Name: 适应静电过程中提供三个独特的环境为一个三层次在体外的气道壁模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: 了解利用静电纺丝技术构建三维多层气道壁模型的方法。该技术通过微纤维和纳米纤维支架实现成人分化细胞的共培养，为哮喘和慢性阻塞性肺疾病等呼吸系统疾病研究提供稳定的体外实验平台。

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获得这些AirPROM结果的研究已根据资助协议&#160;n° 270194收到来自欧洲联盟的资金支持。本工作还获得了英国国家研究用动物替代、优化与减少中心（NC3Rs）以及工程与物理科学研究委员会（EPSRC）再生医学博士培训中心（DTC）的资助。

非哮喘个体的原代气道平滑肌细胞（ASM细胞）取自英国莱斯特格伦菲尔德医院（Glenfield Hospital）的支气管活检组织，分离方法如前所述。本研究经莱斯特郡伦理委员会批准，患者均签署了书面知情同意书。
1. 静电纺丝制备PET支架（图2）
<ol>
	<li>配制10 ml饮料瓶级PET溶液，溶剂为二氯甲烷（DCMro）与三氟乙酸（TFA）按1:1体积比组成的混合溶液。PET的质量/体积浓度分别为8%、30%和10% （质量/体积） 分别需要用于纳米纤维、微纤维和取向支架的材料，然后在室温下搅拌溶液过夜，以使PET溶解。</li>
	<li>将PET溶液转移至注射器中，为注射器安装23号针头（用于纳米纤维）或18号针头（用于微米纤维和取向纤维），并将注射器置于电动注射泵中。确保针头尖端朝向下方。</li>
	<li>将心轴置于距针尖15 cm处，确保针尖对准鼓的中心。</li>
	<li>使用鳄鱼夹将电源连接到针尖，并将芯轴接地（通过 香蕉插孔）接地。打开芯轴电源，将转速设为 60 rpm（相当于约 13.2 m·min⁻¹）-1）用于纳米纤维和微纤维支架。将转速设为 2,000 rpm（相当于约 440 m·min⁻¹）。-1用于比对支架序列。</li>
	<li>将注射泵的流速设置为 0.5 ml·hr-1 用于纳米纤维随机和定向支架或 2.0 ml·hr-1 用于微纤维支架。启动泵，直至针尖处有溶液挤出，以排出针内任何空气。然后停止泵。</li>
	<li>在注射泵上，将需推出溶液的总体积设为 2 ml&#160;启动泵。</li>
	<li>将电压源设置为 14 kV，然后打开电源。</li>
	<li>电纺直至剩余 2 ml&#160;溶液已进行电纺丝（4 小时&#160;用于纳米纤维和定向支架，1小时&#160;用于微纤维支架）。</li>
	<li>用刀片沿 mandrel 的宽度方向切割支架，得到一块与 mandrel 表面积相同尺寸的二维支架片（本例中为 22 cm × 11 cm 的矩形片），可小心地从 mandrel 上剥离。将支架用铝箔包裹储存，以减少静电荷。 
	注：双相支架通过依次进行静电纺丝，将纳米纤维支架直接纺至微米纤维支架上而制成。</li>
</ol>
2. 细胞培养中使用前支架的灭菌
<ol>
	<li>从支架片上使用直径为0.8 mm的活检打孔笔冲切出双相或取向支架的圆片，并用无毒水族胶将其粘附于垫圈上。</li>
	<li>使用紫外线照射对支架进行30分钟的灭菌处理&#160;在将支架浸泡于20%溶液之前，分别在支架的两侧 体积比体积 抗生素/抗真菌溶液（2x10）5 毫升（ml）-1 青霉素G，2,000 mg/ml-1 硫酸链霉素和 500 µg ml-1 两性霉素B）在4°C下过夜处理。</li>
	<li>用 PBS 清洗支架 3 次，然后将支架置于含 PBS 的 TCP 孔板中，于 4 °C 保存备用。</li>
</ol>
3. 细胞培养基成分
<ol>
	<li>在添加了10%胎牛血清的DMEM-F12培养基中培养CALU3上皮细胞 体积比体积 胎牛血清（FCS），2 nM L-谷氨酰胺溶液，1% 体积比体积 抗生素/抗真菌溶液（10,000 单位 ml-1 青霉素G，100 mg/ml-1 硫酸链霉素和 25 µg/ml-1 两性霉素B</li>
	<li>在补充有10%胎牛血清的DMEM培养基中培养MRC5成纤维细胞和ASM细胞 体积比体积 胎牛血清（FCS），2 nM L-谷氨酰胺溶液，1% 体积比体积 抗生素/抗真菌溶液（10,000 单位 ml-1 青霉素 G，100 mg/ml-1 硫酸链霉素和 25 µg/ml-1 两性霉素B</li>
	<li>在70:30的DMEM-F12:DMEM培养基混合液中培养上皮细胞-成纤维细胞-ASM细胞共培养体系。</li>
</ol>
4. 将成纤维细胞和上皮细胞接种到双相支架上
<ol>
	<li>在组织培养板中，将支架浸入含DMEM补充剂的培养基中，于37 °C孵育1小时&#160;，然后接种细胞。</li>
	<li>移除含DMEM补充剂的培养基，将支架的微纤维层朝上放置，在30 µl&#160;含DMEM补充剂的培养基中接种1.5 × 104个MRC5成纤维细胞。在37 °C、5% CO2的空气环境中，先于旋转摇床上振荡2小时，随后放入培养箱中过夜培养。</li>
	<li>将支架翻转，使纳米纤维层朝上，在30 µl&#160;含DMEM–F12补充剂的培养基中向支架的纳米纤维层接种3.0 × 104个CALU3上皮细胞，于37 °C、5% CO2的空气环境中孵育2小时&#160;，然后将支架浸入70:30 DMEM-F12:DMEM补充剂培养基中过夜，再转移至生物反应器中。</li>
</ol>
5. 将 ASM 细胞接种到定向支架上
<ol>
	<li>在组织培养板中，将支架浸入含补充剂的 DMEM 培养基中，于 37 °C 孵育 1 小时，然后在 30 µl&#160;含补充剂的 DMEM 培养基中接种 2.5 × 104 个细胞，孵育 2 小时&#160;（37 °C，5% CO2 空气环境）。将支架完全浸没于含补充剂的 DMEM 培养基中，放回培养箱过夜，随后在生物反应器中建立三重共培养体系。</li>
</ol>
6. 使用生物反应器系统建立三重共培养体系（图7）
<ol>
	<li>将双相支架垫圈放入一个腔室的凹槽中，使上皮相朝上面对腔室。</li>
	<li>将取向支架置于双相支架下方（使其与双相支架的微纤维相相邻），并将生物反应器的两个腔室锁紧在一起。</li>
	<li>组装两个灌注流回路，分别连接至两个培养基储液器（顶侧储液器中为添加补充物的DMEM-F12培养基，基底侧储液器中为添加补充物的DMEM-F12/DMEM培养基），使用蠕动泵以约0.1 ml/min&#160;的速度使培养基在两个回路中循环（每个回路循环40 ml&#160;培养基）。将系统所有部件置于37 °C、5% CO2的空气环境中孵育箱内。</li>
	<li>一周后，移除顶侧腔室中的培养基，将上皮细胞在气液界面（ALI）条件下继续培养一周，然后进行分析。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

