Name: V3的HIV - 1取向的基因型推理使用人口为基础的测序 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-27T18:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: 了解如何使用巢式RT-PCR和生物信息学方法，通过V3区域测序推断HIV-1的嗜性，区分R5与非R5病毒。该技术成本更低、速度更快，适用于临床实验室的抗病毒治疗决策。

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该检测方法的开发得到了Viiv Healthcare和加拿大卫生研究院（CIHR）的支持，并得益于Harrigan博士所获得的葛兰素史克/CIHR临床病毒学讲席职位的支持。
辉瑞公司和ViiV Healthcare提供的支持。

实验步骤：
1. 提取：
该基因型HIV嗜性检测至少需要500 μL的血浆作为样本输入。
<ol>
<li>使用 easyMAG（bioMérieux）自动化提取仪或实验室常用的提取方法，从 500μL 血浆中提取 HIV RNA。 
将提取的病毒 RNA 洗脱至 60 μL 体积中。提取后可立即进行逆转录-PCR，或于 -20 摄氏度保存。</li>
</ol>
2. 逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）：
将使用巢式RT-PCR方法对4μL的样品提取物进行三份重复扩增。RT-PCR反应必须在PCR洁净室中配制。
<ol>
<li>根据待扩增的样本数量，计算所需试剂的用量。请参考下表中每 1 个反应所需的试剂体积。 
 <table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>试剂</td>
 <td>体积 (μL) 
 (1X 反应)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DEPC 处理水</td>
 <td>10.56</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2x 反应缓冲液</td>
 <td>20</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50% 蔗糖和 0.04% 溴酚蓝混合液</td>
 <td>4</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>靶向 HIV V3 区域的正向引物</td>
 <td>0.32</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>反向引物</td>
 <td>0.32</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>酶 - SuperScript III One-Step RT-PCR System with Platinum Taq DNA Polymerase</td>
 <td>0.8</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>总计</td>
 <td>36</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
表 1. 一步法 RT-PCR 每个反应所需的试剂体积。 
每个一步法 RT-PCR 反应所需配制如下：
<ul>
<li>10.56 μL DEPC 处理水</li>
<li>20 μL 2x 反应缓冲液</li>
<li>4 μL 50% 蔗糖和 0.04% 溴酚蓝混合液</li>
<li>0.32 μL 靶向 HIV V3 区域的正向引物</li>
<li>0.32 μL 反向引物</li>
<li>0.8 μL 酶</li>
</ul>
每个反应总体积为 36 μL。
</li>
<li>将样本提取管并排置于一个已标记的空 96 孔 PCR 板旁边。</li>
<li>使用重复移液器，向 PCR 板的每个孔中加入 36 μL 样本混合液，使每个样本提取物对应准备 3 个孔。 
*注意：为充分代表病毒群体，该操作至少需进行三重重复。</li>
<li>使用 8 通道多通道移液器，向每个样本对应的 3 个孔中各加入 4 μL 样本提取物。每次加样后均需更换吸头。</li>
<li>用 PCR 条形盖密封各孔。</li>
<li>转移完成后，将 PCR 板放入热循环仪中。设置热循环程序如下：

52°C 反应 30 分钟 
94°C 预变性 2 分钟 
40 个循环（94°C 变性 15 秒，55°C 退火 30 秒，68°C 延伸 1.5 分钟） 
68°C 最终延伸 5 分钟
</li>
<li>从热循环仪中取出 PCR 板。PCR 板可在室温下保存。</li>
</ol>

进入第二轮 PCR 步骤
3. 第二轮 PCR：
<ol>
<li>根据待扩增样本数量计算所需试剂的用量。请参照下表中每 1 个反应的试剂体积。
 
 <table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>试剂</td>
 <td>体积&mu;L) 
 (1X 反应)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DEPC 处理水</td>
 <td>13.45</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>60% 蔗糖，0.08% 甲酚红混合液</td>
 <td>2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Roche HiFi 系统缓冲液 2</td>
 <td>2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgCl₂2</td>
 <td>0.8</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>dNTP</td>
 <td>0.16</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>正向 PCR 引物</td>
