Cregg, J. M., Hurtado, A., Oudega, M., Trombley, M. T., Gilbert, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+highly+aligned+electrospun+poly-L-lactic+acid+fibers+for+nerve+regeneration+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">Creation of highly aligned electrospun poly-L-lactic acid fibers for nerve regeneration applications.</a> J. Neural Eng. 6, (2009).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

注意： 此处介绍的大多数示例均涉及聚左旋乳酸（PLLA）纳米纤维的静电纺丝。这仅仅是因为PLLA是本实验室中最常使用的聚合物。然而，我们还成功地将这些方法应用于其他聚合物（例如PLGA、PCL、PS）的静电纺丝，并认为本文所介绍的技术可广泛适用于大多数中高分子量聚合物溶液。

<table><tbody><tr><td>高压直流电源</td><td>Gamma High Voltage</td><td>ES40P-5W</td><td></td></tr><tr><td>注射泵</td><td>KD Scientific</td><td>KDS100</td><td></td></tr><tr><td>铝箔</td><td>Reynolds Wrap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>钝头金属针头，23号</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-850-102</td><td></td></tr><tr><td>聚丙烯注射器</td><td>BD Biosciences</td><td>309585</td><td></td></tr><tr><td>旋转或固定收集器</td><td>定制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>各种鳄鱼夹和导线</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>二甲基甲酰胺</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC11622-0010</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC42355-0040</td><td></td></tr><tr><td>PLLA</td><td>Boehringer Ingeheim</td><td>Resomer L210</td><td></td></tr><tr><td>PLGA 85:15</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43471</td><td></td></tr><tr><td>导电碳胶带</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>13073-1</td><td></td></tr></tbody></table>

静电纺丝基础：优化溶液与装置参数

Electrospinning Fundamentals: Optimizing Solution and Apparatus Parameters

电纺纳米纤维支架已被证明可加速细胞成熟、促进细胞生长并引导细胞迁移 体外静电纺丝是一种将带电聚合物射流收集在接地收集器上的过程；当收集器快速旋转时，可获得取向排列的纳米纤维，而静止的收集器则产生随机取向的纤维膜。聚合物射流的形成是由于施加的静电荷克服了溶液的表面张力。对于特定聚合物而言，存在一个最低浓度，称为临界缠结浓度，低于该浓度无法形成稳定的射流，因而无法生成纳米纤维——尽管可能形成纳米颗粒（电喷雾）。稳定的射流包含两个区域：一段为流动段，另一段为鞭动段。鞭动段通常肉眼不可见，而流动段在适当的光照条件下通常可见。观察该射流的长度、粗细、均匀性及其运动状态，有助于预测所形成纳米纤维的取向性与形貌。短小、不均匀、不稳定或振荡的射流通常提示存在多种问题，包括纤维取向不良、串珠结构、飞溅以及卷曲或波浪状结构。通过调整溶液组成和静电纺丝装置的配置，可优化射流状态，从而改善所产纤维的取向性与形貌。在本实验方案中，我们介绍了一种搭建基本静电纺丝装置的操作流程，经验性估算聚合物溶液临界缠结浓度的方法，以及优化静电纺丝过程的步骤。此外，我们还讨论了一些常见问题及其解决策略。

静电纺丝技术可用于制备多种组织工程或其他应用领域的纳米纤维支架。本文介绍了一种优化静电纺丝溶液和设备参数的实验步骤，以获得具有理想形貌和取向的纤维。同时提供了常见问题及相应的解决方法。

