通过调整静电纺丝工艺为三层结构提供三种独特环境 体外 气道壁模型

本实验的总体目标是通过电纺丝技术制备一种三维相分离支架，以实现完全分化的成人人类细胞的共培养，从而模拟这些细胞在C2中所接触的天然细胞外基质。该目标首先通过电纺丝制备随机取向的微纤维支架来实现；第二步是在微纤维支架上直接电纺一层随机取向的纳米纤维，从而形成双相支架。

接下来，制备一种独立的取向排列纳米纤维支架，通过静电纺丝形成。最后一步是将每种支架分别接种相应的细胞类型，并在灌注式生物反应器系统中作为单一整体进行共培养。最终，可通过检测介质释放和免疫染色来分析多细胞间的相互作用。

该构建体。与现有的二维转化膜等方法相比，该技术的主要优势在于电纺支架可提供一种三维纤维环境，能够被调整以形成符合生理相关性的形态结构。其结构更具多孔性，并允许多种细胞类型的共培养。

该方法利用同源的、患病的或健康的原代人类细胞作为体外模型，提供了一个稳定的实验平台。这将有助于减少对动物模型的依赖，因为动物模型在模拟人类疾病方面存在局限性，同时也能减少实验中所使用的动物数量。尽管该方法可用于研究哮喘和慢性阻塞性肺疾病（COPD）等疾病，也可拓展应用于其他系统，例如用于肠道炎症性疾病的研究，或用于构建皮肤模型以进行化学物质测试。

首先，制备三种不同的10毫升PET溶液，将8%、10%和30%的PET分别溶解于氯甲烷与三氯乙酸的1:1混合液中。室温下搅拌溶液过夜，以确保次日PET完全溶解。将PET溶液转移至注射器中，并在装有8%溶液的注射器上连接23号针头，另两个装有10%和30%PET溶液的注射器则连接18号针头。

制备微纤维支架。首先，将装有30% PET溶液的注射器装入注射泵，使针尖朝下。将金属鼓置于距针尖15厘米处，并确保针尖对准金属鼓的中心。

使用金属鳄鱼夹将正极电源线连接到针尖，并通过将接地线连接到香蕉插座来接地纺丝装置。打开电机，将纺丝装置转速设置为 60 RPM。开启注射泵，设定流速为 2.0 毫升每小时。

制备微纤维支架时，启动泵直至溶液从针尖挤出，以排出针头内的空气，完成系统的预填充。随后停止注射泵的运行。

将待推出溶液的总体积设定为两毫升，并启动泵。接着，在针头与芯轴之间施加14千伏的电压，电纺一小时，直至30% PET溶液的两毫升完全电纺完毕，此时微纤维支架仍留在芯轴上，随后关闭电压。取下鳄鱼夹，将装有30% PET溶液的注射器更换为装有8% PET溶液的注射器。

然后将鳄鱼夹重新连接到23号针头上。将注射泵的流速调整为0.5毫升/小时，并启动注射泵，使溶液从针尖流出，以对针头进行预冲洗。在芯轴继续以60转/分钟旋转的同时，在针尖与芯轴之间施加14千伏的电压，并将注射泵需挤出的总体积设定为2毫升。

电纺四小时，直至8% PET溶液中有两毫升完成电纺。电纺结束后，关闭电源和带动心轴旋转的电机。沿心轴宽度方向用刀片切割双相支架，得到一片尺寸与心轴表面积相同的二维支架片。