 <td>0.15</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>反向 PCR 引物</td>
 <td>0.15</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>扩增 HiFi酶</td>
 <td>0.29</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>总计</td>
 <td>19</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
表2. 进行1次2反应所需的试剂体积nd PCR扩增 
每个第二轮 PCR 反应需要以下配方：
<ul>
<li>13.45 &mu;L DEPC 处理水</li>
<li>2 &mu;L 60% 蔗糖，0.08% 二甲苯蓝混合液</li>
<li>2 &mu;L Roche Hifi 系统缓冲液 2</li>
<li>0.8 &mu;L 25 mM MgCl2</li>
<li>0.16 &mu;L 25 mM dNTP</li>
<li>0.15 &mu;L 正向和反向PCR引物</li>
<li>0.29 &mu;L 扩增 HiFi 酶</li>
</ul> 
 共计 19 &mu;L 每反应 </li>
<li>在PCR洁净室中，使用多通道移液器，加入 19 &mu;L 每孔加入适量反应缓冲液至洁净的PCR板中。</li>
<li>在扩增后实验室内，使用八通道多通道移液器转移 1 &mu;L 将RT-PCR模板加入第二轮PCR缓冲液中。每次加样之间需更换吸头。</li>
<li>用PCR条带盖密封各孔，并将第二轮PCR板转移至热循环仪。</li>
<li>将热循环仪设置为运行以下程序： 
2 分钟，95°C 94&deg;C
35 个循环（15 秒 94&deg;C，30秒 55&deg;C1分钟 72&deg;C7 分钟 72&deg;C
</li>
<li>待温度恢复后，从热循环仪中取出反应板 25&deg;C.</li>
</ol>
4. 凝胶电泳：
为了确认V3区已成功扩增，需进行凝胶电泳步骤。
<ol>
<li>在50 mL的1X TAE缓冲液中加入0.8 g琼脂糖粉末，配制琼脂糖凝胶。搅拌并在微波炉中加热约1分钟，直至琼脂糖完全溶解。</li>
<li>加入6 μL SYBR Safe凝胶染料，轻轻旋转混匀。</li>
<li>将溶液倒入凝胶托盘中，并插入足够数量的梳子，以容纳所需的PCR加样孔数量。</li>
<li>待凝胶完全凝固后，移去梳子，将凝胶放入电泳装置中，并确保其完全浸没于1X TAE缓冲液中。</li>
<li>使用10 μL多通道移液器，将每份PCR样品各8 μL加入凝胶的独立加样孔中。将所有扩增产物加入凝胶后，盖好PCR板。</li>
<li>每排至少在一个加样孔中加入6 μL DNA Marker。</li>
<li>以约100 V电压运行电泳装置约10分钟，注意避免条带跑出凝胶。</li>
<li>将凝胶置于紫外透射仪上成像。 
含有PCR扩增DNA的加样孔会显示明亮条带，表明扩增成功。</li>
<li>记录所有三个重复扩增均成功的样品。如有必要，对扩增次数少于三次的样品重复进行逆转录PCR。</li>
</ol>

进行测序
5. 测序：
在扩增病毒cDNA后，可将样品制备用于测序。测序反应应在扩增后区域进行。
<ol>
<li>从冷冻柜中取出BigDye，从冰箱中取出测序引物。将BigDye在室温下解冻，时间不超过1小时。</li>
<li>根据待运行样本的数量计算所需试剂的用量。按照下表所示，确定单次反应所需的试剂体积。 
 <table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>试剂</td>
 <td>体积 (μL) 
 (1X 反应)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BigDye</td>
 <td>0.3</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BigDye 缓冲液</td>
 <td>2.1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>引物</td>
 <td>2.6</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>总计</td>
 <td>5.0</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
表3. 单次测序反应所需的试剂体积。 
*注意：每种引物需单独配制反应混合液。 
**注意：测序反应中使用的BigDye缓冲液可按如下方法配制：取17.5 mL三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液（1 M）（pH 9.0）与0.125 mL氯化镁（1 M），用试剂级水定容至100 mL。该缓冲液应保存在2–8°C。</li>
<li>根据步骤3.3的计算结果，为每种引物配制测序反应混合液，涡旋混匀不超过5秒。分装至0.2 mL条形管中。</li>
<li>使用多通道移液器将5 μL测序反应混合液分装至相应的板孔中。用Kimwipe纸覆盖含有测序反应混合液的板，并放置一旁备用。</li>
<li>通过向剩余的PCR产物中加入180 μL Baxter无菌水，制备PCR扩增产物的1:15稀释液。</li>
<li>将1 μL稀释后的样本加入相应板孔底部，每次更换移液器吸头。</li>
<li>完成样本转移后，用条形管盖密封板，涡旋混匀1秒。</li>
<li>将板放入离心机中，设置转速为145g，当达到145g转速后，立即停止离心。</li>
<li>将板放入已设定如下程序的热循环仪中：
25个循环（96°C 10秒，50°C 5秒，60°C 55秒）。
最终体积应至少为6 μL。整个程序运行时间约为1.2小时。
</li>
</ol>
进行沉淀
6. 沉淀：
为在测序反应后“纯化”病毒cDNA，使用95%乙醇进行乙醇沉淀。
<ol>
<li>从热循环仪中取出反应板，转移至扩增后操作区域。</li>