电纺纳米纤维支架已被证明可加速细胞在体外的成熟，促进细胞生长，并引导细胞迁移。

本实验演示了用于体外和体内细胞支持的细胞外结构的纳米纤维支架的静电纺丝制备。首先选择适合目标类型纳米纤维的聚合物溶剂和收集器几何构型。该过程最关键的步骤是确定临界缠结浓度，只有超过该浓度才可能形成纤维。接下来是调整系统以调控纤维的直径、密度和取向排列。理想的电子显微镜图像可显示能够制备的不同类型纤维。这些静电纺丝纳米纤维支架已被证实可加速细胞成熟、促进细胞生长，并在体外有效引导细胞迁移。通常，初次接触该方法的人会遇到困难，因为静电纺丝是一个较为敏感的过程。该方法的可视化演示至关重要，因为若无静电纺丝的先前经验，将难以理解装置优化的各个步骤。在为静电纺丝选择聚合物和溶剂时，应结合最终应用考虑材料的生物降解性、热塑性以及交联能力等特性。然后根据您的选择确定所需的适当个人防护装备。接下来，选择用于收集纳米纤维的基底，例如玻璃、塑料、金属或硅片。现在选择收集器的几何构型。随机取向的纤维被收集在静止的平板上。而取向排列的纤维则可通过高速旋转的轮盘、滚筒、金属棒或平行板进行收集，需确保收集器具有导电性，并以适当方式保持绝缘，以便接地时不会同时使邻近物体接地。对于旋转式收集器，轮盘应与其轴绝缘。为了经验性地估算临界缠结浓度，首先从这些候选聚合物浓度中制备若干种不同浓度的溶液，然后选择其中能够流动的浓度。该溶液应为黏性液体，但不能形成凝胶。现在设置静电纺丝装置。应将注射器放置在距离收集器20厘米的位置，开始将选定的溶液装入注射泵，并设置泵速，使从针尖擦拭掉的液滴能够立即被补充。将收集器接地，并将高压线夹在导电板上。启动轮子旋转前，确保电源设置为零，在缓慢升高电压的同时，观察针尖处溶液的液滴状态，并注意观察射流情况。继续调节电压以获得一条细长且稳定的射流。如果无法获得稳定射流，应首先调整聚合物溶液的浓度。若射流难以观察，可使用深色哑光背景，并在观察者与射流之间放置一个单向光源。有时，聚合物溶液会直接从注射器针尖垂直滴落，而不向滚轮方向移动。此时，应确认导电板是否与针尖接触，且收集器是否已接地。若注射器针尖处的聚合物溶液已向滚轮方向倾斜但仍未形成射流，则应提高电压。通过调节距离和电压，直至观察到稳定的射流。当针头尖端形成较大的聚合物团块时，使用固定在非导电棒上的纸巾将其擦拭去除。若射流出现振荡或摆动现象，可通过降低电压或增加针头尖端与收集滚轮之间的距离来校正。如果射流持续摆动，可使用更高浓度的聚合物，或向溶液中添加少量蒸发速度较慢的溶剂。可见现象：当稳定射流与以高转速设置的滚轮实现可观察的接触时，可获得最佳的均匀性和取向性，从而改善过短且不连续射流的长度和稳定性。增加聚合物溶液的浓度。添加更多慢挥发性溶剂，或调整电压。有时在静止平板上收集随机纤维时，纤维会在空气中开始形成片状或纱线状结构，这表明电压设置过高。当在纤维中发现珠状结构时，应增加聚合物溶液的量，并确保导电板与针头保持持续接触，同时接地的金属丝刷与转轮保持持续接触。此外，应尽量形成稳定的射流。射流不稳定或呈喷溅状通常表明形成了珠状纤维。若纤维形成带状或相互融合，可使用更高浓度的聚合物或蒸发速率更快的溶剂，以纠正形成波浪状或卷曲状的纤维。提高转轮速度，或将针尖移至距离收集器更远的位置。同时，检查导电板和收集器是否发生振动。有时需要形成孔隙，此时可使用易挥发的溶剂。但如果不需要形成孔隙，可尝试加入少量比主溶剂挥发性更低的共溶剂。当收集器以低转速或静止状态运行时，纤维的取向质量较差。通过提高转轮速度来增强排列。电纺纳米纤维在多种细胞类型的培养和研究中具有显著效果。例如，原代大鼠神经元可用β微管蛋白抗体染色，并用核复染剂dpi进行细胞核染色。重要的是，在纺丝溶液中加入硫黄素等染料后，纤维在制备完成后也可被可视化。该技术使生物材料和细胞生物学领域的研究人员能够探索细胞与多种纳米级形貌特征及几何结构之间的相互作用。请注意，使用高电压可能具有极高危险性，在执行此操作时，必须始终采取预防措施，将操作人员与设备隔离。

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