静电纺丝技术能够制备出结构特性与天然细胞外基质（ECM）相似的聚合物纤维，因此已被广泛用于多种天然或合成聚合物以及聚合物共混物的静电纺丝，以模拟这些微环境,。工艺参数的调控（包括聚合物种类、聚合物浓度、溶剂类型、针尖与收集器之间的距离以及温度）均可影响支架的特性；然而，某些参数对支架性能的影响可能比其他参数更为显著25,。在调控聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）纤维直径时，我们发现关键参数包括所用聚合物的浓度、聚合物溶液的静电纺丝速率以及针头的直径。在制备取向排列纤维时，关键参数为收集方式（使用旋转芯轴）以及芯轴的旋转速度。通过将芯轴转速降低至60 rpm，我们发现与在平板收集器上静电纺丝相比，所得的随机取向支架具有更高的均匀性。
对脱细胞气道组织的特性进行分析，旨在为各类气道细胞培养所开发的不同支架拓扑结构提供指导。静电纺丝纳米纤维是一种理想的支架材料，可用于模拟基底膜结构，因其孔径小但总体孔隙率高，有利于代谢物扩散，同时限制细胞迁移。9 在优化静电纺丝参数过程中，测试了多种聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）浓度和流速。使用先前其他研究小组采用过的6% wt/vol PET溶液可获得最细的纤维，但始终存在大量珠状缺陷和不均匀问题。最初尝试通过在溶液中添加阳离子表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）以降低表面张力，并测试不同来源的PET，从而消除珠状结构。添加表面活性剂虽减少了珠状物数量，但未能完全消除。在尝试多种市售PET颗粒来源后，最终采用食品级饮料瓶来源的PET，即将饮料瓶剪碎后溶解于二氯甲烷：三氟乙酸（DCM:TFA）溶剂体系中。使用该来源的PET后，纤维均匀性提高，珠状缺陷减少。通过将溶液浓度略微提高至8% wt/vol，并减小针头直径（从18G减小至23G），我们持续制备出无缺陷的纳米纤维，纤维直径约为250 nm。静电纺丝纳米纤维支架在从转鼓上收集时可能带有较强静电，导致手动操作困难。通过纺丝后将支架保存在铝箔中，并在使用前用70%工业甲基化酒精（IMS）浸泡，可改善此问题。该处理有助于消散静电纺丝过程中残留在支架上的静电荷。
为了提供与气道壁内三种主要气道细胞类型所处的个体微环境相似的拓扑结构，对基本的静电纺丝方案进行了改进，以制备适用于这三种细胞类型的独特支架：通过缓慢静电纺丝低浓度的PET溶液，生成了随机取向的纳米纤维。 到……上 通过以更快的速度静电纺丝更高浓度的PET溶液，制备出随机排列的微纤维（形成孔隙率更高的支架），用于接种上皮细胞（模拟基底膜）。 进入 将成纤维细胞接种于该层（模拟基底膜下方的黏膜下层区域）。通过将低浓度的PET溶液静电纺丝至高速旋转的芯轴上，制备出取向排列的纳米纤维，平滑肌细胞沿纤维方向排列生长，形成取向有序的细胞片层。
纤维直径增大可导致孔径增大，从而促进细胞向支架内部渗透，有助于构建真实的三维环境,。在本研究中，采用微米级纤维支架培养成纤维细胞，以确保细胞能够在支架内的多个平面上生长。通过将PET浓度提高至30% wt/vol，可制备出平均直径为2.5 µm的PET纤维。使用35% wt/vol的PET溶液可制得直径更大的纤维（≈ 4 µm），但支架厚度的均匀性下降，且单根纤维之间的差异更为明显。微米纤维支架中的孔径比纳米纤维支架中测得的孔径大7倍以上（分别为10.45 µm与1.43 µm），但静态接种细胞时，细胞渗透仍较有限。通过使用旋转混合器进行动态接种，细胞渗透效果得到改善，该方法此前已被证明有效。
通过将10% wt/vol的PET溶液静电纺丝到以2,000 rpm（≈ 440 m·min-1）旋转的芯轴上，制备出高度取向的纳米纤维支架。提高PET浓度至8%以上，是为了防止在较低浓度下纤维出现不规则的波浪状形貌。尽管浓度增加，纤维的取向排列仍降低了平均纤维直径（取向纤维为216 nm，随机纤维为255 nm）。这可能是由于芯轴高速旋转，在纤维尚未干燥前即被拉伸所致。纤维的取向排列影响了ASM细胞的取向，同时也对ASM细胞产生其他生理效应，这些效应已在其他研究中得到表征21。
该方案的主要局限性在于无法对支架上的活细胞进行成像，因此在不牺牲样本的情况下，无法确定初始的细胞贴附或长期的分化情况；这意味着大多数优化工作只能在培养期结束后进行。 即， 固定样本并检测细胞培养是否成功 之后 不 在……期间 细胞培养。在含有alamarBlue的支架中观察到颜色变化（由蓝色变为粉红色）表明细胞存在且具有活性，但该方法并不理想。使用更透明的聚合物（如明胶）进行静电纺丝，有助于在支架上观察细胞。在本模型中，通过静电纺丝制备纳米纤维支架，可模拟气道基底膜（RBM）的结构，该结构同样由致密的纳米纤维组成，上皮细胞即附着其上。已有研究证实，结构细胞无法穿过纳米纤维支架。22尽管免疫细胞能够迁移（数据未显示）。虽然这种特性有利于在三维表面培养特定类型的细胞（如上皮细胞和内皮细胞），但结构细胞无法穿过纳米纤维的特性可能不利于其他类型细胞的培养。由于平滑肌细胞无法穿过我们所构建的取向纳米纤维支架，因此我们将三层共培养模型设计为平滑肌层与成纤维细胞层相对排列（而非由取向支架将两种细胞分隔开）。这种结构虽可使细胞紧密相邻，但本研究尚无法确定在更长时间的培养过程中，某一细胞类型（成纤维细胞或平滑肌细胞）是否会占据整个细胞层。尽管存在这些局限性，本研究仍成功构建了一种可行的气道壁三层模型，为研究这多种细胞类型之间的相互作用提供了新的平台。近期已有类似三层模型的研究发表，其中成纤维细胞被包埋于圆柱形Ⅰ型胶原水凝胶中，平滑肌细胞接种于外表面，上皮细胞则位于管腔表面17所开发的电纺支架的机械稳定性将允许形成类似的管状结构，这也是我们研究团队当前的研究目标之一。尽管本研究聚焦于气道，但人体内多个器官均具有这种基本的黏膜结构单元；通过调整本研究中强调的各项原则，可为包含基底膜单元的组织（如血管、膀胱和角膜）开发类似的研究平台，这些组织中已有采用基于胶原的多层模型的先例。