<li>取下条带盖，并按顺序放置在干净的纸巾或Kimwipe上。</li>
<li>用移液器将4μL工作浓度EDTA-醋酸钠溶液加入每个样本孔的侧壁。轻轻敲击反应板，使EDTA-醋酸钠溶液滑落至孔底。只要枪头未接触孔底的样本，可重复使用同一枪头。 *注意：工作浓度EDTA-醋酸钠溶液的配制方法如下：
<ol>
<li>通过将246.1 g醋酸钠溶解于1 L试剂级水中，配制3M醋酸钠溶液。用0.45微米滤膜过滤溶液，并分装为每份50 mL。</li>
<li>通过等体积混合醋酸钠（3 M）与EDTA（500 mM，pH 8.0）溶液，配制储存液EDTA-醋酸钠溶液（1.5 M NaOAc，250 mM EDTA）。</li>
<li>通过将1份储存液EDTA-醋酸钠溶液与3份试剂级水混合（10 mL + 30 mL），配制工作浓度EDTA-醋酸钠溶液。</li>
</ol>
</li>
<li>在样本孔的对侧加入40μL预冷的95%乙醇，然后盖上条带盖。</li>
<li>密封条带盖后，涡旋震荡反应板10秒。轻敲反应板以去除可能存在的气泡。</li>
<li>将反应板置于-20°C冰箱中冷冻，时间不少于30分钟，不超过2小时。</li>
<li>
<ol class="lalpha">
<li>沉淀完成后，将反应板从冰箱中取出，放入离心机中以3700 rpm离心20分钟。</li>
<li>从冰箱中取出适量Hi-Di甲酰胺（Applied Biosystems），使其在变性前充分解冻。</li>
</ol>
*注意：对完整的96孔板进行变性需使用960μL Hi-Di甲酰胺，因此建议预先分装约1.1 mL的 aliquot。
</li>
<li>离心后，取下并丢弃条带盖。将反应板倒置于废液容器（如垃圾桶）上方，弃去上清液。通过将倒置的反应板在纸巾上轻压，去除残留的上清液。</li>
<li>折叠两张纸巾并覆盖在反应板表面。将反应板倒置放入离心机，以145g离心，当转速达到145g时即停止离心。</li>
<li>从离心机中取出反应板，检查各孔是否已空。向各孔中加入155μL预冷的95%乙醇。</li>
<li>将上清液倒入废液容器，用纸巾吸干，并重复步骤4.10的离心操作。</li>
<li>从离心机中取出反应板后，丢弃使用过的纸巾，将反应板正面朝上静置2-5分钟，使残留乙醇完全挥发。</li>
</ol>

进行变性步骤
7. 变性
<ol>
<li>取出解冻的HiDi甲酰胺，倒入一个足够大的容器中，以便使用多通道移液器转移。 
*注意：如果按照6.7b中所述使用预先分装的试剂，则每块待运行的96孔板需使用一管。</li>
<li>使用多通道移液器，向板上所有孔中加入10μL HiDi甲酰胺，包括空孔。</li>
<li>用隔垫垫片封盖板孔，形成密封。</li>
<li>将板放入热循环仪中，在90°C下孵育2分钟。</li>
<li>变性完成后，将板放入板架中，然后装载至测序仪。上传已准备好的测序布局文件。在进行测序运行前，板可在-20°C下保存最多一周时间。</li>
</ol>
8. 使用碱基识别软件分析结果数据。
<ol>
<li>使用 ReCall 进行自动碱基识别，无需人工干预，单引物覆盖即可接受。ReCall 是一款定制的碱基识别软件，可通过以下网址获取：http://pssm.cfenet.ubc.ca/ 
*注意：登录需要账户。要注册账户，请点击登录页面上的“Register”按钮。账户创建完成后，您即可访问上传页面。</li>
<li>登录后，您可以选择要上传的样本文件。通过浏览选项，您可以定位原始测序数据进行上传，最大上传文件大小为 20Mb。 
*注意：Web Recall 仅接受以 .zip、.tar 或 .tar.gz 格式打包的 ABI 和 SCF 文件</li>
<li>选择要上传的文件后，请选择您的参考序列。在此情况下，请确保参考序列设置为 'V3'。此时即可点击“Process Data”。</li>
<li>处理后的数据将显示在页面右侧的“Past Samples”标题下。每次运行或样本集处理结果将保存在以日期命名的文件夹中。可通过点击“Rename”按钮重新命名文件夹。</li>
<li>点击文件夹将显示样本列表。红色标记的样本表示失败；绿色标记的样本表示通过。点击特定样本并点击“View”按钮，即可查看序列。请按照页面右侧的说明浏览序列。 
*注意：对于本方法，可通过自动导出通过 ReCall（显示为绿色）的序列，无需人工干预。</li>
<li>若对结果满意，可点击“Download”下载通过的序列。文件将以压缩文件夹形式下载。 
*注意：在“Settings”中可选择下载和电子邮件选项，包括文件类型。</li>
<li>未能产生清晰三重复序列的样本应从提取物中重新进行三重复扩增。若 RePCR 无法提供清晰序列，则至少可接受两个序列用于嗜性推断。</li>
</ol>
9. 使用基于种群测序生成的序列及geno2pheno共受体算法推断病毒嗜性。
<ol>
<li>序列可通过以下网址提交至 geno2pheno 核心受体分析服务：http://coreceptor.bioinf.mpi-inf.mpg.de/index.php。</li>
<li>待上传的样本可根据需要进行标记。在显著性设置的下拉菜单中，选择“基于 MOTIVATE 临床数据分析的优化截断值（2% 和 5.75% FPR）”。</li>
<li>选择上传或粘贴序列进行分析，支持 fasta 文件格式。</li>
<li>geno2pheno FPR 的解读如下：
G2P FPR >5.75 代表使用 R5 型病毒群体；可能对 CCR5 拮抗剂有应答；
G2P FPR &lt; 5.75 代表非 R5 型病毒群体；不太可能对 CCR5 拮抗剂有应答；G2P &lt;2 几乎不可能对 CCR5 拮抗剂产生任何应答。

若一份样本的三条序列中任意一条被推断为非 R5 型，则该患者不太可能对 CCR5 拮抗剂产生应答。</li>
</ol>
10. 代表性结果
正确执行本方案时，应能成功获得每个样本的2至3个重复序列。与样本同时进行的阴性对照应无RNA存在的迹象。大部分序列应能通过ReCall的碱基识别“通过”标准。
根据R5和非R5病毒在群体病毒种群中的分布情况，大多数随机选择的患者样本预期携带使用R5的病毒。因此，除非实验设计另有提示，通常应预期R5样本数量多于非R5样本。
表1. A) 进行一次一步法反转录PCR反应所需的试剂体积，以及B) 实施反转录PCR反应所需的热循环仪程序。