为制备取向的PET支架，将装有10% PET溶液的注射器装入注射泵，针尖朝下。然后将鳄鱼夹连接到针头上。设定流速为0.5毫升每小时，并用PET溶液预润针头。

然后启动电机，将心轴转速设置为 2000 RPM。接着打开注射泵，将电压源调至 14 千伏，并开启电源，进行四小时的静电纺丝，直至两毫升溶液完成静电纺丝。

静电纺丝完成后，关闭电源和电机。沿 mandrel 的宽度方向用刀片将支架切割，以获得排列整齐的二维支架片。将静电纺丝支架存放在铝箔中，以减少静电荷。

使用直径为0.8毫米的活检打孔笔从SPU片材中切取双相或定向支架的圆片。然后使用无毒水族胶将双相支架圆片粘附到垫圈上。将垫圈和支架放入12孔组织培养板中。

将支架两侧分别用紫外线I照射30分钟，对垫圈和支架进行灭菌。然后于4°C条件下在20%抗生素-抗真菌溶液中浸泡过夜。次日用PPS洗涤支架3次，并将支架置于4°C的PBS中保存，直至使用。

将双相支架从 PBS 中转移至新的 12 孔板中，加入含 10% FCS 的 DMEM 培养基，在 37 摄氏度下预热一小时。移除补充了成分的 DMEM 培养基，将支架的微纤维相朝上，每孔支架上接种 15,000 个 MRC-5 成纤维细胞，接种体积为 30 微升含补充成分的 DMEM 培养基，以促进成纤维细胞渗入支架。将培养板置于摇床上，以 100 RPM 的转速振荡支架两小时。

然后向每个支架中加入2 mL添加了补充成分的DMEM培养基，并在37°C、5%二氧化碳条件下将支架孵育过夜。次日，移除孔中的培养基，将支架翻转，使支架的纳米纤维层朝上。随后，在30 µL含有10% FCS的D-M-E-M-F12培养基中加入30,000个Cali-3上皮细胞，并接种至支架的纳米纤维层表面。

将支架在37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育2小时，然后将支架浸入由70% DMEM/F12和30% DMEM补充培养基组成的混合培养基中，继续静态孵育12小时，以培养气道平滑肌细胞。首先，将排列好的支架从磷酸盐缓冲液（PBS）转移至新的12孔板中，并在37摄氏度下预热支架和DMEM补充培养基1小时。吸除DMEM补充培养基，向每个支架中加入含25,000个气道平滑肌细胞的30微升DMEM补充培养基，于37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育2小时。

固定后，将支架浸入添加了补充物的DMEM培养基中。将其放回培养箱，静置过夜，然后在生物反应器中建立三重共培养体系。次日，将双相接种支架放入生物反应器腔室中，使上皮相朝上面对腔室。

然后将对齐的支架放置在双相支架下方，使其与双相支架的微纤维相部分相邻。将生物反应器的两个腔室锁紧固定。随后，按照随附的文字方案在培养箱内组装两个灌注流路，并在一周后使用蠕动泵以大约 0.1 毫升每分钟的流速在两个回路中循环培养基。

从顶端腔室中移除培养基并进行培养。在生物反应器中培养两周后，再于气液界面继续培养上皮细胞一周，随后进行分析。此处所示的三重共培养支架经固定并切片，以显示细胞核在整个构建体所有三层中的分布情况；细胞核经DPI染色后呈蓝色，支架材料则呈灰色。以下是用于接种上皮细胞、成纤维细胞和平滑肌细胞的电纺纳米纤维、微米纤维及定向排列支架的扫描电子显微镜图像。

三种细胞类型在各自支架上培养两周后，均表现出活力的增加。在两周的培养期后，它们也继续表达特定细胞类型的蛋白质。在尝试该操作时，重要的是要记住，需对拟通过电纺纤维重建的天然细胞外基质进行充分研究。

细胞在附着于不同的三维形貌时会表现出不同的行为。例如，上皮细胞只有在纳米纤维上培养时才能形成功能性屏障。观看本视频后，您应能够充分理解如何构建一种多层共培养系统，该系统可用于动态培养环境中细胞间相互作用的研究。

请务必注意，在执行此操作时，需要根据所使用的聚合物和溶剂体系调整静电纺丝参数，例如流速和电压。这对于获得理想的纤维至关重要。此外，请记住在通风橱或通风柜中进行静电纺丝，以确保溶剂能够被有效排出。