再生医学与组织工程领域正在迅速发展，其中气管和肾脏再生是近期两项引人注目的成果。组织工程中开发的生物材料正变得越来越易于获取，使得相关实验方案有望被推广至专业程度较低的实验室。一个有望通过日益广泛使用生物材料而受益的领域是体外诊断。
体外研究是探究单一细胞类型内细胞内信号通路的重要平台，有助于阐明多种疾病病理生理学背后的机制。这些研究通常依赖于将单一细胞类型在组织培养塑料（TCP）上以单层形式培养；这是一种二维（2D）刚性表面，其弹性和孔隙率远低于细胞在组织或器官中所处的三维（3D）环境。传统上，动物模型被用于验证体外发现的效应是否同样适用于整体组织，并且也可作为临床前平台用于研究人类疾病。然而，物种间的差异削弱了我们对动物模型在人类疾病理解中的依赖性-。例如，尽管人类哮喘与小鼠模型之间存在固有差异，包括气道平滑肌束中肥大细胞浸润的证据极少，以及动物模型缺乏自发性疾病发展的能力，但目前对肺部疾病哮喘的许多认识仍基于小鼠模型3,4。此外，使用动物模型还涉及伦理问题，英国及其他国家均提倡在动物实验中遵循“3R”原则，即“替代、优化和减少”。
一种颇具吸引力的替代方案是重现人类组织 体外 构建结构以研究单一单元内成人人类细胞类型间的协同作用。细胞在组织中以三维多细胞结构存在，每种细胞都处于独特的微环境中。在组织培养塑料（TCP）上培养细胞仅能形成单层细胞，无法模拟这种环境，也不具备共培养多种细胞的能力。生物材料的进步为开发天然和合成的三维细胞培养平台提供了可能。脱细胞化细胞外基质（ECM）在重新接种其他类型细胞（包括干细胞）后可用于三维细胞培养。1然而，此类方案可能较为复杂且耗时，且可用的组织来源有限，大多为非人类来源。其他方案则能够更精确地控制所构建的细胞环境，例如纳米压印、细胞外基质沉积、细胞片技术或静电纺丝。静电纺丝可制备出直径从纳米到微米级的无纺三维多孔纤维膜，其尺寸范围可模拟天然细胞外基质。静电纺丝支架正越来越多地被用作三维细胞培养平台-调控静电纺丝参数可精确控制支架的特性，如孔径大小、纤维直径、形貌与取向以及表面化学性质。已有研究表明，当细胞单独培养时，这些参数的改变会直接影响细胞的黏附与生长。
这些优势在本研究中得到了利用，以气道细支气管作为三维组织结构模型，实现将多种细胞类型共培养为单一的三维组织构建物。细支气管壁由三个主要区域组成（图1）。黏膜是气道上皮细胞所处的部位，这些细胞位于气液界面（ALI），对外部环境构成重要的屏障。它们附着于网状基底膜（RBM）之上，RBM是一种致密的细胞外基质（ECM），主要由IV型胶原、perlecan和层粘连蛋白组成。黏膜下层位于黏膜下方，是一个结构更为疏松的区域，在疾病状态下包含多种细胞类型，如成纤维细胞、肌成纤维细胞以及浸润的白细胞。最后，平滑肌束以螺旋方式环绕气道，由排列有序的气道平滑肌（ASM）细胞层构成。正是平滑肌的相对收缩状态调控着气道张力。静电纺丝支架在肺部系统中的应用直到最近仍局限于再生医学领域，已有成功移植静电纺丝气管替代物的案例。尽管取得成功，但此类治疗手段数量有限，且主要集中于气管，这是由于气管组织功能相对简单所致。目前用于气道建模的实例仍较为有限 体外 存在诊断方法，主要集中在平滑肌收缩力的测量,无毒且不可降解的聚合物聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）此前已被用于静电纺丝，在本研究中采用该材料可确保所制备的支架能够长期储存而不发生降解（实现“即取即用”），并适用于长时间的稳定细胞培养。本课题组先前的研究表明，通过采用三种不同的基础静电纺丝方案，可制备出三种独立的PET静电纺丝支架，分别为气道上皮细胞、成纤维细胞和平滑肌细胞的单独培养提供最佳的表面形貌。21,22 气道上皮细胞与成纤维细胞的共培养22纤维直径被发现对上皮功能具有显著影响22，且纤维取向实现了平滑肌细胞有序排列的片状结构的构建21这些研究在静态条件下彼此独立地进行。在本研究中，含有完全分化的成人人类细胞的不同支架在商业化的生物反应器中作为气道壁的三维结构部分，在气液界面（ALI）共培养了一周，从而提供了一个生理相关的 体外 用于研究气道细胞间反应的模型。尽管本实验方案以气道细支气管作为模型系统，但也可经调整后作为其他器官黏膜单位的三维共培养平台。