A)
<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td> 
 试剂</td>
 <td>体积 (μL) 
 (1X 反应)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DEPC 处理水</td>
 <td>10.56</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2x 反应缓冲液</td>
 <td>20</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50% 蔗糖和 0.04% 溴酚蓝混合液</td>
 <td>4</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>正向引物 SQV3F1</td>
 <td>0.32</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>反向引物 CO602</td>
 <td>0.32</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>酶 - SuperScript III One-Step RT-PCR System with Platinum Taq DNA Polymerase </td>
 <td>0.8</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>总量</td>
 <td>36</td>
 </tr>
</tbody>
</table>
*注意： 
 SQV3F1 引物序列：5' GAG CCA ATT CCC ATA CAT TAT TGT 3' 
 CO602 引物序列：5' GCC CAT AGT GCT TCC TGC TGC TCC CAA GAA CC 3'
B)
<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>循环次数</td>
 <td>时间</td>
 <td>温度</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1</td>
 <td>30分钟</td>
 <td>52°C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1</td>
 <td>2分钟</td>
 <td>94°C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td rowspan="3">40</td>
 <td>15秒</td>
 <td>94°C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>30秒</td>
 <td>55°C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1.5分钟</td>
 <td>68°C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1</td>
 <td>5分钟</td>
 <td>68°C</td>
 </tr>
</tbody>
</table>
表2. A) 第二轮PCR单个反应所需的试剂体积，以及B) 进行第二轮PCR反应所需的PCR仪程序。
A)
<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td> 
 试剂</td>
 <td>体积 (μL) 
 (1X 反应)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DEPC 处理水</td>
 <td>13.45</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>60% 蔗糖，0.08% 甲酚红混合液</td>
 <td>2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Roche HiFi system Buffer 2</td>
 <td>2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgCl2</td>
 <td>0.8</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>dNTP</td>
 <td>0.16</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>正向引物 SQV3F2</td>
 <td>0.15</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>反向引物 CD4R</td>
 <td>0.15</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Expand HiFi 酶</td>
 <td>0.29</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>总计</td>
 <td>19</td>
 </tr>
</tbody>
</table>
*注意： 
 SQV3F2 引物序列：5' TGT GCC CCA GCT GGT TTT GCG AT 3' 
 CD4R 引物序列：5' TAT AAT TCA CTT CTC CAA TTG TCC 3'
B)
<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td> 
 循环次数</td>
 <td>时间</td>
 <td>温度</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1</td>
 <td>2分钟</td>
 <td>94°C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>35</td>
 <td>15秒</td>
