适应静电过程中提供三个独特的环境为一个三层次在体外的气道壁模型

该程序的总体目标是电旋转三维相位支架，允许共培养完全分化的成人细胞，以复制这些细胞在 C 2 中遇到的天然细胞外基质。这是通过首先静电纺丝（随机排列的超细纤维支架）来实现的。第二步是通过将随机排列的纳米纤维层直接电纺到超细纤维支架上来形成双相支架。

接下来，将单独的对齐纳米纤维支架进行静电纺丝。最后一步是用各自的细胞类型接种每个支架，并在 profused 生物反应器系统中将支架作为单个构建体共培养。最终，可以通过测量介质释放和免疫染色来分析多细胞相互作用。

构造体。与 2D 转化膜等现有方法相比，该技术的主要优点是电支架提供了一个 3D 纤维环境，可以适应提供生理相关的形态。它是一种多孔的结构，允许多种细胞类型的核心培养。

该方法使用队列、患病或健康的人类细胞作为体外模型提供了一个稳定的平台。这将有助于减少我们对动物模型的依赖，因为动物模型与人类疾病的相关性有限，并减少实验中使用的动物数量。虽然这种方法可以提供对哮喘和 COPD 等疾病的见解，但它也可以应用于其他系统，例如研究肠道炎症性疾病，或开发用于化学测试的皮肤模型。

首先，通过将 8%、10% 和 30% PET 溶解成氯甲烷和三氯乙酸的一对一混合物，制备三种不同的 10 毫升 PET 溶液。在室温下搅拌溶液过夜，第二天溶解 PET。将 PET 溶液转移到注射器中，将 23 号针头连接到含有 8% 混合物的注射器上，将 18 号针头连接到另外两个含有 10% 和 30%PET 溶液的注射器上。

准备超细纤维支架。首先，将含有 30%PET 溶液的注射器装入注射泵中，针尖位于底部。将针头放置在距离针尖 15 厘米的位置，并确保针指向滚筒的中心。

使用金属鳄鱼夹将正极电源线连接到针尖，并通过将接地线连接到香蕉插座将 manl 接地。打开电机并将转速设置为 60 RPM。打开注射泵，提供每小时 2.0 毫升的流速。

在创建超细纤维支架时。让泵运行，直到溶液从针尖挤出，以便通过去除针头中的任何空气来灌注系统。然后停止注射泵上的泵。

将要排出的溶液总体积设置为 2 毫升，然后启动泵。接下来，在针头和心轴电旋之间施加 14 千伏的电位 1 小时，直到 2 毫升 30% PET 溶液电旋，超细纤维支架仍在心轴上，关闭电压电位。取下鳄鱼夹，将含有 30% PET 溶液的注射器更换为含有 8%PET 溶液的注射器。

然后将鳄鱼夹重新连接到 23 号针头上。将注射泵的流速更改为每小时 0.5 毫升，然后运行注射泵灌注针头，直到溶液从尖端流出。在心轴继续以 60 RPM 的速度旋转的情况下，在针尖和心轴之间施加 14 千伏的电位，并将注射泵挤出的总体积设置为 2 毫升。

电旋 4 小时，直到电旋出 2 毫升 8% PET 溶液。静电纺丝完成后，关闭电源和电机旋转心轴。用刀片沿心轴的宽度切割双相支架，以产生心轴表面积大小的 2D 支架片。

要制备对齐的 PET 支架，请将含有 10% PET 溶液的注射器装入注射泵中，针尖位于底部。然后将鳄鱼夹连接到针头上。将流速设置为每小时 0.5 毫升，并用 PET 溶液灌注针头。

然后打开电机并将心轴旋转速度设置为 2000 RPM。接下来，打开注射泵。将电源电压设置为 14 千伏，并打开电源电旋 4 小时，直到电旋出 2 毫升溶液。

静电纺丝完成后，关闭电源和电机。用刀片沿心轴的宽度切割脚手架，以产生对齐的 2D 脚手架片。将电纺脚手架存放在铝箔中以减少静电荷。

使用直径为 0.8 毫米的活检笔从 SPU 片上打出双相或对齐支架的椎间盘。然后使用无毒的水族箱胶将双相脚手架盘粘在垫圈上。将垫圈和支架放入 12 孔组织培养板中。