<table><tbody><tr><td>聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）</td><td>Lucozade（GSK）瓶子</td><td>N/A</td><td>用于静电纺丝的 PET 来源。根据需要切成小片并称重</td></tr><tr><td>二氯甲烷（DCM）</td><td></td><td></td><td>PET 的溶剂</td></tr><tr><td>三氟乙酸（TFA）</td><td>Sigma</td><td></td><td>PET 的溶剂</td></tr><tr><td>旋转芯轴</td><td>实验室自制</td><td></td><td>用于收集静电纺丝纤维。通过以不同速度旋转，可使纤维定向排列或随机取向</td></tr><tr><td>注射泵</td><td>Harvard apparatus</td><td></td><td>用于静电纺丝过程</td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Gibco</td><td></td><td>CALU3 细胞的培养基</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td></td><td>HASM 细胞的培养基</td></tr><tr><td>MEM</td><td>Gibco</td><td></td><td>MRC5 细胞的培养基</td></tr><tr><td>抗生素/抗真菌素溶液</td><td>Gibco</td><td></td><td>培养基添加剂</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Gibco</td><td></td><td>培养基添加剂</td></tr><tr><td>轨道混合器（Orbital shake 503）</td><td>Stuart Scientific</td><td></td><td>用于将细胞动态接种到微纤维支架上</td></tr><tr><td>蠕动泵&amp;nbsp;</td><td>Watson Marlow</td><td></td><td>用于为生物反应器提供培养基流动</td></tr><tr><td>3DKube</td><td>Kiyatec</td><td></td><td>用于三维细胞培养的生物反应器</td></tr></tbody></table>