 <td>94°C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>30秒</td>
 <td>55°C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1分钟</td>
 <td>72°C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1</td>
 <td>7分钟</td>
 <td>72°C</td>
 </tr>
</tbody>
</table>
表3. A) 每次测序反应所需的试剂体积，以及 B) 实施测序反应所需的热循环程序。
A)
<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>试剂</td>
 <td>体积 (μL) 
 (1X 反应)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BigDye</td>
 <td>0.3</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BigDye 缓冲液</td>
 <td>2.1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>引物 
 正向 V3FO2F 
 反向 SQV3R1</td>
 <td>2.6</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>总计</td>
 <td>5.0</td>
 </tr>
</tbody>
</table>
*注意：切勿混合引物；每种引物应单独配制混合液 
 V3O2F 引物序列：5' AAT GTC AGY ACA GTA CAA TGT ACA C 3' 
 SQV3R1 引物序列：5' GAA AAA TTC CCT TCC ACA ATT AAA 3'
B)
<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td> 循环次数</td>
 <td>时间</td>
 <td>温度</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>25</td>
 <td>10秒</td>
 <td>96°C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5秒</td>
 <td>50°C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>55秒</td>
 <td>60°C</td>
 </tr>
</tbody>
</table>

<ol><li>Feng, Y., Broder, C. C., Kennedy, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+entry+cofactor%3A+functional+cDNA+cloning+of+a+seven+transmembrane%2C+G+protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">HIV-1 entry cofactor: functional cDNA cloning of a seven transmembrane, G protein-coupled receptor.</a> Science. 272, 872-877 (1996).</li>
<li>Dragic, T., Litwin, V., Allaway, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+entry+into+CD4%2B+cells+is+mediated+by+the+chemokine+receptor+CC-CKR-5%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">HIV-1 entry into CD4+ cells is mediated by the chemokine receptor CC-CKR-5.</a> Nature. 381, 667-673 (1996).</li>
<li>Dorr, P., Westby, M., Dobbs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maraviroc+%28UK-427%2C857%29%2C+a+potent%2C+orally+bioavailable%2C+and+selective+small-molecule+inhibitor+of+chemokine+receptor+CCR5+with+broad-spectrum+anti-human+immunodeficiency+virus+type+1+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Maraviroc (UK-427,857), a potent, orally bioavailable, and selective small-molecule inhibitor of chemokine receptor CCR5 with broad-spectrum anti-human immunodeficiency virus type 1 activity.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 49, 4721-4732 (2005).</li>
<li>Gulick, R. M., Lalezari, J., Goodrich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maraviroc+for+previously+treated+patients+with+R5+HIV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Maraviroc for previously treated patients with R5 HIV-1 infection.</a> N. Engl. J. Med. 359, 1429-1441 (2008).</li>