使用紫外线 I 辐射对支架的每一侧的垫圈和支架消毒 30 分钟。然后在第二天在 4 摄氏度的 20% 抗生素抗真菌溶液中浸泡过夜。用 PP S3 清洗脚手架 3 次，并将脚手架储存在 4 摄氏度的 PBS 中直至使用。

将双相支架从 PBS 转移到新的 12 孔板中，并在补充有 10% FCS 的 DMEM 培养基中在 37 摄氏度下加热 1 小时。去除补充 DMEM 的培养基，将支架的微纤维相 aply 接种 15， 000 MRC 5 个成纤维细胞，在 30 微升 DMEM 补充培养基中，放在每个支架上，以帮助成纤维细胞渗透到支架中。将板放在轨道摇床上，以 100 RPM 的转速搅拌支架两小时。

然后向每个支架中加入 2 毫升补充 DMEM 的培养基，并在 37 摄氏度下用 5% 二氧化碳孵育支架过夜。第二天，从孔中取出培养基，将支架翻转过来，使支架的纳米纤维相面向顶端。然后将 30， 000 个 Cali 三个上皮细胞接种在 30 微升补充有 10% FCS 的 D-M-E-M-F 12 培养基中，接种到支架的纳米纤维相上。

将支架在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 2 小时，然后将支架浸入 70 30 的 D-M-E-M-F 12 和 DMEM 补充培养基混合物中，并继续再静态孵育 12 小时以培养气道。首先，将对齐的支架从 PBS 转移到新的 12 孔板中，并在 37 摄氏度下加热它们和补充有 DMEM 的培养基一小时。去除补充 DMEM 的培养基，将 25， 000 个气道平滑肌细胞加入 30 微升补充 DMEM 的培养基中，并将它们在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 2 小时。

连接后，将支架浸入补充 DMEM 的培养基中。将它们放回培养箱中并放置过夜，然后在生物反应器中设置三重培养物。第二天，将双相种子支架放入生物反应器腔室中，上皮相朝上进入腔室。

然后将对齐的支架放在双相支架下方，使其与双相支架的超细纤维相相邻。将生物反应器的两个腔室锁定在一起。然后按照随附文本方案中的说明在培养箱内组装两个灌注流路，并在一周后使用蠕动泵以大约 0.1 毫升/分钟的速度将培养基泵送到两个回路周围。

从顶腔中取出培养基并培养。在生物反应器中放置两周后，在气液界面上再分析一周后，将此处显示的三培养支架固定并切片，以显示分布在构建细胞核所有三层中的细胞核用 DPI 染色，并在支架材料显示为灰色的地方呈现蓝色。以下是电旋纳米纤维超细纤维和对齐支架的扫描电子显微镜图像，它们分别用于接种上皮细胞、成纤维细胞和平滑肌细胞。

在两周内，所有三种细胞类型在其各自的支架上培养时均显示出活力增加。在两周的培养期后，它们也各自继续表达细胞类型特异性蛋白。在尝试此过程时，重要的是要记住研究您试图用电纤维重建的天然细胞外基质。

A 单元在连接到不同的 3D 形貌时，其行为会有所不同。例如，上皮细胞只有在纳米纤维上培养时才会形成功能屏障。看完这个视频，你应该对如何构建多层共培养系统有一个很好的了解，该系统可用于研究动态培养环境中的细胞间相互作用。

不要忘记，在执行此程序时，定制静电纺丝参数（例如流速和电压）以适应您打算使用的聚合物和溶剂系统非常重要。这对于产生所需的纤维至关重要。此外，请记住旋转通风罩或橱柜，以便正确提取溶剂。