通过调整静电纺丝工艺为三层结构提供三种独特环境 体外 气道壁模型

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

静电纺丝是一种高度可调的方法，可制备出多孔的三维纤维支架，可用于体外细胞培养。通过调节该工艺中的内在参数，可高度控制支架的特性，包括纤维直径、取向和孔隙率。通过开发在尺寸和形貌上类似于器官或组织特异性细胞外基质（ECM）的支架，可构建出与细胞在体内所处环境相似的微环境。
气道细支气管壁由三种主要微环境组成，被选为模型组织。以脱细胞气道细胞外基质（ECM）为指导，我们采用三种不同的工艺，通过静电纺丝技术制备了不可降解聚合物聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET），生成三种独立的静电纺丝支架，分别优化用于上皮细胞、成纤维细胞或平滑肌细胞的培养。利用一种商用生物反应器系统，我们实现了这三种细胞类型的稳定共培养，以提供一种 体外 长期气道壁模型。
该模型强调了此类方法在应用中的潜在可能性 体外 通过提供相关平台，可在三维、组织特异性的环境中培养完全分化的成体细胞，从而为研究重要的细胞间串扰机制或评估新的药物靶点的诊断研究提供支持。

脱细胞气道组织的扫描电子显微镜图像或气道活检的免疫组织化学图像揭示了我们希望引入到静电纺丝支架形貌中的气道细胞外基质（ECM）的理想特征：天然基底膜（RBM）基质由直径约为153 nm ± 30.6 nm（均值 ± 标准差，n=50次测量）的纤维组成（图3A和5A），而围绕RBM的基质则具有更高的多孔性（图3C）。穿过平滑肌束的免疫组织化学切片显示气道平滑肌（ASM）以成排排列的细胞片层形式存在21（图3E）。这些信息被用于指导静电纺丝支架中所引入的结构特征设计。通过使用可高速稳定旋转的旋转滚筒（>2,000 rpm / 440 m·min-1），可制备出具有取向纤维的支架。较低速度的滚筒旋转（60 rpm / 13.2 m·min-1）虽不影响纤维取向，但与在静态平板上进行静电纺丝相比，所得支架厚度更为均匀。通过调节静电纺丝参数（PET浓度和溶液流速），可制备出纤维直径为数微米或数百纳米的支架（静电纺丝参数详见表1）。
使用6%的PET溶液制备出与天然RBM纤维直径相当（150 nm）的电纺纤维，但在如此低的PET浓度下，纤维出现串珠现象（图4A）。通过将PET溶液浓度提高至8%，可消除该现象，获得平均直径为255 nm ± 2.4 nm（均值 ± 标准误）且平均孔径为1.43 µm ± 0.02 µm的均匀纳米纤维（图4B、5A&amp;B）。为实现纳米纤维的电纺，需将针头尺寸从18 G减小至23 G，从而在保持较高流速的同时降低流速，减少针头堵塞——这是使用较大针头时反复出现的问题。在电纺微米纤维时，将PET溶液浓度提高至&gt;30%会导致纤维直径不均（图4F），同时由于溶液黏度过高，针尖处频繁发生堵塞。当以2 mL/h-1的流速电纺30% wt/vol的PET溶液时，可获得均匀的微米纤维膜，其平均纤维直径为2.50 µm ± 0.02 µm（均值 ± 标准误），平均孔径为10.45 µm ± 0.13 µm（图4F、5A&amp;B）。将纳米纤维支架直接顺序电纺至微米纤维支架上（后者仍附着于芯轴），可构建双相支架（图3D）。纳米纤维相和微米纤维相的平均纤维直径分别为280 nm ± 20 nm和2.30 µm ± 0.06 µm，与单独的纳米纤维和微米纤维支架的尺寸相当。此外，双相支架的厚度接近于单独纳米纤维和微米纤维支架厚度之和（图5C）。通过提高芯轴转速（2,000 rpm/440 m·min-1），可制备出高度取向的纳米或微米纤维支架。8% wt/vol的PET溶液并非制备取向纳米纤维的最佳选择，所得纤维呈现波浪状形貌（图3F）。将PET浓度提高至10%可消除该效应，但所得纤维直径仍较随机取向的纳米纤维支架更小（216 nm ± 2.2 nm（均值 ± 标准误））。纤维取向度通过计算每根纤维角度相对于平均纤维角度的偏差来确定。在取向纳米纤维支架中，79%的纤维沿主方向排列（±10°平均纤维角度），而随机取向纳米纤维支架中仅有10.2%的纤维沿主方向排列（图5D）。
采用8%的纳米纤维支架模拟上皮细胞所依附的基底膜（RBM），并用于支持CALU3细胞（一种气道上皮细胞系）的培养。由于30% wt/vol 的微米纤维支架具有更高的孔隙率，被用来模拟黏膜下层，并用于MRC5细胞（一种气道成纤维细胞系）的培养。10% wt/vol 的取向纳米纤维支架提供了拓扑引导，以确保ASM细胞在支架上培养时实现定向排列。三种细胞类型在各自支架上培养两周后，活力均有所提高（图6A），并在培养两周后表达出细胞类型特异性的蛋白（图6B、6C和6D）。各细胞与支架之间相互作用的进一步表征已在其他文献中报道21,。通过顺序电纺丝技术将纳米纤维支架直接纺制在微米纤维支架上，构建出一种双相支架，用于在纳米纤维相和微米纤维相上分别共培养CALU3上皮细胞和MRC5成纤维细胞。两种细胞在静态条件下共培养的结果已在其他文献中报道22。尝试在静态条件下增加其他细胞层或将双相共培养时间延长至两周以上均未成功（数据未显示）。为了长期培养三层结构模型，我们采用了灌注流动生物反应器。将CALU3细胞和MRC5细胞接种于双相支架上，同时将ASM细胞接种于取向支架上，两组支架分别独立培养2天。随后将两个支架组合在一起，在生物反应器内形成气道壁的三层结构模型（图7）。两个腔室均以培养基灌注培养7天后，移除上皮腔的培养基，使上皮细胞在气液界面（ALI）条件下继续培养7天。随后对支架进行固定，进行切片染色或整体免疫荧光染色，检测细胞特异性标志物。三层共培养结构的切片显示，细胞核分布于共培养体系的全部三层结构中（图8B）。当使用细胞特异性标志物进行免疫染色时，上皮细胞在顶部纳米纤维相上形成融合的单层细胞，并对细胞角蛋白呈阳性染色（图8C）；在微米纤维相上，成纤维细胞对S100A4呈阳性染色（图8D）；在10%取向支架上，ASM细胞对SM22α呈阳性染色（图8E），表明在气道壁的三维模型中，各类细胞均具有良好的存活状态。
<img alt="组织学示意图；肺组织各层标注：黏膜层、黏膜下层、平滑肌、上皮。" src="/files/ftp_upload/52986/52986fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. 气道细支气管。 重度哮喘患者气道的支气管活检样本，显示位于网状基底膜（RBM）上的上皮层，其下方的黏膜下区域含有间充质细胞，周围的平滑肌束中含有被平滑肌α-肌动蛋白（棕色）染色的平滑肌细胞。比例尺为 200 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52986/52986fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="静电纺丝装置示意图；注射泵、14 kV电压源、用于纤维制备的芯轴。" src="/files/ftp_upload/52986/52986fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