<li>Cooper, D. A., Heera, J., Goodrich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maraviroc+versus+efavirenz%2C+both+in+combination+with+zidovudine%2Flamivudine%2C+for+the+treatment+of+antiretroviral-na%C3%ADve+subjects+with+CCR5-tropic+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Maraviroc versus efavirenz, both in combination with zidovudine/lamivudine, for the treatment of antiretroviral-naíve subjects with CCR5-tropic HIV-1.</a> J. Infect. Dis. 201, 803-813 (2010).</li>
<li>Low, A. J., McGovern, R. A., Harrigan, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trofile+HIV+co-receptor+usage+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Med.+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Trofile HIV co-receptor usage assay.</a> Expert Opin. Med. Diagnostics. 3, 181-191 (2000).</li>
<li>Sing, T., Low, A. J., Beerenwinkel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+HIV+co-receptor+usage+based+on+genetic+and+clinical+covariates%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Ther%22%5BJournal%5D)">Predicting HIV co-receptor usage based on genetic and clinical covariates.</a> Antiviral Ther. 12, 1097-1106 (2007).</li>
<li>Screening for HIV tropism using population-based V3 genotypic analysis: a retrospective virological outcome analysis using stored plasma screening samples from MOTIVATE-1. Harrigan, P. R., McGovern, R., Dong, W. 5th International AIDS Society Conference, 2009 19-22 July, Cape Town, South Africa, , (2009).</li>
<li>Optimization of clinically relevant cut-points for the determination of HIV co-receptor usage to predict maraviroc responses in treatment experienced (TE) patients using population V3 genotyping. Harrigan, P. R., McGovern, R., Dong, W. 12th European AIDS Conference, 2009 11-14 Nov, Cologne, Germany, , (2009).</li>
<li>Optimization of clinically relevant cutoffs for determining HIV co-receptor use by population and "deep" sequencing methods. Swenson, L. C., McGovern, R. A. 47th Annual Meeting of the Infectious Diseases Society of America, 2009 Oct 29 - Nov 1, Philadelphia, PA, USA, , (2009).</li>
<li>Phenotypic screening for HIV tropism versus both population-based and "deep" sequencing. Swenson, L., McGovern, R., Dong, W. 49th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2009 12-15 Sept, San Francisco, CA, , (2009).</li>
<li>Swenson, L. C., Moores, A., Low, A. J., Thielen, A., Dong, W., Woods, C., Jensen, M. A., Wynhoven, B., Chan, D., Glascock, C., Harrigan, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Detection+of+CXCR4-Using+HIV+by+V3+Genotyping%3A+Application+of+Population-based+and+%27Deep%27+Sequencing+to+Plasma+RNA+and+Proviral+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Acquired+Immune+Deficiency+Syndromes%22%5BJournal%5D)">Improved Detection of CXCR4-Using HIV by V3 Genotyping: Application of Population-based and 'Deep' Sequencing to Plasma RNA and Proviral DNA.</a> Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 54, 506-510 (2010).</li>