图2. 静电纺丝设备的示意图。 装有聚合物/溶剂溶液（带针头）的注射器放置在注射泵上，并对准芯轴。在针头与芯轴之间施加电势，使纤维从针尖喷出并沉积在旋转的芯轴上。当纤维穿过空气时，溶剂蒸发，导致聚合物纤维沉积在芯轴上。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52986/52986fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="组织与支架纤维的扫描电镜图像；生物材料的微观结构比较" src="/files/ftp_upload/52986/52986fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. 电纺支架与天然气道细胞外基质（ECM）的比较。 脱细胞化基底膜（A）、脱细胞化气道细支气管横切面（C）以及气道平滑肌束的组织学切片（苏木精-伊红染色，比例尺 40 µm）（E）与纳米纤维（B）、双相（D）和取向排列（F）的PET支架的扫描电子显微镜图像对比。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52986/52986fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的高清版本。</a>
表1. 用于单独制备微纤维、纳米纤维、取向支架以及双相支架的静电纺丝参数。
<img alt="纳米纤维与微纤维的扫描电镜图；随机排列与取向排列的对比；结构分析。" src="/files/ftp_upload/52986/52986fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"> 
图4. PET浓度的变化影响纤维特性。 由6%、8%、10%（A-C）和25%、30%、35%（E-G）（wt/vol）PET溶液静电纺丝制备的支架扫描电子显微镜图像。同时展示了由8%（D）和30%（H）（wt/vol）PET溶液制备的取向排列支架。图像A-D在5,000倍放大下拍摄，E-H在1,000倍放大下拍摄。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52986/52986fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="纤维直径、孔径、厚度和纤维取向偏差分析；四个对比图。" src="/files/ftp_upload/52986/52986fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 5"> 
图5. 电纺PET支架的性能。（A）显示来自网状基底膜细胞外基质（RBM ECM）、随机取向的纳米和微米纤维支架以及取向纳米纤维支架的纤维直径分布曲线。（B）显示纳米和微米纤维支架中相对孔径分布的直方图。（C）纳米纤维、微米纤维、双相和取向支架的平均厚度（均值±标准差，n=6）。（D）显示随机或取向纳米纤维支架中纤维取向相对于平均值偏差的直方图。支架纤维分析使用ImageJ软件进行。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52986/52986fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞生长吸光度图表和扫描电镜图像；支架上的E-钙黏蛋白、连环蛋白、SM22α染色。" src="/files/ftp_upload/52986/52986fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图6"> 
图6. 单一细胞类型在各自支架上的培养。（A）ASM细胞在取向支架上、CALU3细胞在纳米纤维支架上以及MRC5细胞在微米纤维支架上的alamarBlue细胞活力检测结果（均值±标准误，n=3–20）。纳米纤维、微米纤维和取向纤维支架的扫描电子显微镜图像（分别为B、C和D），以及分别在特异性支架上培养的CALU3细胞（E-钙黏蛋白染色，红色）、MRC5细胞（连环蛋白染色，红色）和ASM细胞（SM22α染色，红色）的免疫荧光图像（分别为E、F和G）。使用Hoechst染色细胞核（蓝色），比例尺为40 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52986/52986fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="带有蠕动泵、培养基储液罐、0.2 µm 滤器和 3DKube 的三相共培养装置。" src="/files/ftp_upload/52986/52986fig7.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 7"> 
图 7. 用于三层层气道壁模型的灌注系统。 （A）连接至蠕动泵和两个培养基储液罐的生物反应器装置照片。（B）三层支架的示意图。（C）当气道模型置于气液界面时，两个生物反应器回路的示意图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52986/52986fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="组织学示意图；上皮、细胞角蛋白、成纤维细胞分析；显微镜检查、组织结构研究。" src="/files/ftp_upload/52986/52986fig8.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图8"> 
图8. 完整的三维气道壁模型。（A）气道壁的支气管活检样本，其中黏膜层以红色高亮显示，黏膜下层以绿色高亮显示，平滑肌束以金色高亮显示。（B）三层结构气道壁的切面图，由双相且取向排列的支架构成，支架上接种了上皮细胞、成纤维细胞和平滑肌细胞，并在共培养2周后固定。细胞核用DAPI染色（蓝色），同时成像显示支架的反射信号（灰色）。支架在共培养2周后也被固定并进行免疫染色，以检测细胞特异性标志物：CALU3细胞染色检测细胞角蛋白（绿色）（C），MRC5细胞染色检测S100A4（绿色）（D），平滑肌细胞染色检测SM22α（红色）（E）。比例尺为200 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52986/52986fig8large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="详细列出微纤维、纳米纤维参数及设置条件的聚合物支架制备表格。" src="/files/ftp_upload/52986/52986table1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="表 1"> 
表 1.