<li>Swenson, L. C., Boehme, R., Thielen, A., McGovern, R. A., Harrigan, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotypic+determination+of+HIV-1+tropism+in+the+clinical+setting%5BTitle%5D)+AND+%22HIV+Therapy%22%5BJournal%5D)">Genotypic determination of HIV-1 tropism in the clinical setting.</a> HIV Therapy. 4, 293-303 (2010).</li>
</ol>

P. Richard Harrigan 与 ViiV Healthcare、Virco、Merck、Abbott 和 Quest 存在利益冲突。本视频文章由 ViiV Healthcare 赞助。

本文介绍的方法是一种应用于嗜性检测的标准测序方法。在近期之前，利用HIV包膜V3环测序来预测病毒嗜性的临床应用一直较为有限。在对马拉韦罗（maraviroc，ViiV Healthcare公司）临床试验的回顾性分析中，该方法已被证明至少与其他经临床验证的检测方法在预测病毒嗜性方面具有同等能力。
对V3环进行基因型分析以预测嗜性具有诸多优势。首先，该操作可在任何配备常规测序设备的实验场所开展，显著提高了嗜性检测的可及性并缩短了检测周期。相比之下，作为嗜性检测金标准的表型增强敏感性Tropism检测（Enhanced Sensitivity Trofile Assay, ESTA）（Monogram Biosciences）仅在美国南加州的一个中心进行。此外，该基因型方法所需起始材料更少，且最低血浆病毒载量要求仅为500拷贝/mL。同时，基因型检测的操作成本也明显低于表型检测。特别是ReCall软件的使用，消除了手动序列审阅的必要性，而后者通常是基因型分析中劳动密集型的环节。
本文所介绍的方法相当直接，各步骤的重要性大致相当，没有哪一步骤尤为突出。我们建议将PCR和测序实验设置三重重复，以提高检测样本病毒群体中少数物种的可能性。虽然可以进行超过三次的重复实验，但我们发现三重重复在效率和可靠性方面均表现良好。此外，我们建议使用Qiagen的一步法逆转录PCR试剂盒（One-Step Reverse Transcriptase PCR Kit），该试剂盒可在同一反应中完成逆转录PCR（RT-PCR）和第一轮PCR扩增，同时保持较高的灵敏度和特异性。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;使用 NucliSens easyMAG 1.0 版本进行 RNA 提取&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NucliSens easyMAG 磁性二氧化硅</td><td>bioMerieux</td><td>货号 # 280133</td><td>(48 × 0.6 ml)</td></tr><tr><td>NucliSens easyMAG 裂解缓冲液</td><td>bioMerieux</td><td>货号 # 280134</td><td>(4 × 1000 ml)</td></tr><tr><td>NucliSens easyMAG 提取缓冲液 1</td><td>bioMerieux</td><td>货号 # 280130</td><td>(4 × 1000 ml)</td></tr><tr><td>NucliSens easyMAG 提取缓冲液 2</td><td>bioMerieux</td><td>货号 # 280131</td><td>(4 × 1000 ml)</td></tr><tr><td>NucliSens easyMAG 提取缓冲液 3</td><td>bioMerieux</td><td>货号 # 280132</td><td>(4 × 1000 ml)</td></tr><tr><td>NucliSens easyMAG 1.0 版本</td><td>bioMerieux</td><td></td><td></td></tr><tr><td>II 类 A2 型生物安全柜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;一步法逆转录 PCR 与第二轮 PCR&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DEPC 处理水</td><td>Ambion</td><td>货号 # 9922</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III 一步法 RT-PCR 系统（含 Platinum Taq 高保真酶）</td><td>Invitrogen</td><td>货号#12574-035</td><td>试剂盒组分使用：&lt;br/&gt;- SuperScript III RT/Platinum Taq 高保真酶混合物&lt;br/&gt;- 2X 反应混合液（含 0.4 mM 每种 dNTP 和 2.4 mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 的缓冲液）</td></tr><tr><td>Expand 高保真 PCR 系统</td><td>Roche 集团</td><td>货号 # 1 759 078</td><td>试剂盒组分使用：- Expand 高保真缓冲液 10X 浓缩液（含 15 mM MgCl2，盖子标为 2）- Expand