生物材料技术的进步使得三维多细胞类型结构的构建成为可能。我们已开发出静电纺丝方案，用于制备三种独立的支架，以培养气道的主要结构细胞，从而构建气道细支气管壁的三维体外模型。

静电纺丝是一种高度可调的方法，可制备出多孔的三维纤维支架，适用于体外细胞培养。对……的改变可……

本实验的总体目标是通过电纺丝技术制备一种三维相分离支架，以实现完全分化的成人人类细胞的共培养，从而模拟这些细胞在C2中所接触的天然细胞外基质。该目标首先通过电纺丝制备随机取向的微纤维支架来实现；第二步是在微纤维支架上直接电纺一层随机取向的纳米纤维，从而形成双相支架。接下来，制备一种独立的取向排列纳米纤维支架，通过静电纺丝形成。最后一步是将每种支架分别接种相应的细胞类型，并在灌注式生物反应器系统中作为单一整体进行共培养。最终，可通过检测介质释放和免疫染色来分析多细胞间的相互作用。该构建体。与现有的二维转化膜等方法相比，该技术的主要优势在于电纺支架可提供一种三维纤维环境，能够被调整以形成符合生理相关性的形态结构。其结构更具多孔性，并允许多种细胞类型的共培养。该方法利用同源的、患病的或健康的原代人类细胞作为体外模型，提供了一个稳定的实验平台。这将有助于减少对动物模型的依赖，因为动物模型在模拟人类疾病方面存在局限性，同时也能减少实验中所使用的动物数量。尽管该方法可用于研究哮喘和慢性阻塞性肺疾病（COPD）等疾病，也可拓展应用于其他系统，例如用于肠道炎症性疾病的研究，或用于构建皮肤模型以进行化学物质测试。首先，制备三种不同的10毫升PET溶液，将8%、10%和30%的PET分别溶解于氯甲烷与三氯乙酸的1:1混合液中。室温下搅拌溶液过夜，以确保次日PET完全溶解。将PET溶液转移至注射器中，并在装有8%溶液的注射器上连接23号针头，另两个装有10%和30%PET溶液的注射器则连接18号针头。制备微纤维支架。首先，将装有30% PET溶液的注射器装入注射泵，使针尖朝下。将金属鼓置于距针尖15厘米处，并确保针尖对准金属鼓的中心。使用金属鳄鱼夹将正极电源线连接到针尖，并通过将接地线连接到香蕉插座来接地纺丝装置。打开电机，将纺丝装置转速设置为 60 RPM。开启注射泵，设定流速为 2.0 毫升每小时。制备微纤维支架时，启动泵直至溶液从针尖挤出，以排出针头内的空气，完成系统的预填充。随后停止注射泵的运行。将待推出溶液的总体积设定为两毫升，并启动泵。接着，在针头与芯轴之间施加14千伏的电压，电纺一小时，直至30% PET溶液的两毫升完全电纺完毕，此时微纤维支架仍留在芯轴上，随后关闭电压。取下鳄鱼夹，将装有30% PET溶液的注射器更换为装有8% PET溶液的注射器。然后将鳄鱼夹重新连接到23号针头上。将注射泵的流速调整为0.5毫升/小时，并启动注射泵，使溶液从针尖流出，以对针头进行预冲洗。在芯轴继续以60转/分钟旋转的同时，在针尖与芯轴之间施加14千伏的电压，并将注射泵需挤出的总体积设定为2毫升。电纺四小时，直至8% PET溶液中有两毫升完成电纺。电纺结束后，关闭电源和带动心轴旋转的电机。沿心轴宽度方向用刀片切割双相支架，得到一片尺寸与心轴表面积相同的二维支架片。为制备取向的PET支架，将装有10% PET溶液的注射器装入注射泵，针尖朝下。然后将鳄鱼夹连接到针头上。设定流速为0.5毫升每小时，并用PET溶液预润针头。然后启动电机，将心轴转速设置为 2000 RPM。接着打开注射泵，将电压源调至 14 千伏，并开启电源，进行四小时的静电纺丝，直至两毫升溶液完成静电纺丝。静电纺丝完成后，关闭电源和电机。沿 mandrel 的宽度方向用刀片将支架切割，以获得排列整齐的二维支架片。将静电纺丝支架存放在铝箔中，以减少静电荷。使用直径为0.8毫米的活检打孔笔从SPU片材中切取双相或定向支架的圆片。然后使用无毒水族胶将双相支架圆片粘附到垫圈上。将垫圈和支架放入12孔组织培养板中。将支架两侧分别用紫外线I照射30分钟，对垫圈和支架进行灭菌。然后于4°C条件下在20%抗生素-抗真菌溶液中浸泡过夜。次日用PPS洗涤支架3次，并将支架置于4°C的PBS中保存，直至使用。将双相支架从 PBS 中转移至新的 12 孔板中，加入含 10% FCS 的 DMEM 培养基，在 37 摄氏度下预热一小时。移除补充了成分的 DMEM 培养基，将支架的微纤维相朝上，每孔支架上接种 15,000 个 MRC-5 成纤维细胞，接种体积为 30 微升含补充成分的 DMEM 培养基，以促进成纤维细胞渗入支架。将培养板置于摇床上，以 100 RPM 的转速振荡支架两小时。然后向每个支架中加入2 mL添加了补充成分的DMEM培养基，并在37°C、5%二氧化碳条件下将支架孵育过夜。次日，移除孔中的培养基，将支架翻转，使支架的纳米纤维层朝上。随后，在30 µL含有10% FCS的D-M-E-M-F12培养基中加入30,000个Cali-3上皮细胞，并接种至支架的纳米纤维层表面。将支架在37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育2小时，然后将支架浸入由70% DMEM/F12和30% DMEM补充培养基组成的混合培养基中，继续静态孵育12小时，以培养气道平滑肌细胞。首先，将排列好的支架从磷酸盐缓冲液（PBS）转移至新的12孔板中，并在37摄氏度下预热支架和DMEM补充培养基1小时。吸除DMEM补充培养基，向每个支架中加入含25,000个气道平滑肌细胞的30微升DMEM补充培养基，于37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育2小时。固定后，将支架浸入添加了补充物的DMEM培养基中。将其放回培养箱，静置过夜，然后在生物反应器中建立三重共培养体系。次日，将双相接种支架放入生物反应器腔室中，使上皮相朝上面对腔室。然后将对齐的支架放置在双相支架下方，使其与双相支架的微纤维相部分相邻。将生物反应器的两个腔室锁紧固定。随后，按照随附的文字方案在培养箱内组装两个灌注流路，并在一周后使用蠕动泵以大约 0.1 毫升每分钟的流速在两个回路中循环培养基。从顶端腔室中移除培养基并进行培养。在生物反应器中培养两周后，再于气液界面继续培养上皮细胞一周，随后进行分析。此处所示的三重共培养支架经固定并切片，以显示细胞核在整个构建体所有三层中的分布情况；细胞核经DPI染色后呈蓝色，支架材料则呈灰色。以下是用于接种上皮细胞、成纤维细胞和平滑肌细胞的电纺纳米纤维、微米纤维及定向排列支架的扫描电子显微镜图像。三种细胞类型在各自支架上培养两周后，均表现出活力的增加。在两周的培养期后，它们也继续表达特定细胞类型的蛋白质。在尝试该操作时，重要的是要记住，需对拟通过电纺纤维重建的天然细胞外基质进行充分研究。细胞在附着于不同的三维形貌时会表现出不同的行为。例如，上皮细胞只有在纳米纤维上培养时才能形成功能性屏障。观看本视频后，您应能够充分理解如何构建一种多层共培养系统，该系统可用于动态培养环境中细胞间相互作用的研究。请务必注意，在执行此操作时，需要根据所使用的聚合物和溶剂体系调整静电纺丝参数，例如流速和电压。这对于获得理想的纤维至关重要。此外，请记住在通风橱或通风柜中进行静电纺丝，以确保溶剂能够被有效排出。

adapting-electrospinning-process-to-provide-three-unique-environments

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科研

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生物工程

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通过调整静电纺丝工艺为三层结构提供三种独特环境体外气道壁模型

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