HF PCR 酶混合物（3.5 U/&amp;#x03BC;l）- MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 储存液（25 mM）（盖子标为 4）</td></tr><tr><td>dNTPs：dATP、dGTP、dCTP、dTTP</td><td>Roche 集团</td><td>货号 # 11969064001</td><td>(100 mM)</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>货号 # S0389-500G</td><td></td></tr><tr><td>溴酚蓝钠盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>货号# B5525</td><td></td></tr><tr><td>甲酚红</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>货号# 114472-5G</td><td>指示剂级</td></tr><tr><td>热循环仪</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;凝胶电泳&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50X TAE 缓冲液</td><td>Invitrogen</td><td>货号 # 24710030</td><td>(1000 ml)</td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA 凝胶染料</td><td>Invitrogen</td><td>货号 # S33102</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖（超纯）</td><td>Invitrogen</td><td>货号 # 15510-027</td><td></td></tr><tr><td>E-Gel 低分子量定量 DNA 标准品</td><td>Invitrogen</td><td>货号 # 12373-031</td><td></td></tr><tr><td>试剂级 II 型水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>凝胶电泳装置</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;测序&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ABI PRISM BigDye 终止子循环测序试剂盒</td><td>Applied Biosciences</td><td>货号 # 4337458</td><td>(25000 次反应)</td></tr><tr><td>Hi-Di 甲酰胺</td><td>Applied Biosciences</td><td>货号 # 4311320</td><td></td></tr><tr><td>乙酸钠 (NaOAc)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>货号 # S-2889</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>货号# 03690-100ML</td><td>0.5 M，pH = 8.0</td></tr><tr><td>TRIZMA 盐酸缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>货号 # T-2819</td><td>1 M，pH 9.0</td></tr><tr><td>氯化镁 (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>货号 # M-1028</td><td>1 M</td></tr><tr><td>95% 乙醇</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>含 EDTA 的运行缓冲液 (10X)</td><td>Applied Biosystems</td><td>货号 # 4335613</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>聚合物 Pop-7 (25 mL) 或 聚合物 Pop-7 (10 mL)</td><td>Applied Biosystems</td><td>货号 # 44363929 或 货号 # 4352759</td><td></td></tr><tr><td>3700/3730 BigDye 终止子 v3.1 测序标准试剂盒</td><td>Applied Biosciences</td><td>货号# 4336943</td><td></td></tr><tr><td>热循环仪</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>带板架的离心机</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3730xl DNA 分析仪</td><td>Applied Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

基于v3区群体测序进行hiv-1嗜性基因型推断

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

背景：在开始使用CCR5拮抗剂类药物进行HIV治疗之前，患者必须接受HIV嗜性检测，以确认其病毒群体利用CCR5共受体进入细胞，而非其他替代性共受体。一种检测嗜性的方法是分析HIV包膜蛋白V3区的序列，该区域与共受体相互作用。
方法：从血液血浆中提取病毒RNA。使用巢式逆转录PCR对V3区进行三重扩增。然后对扩增产物进行测序，并利用RE_Call软件进行分析。随后将序列提交至geno2pheno等生物信息学算法，以根据V3区推断病毒嗜性。若其geno2pheno假阳性率低于5.75%，则推断该序列为非R5型。若一份样本的三个序列中任一被推断为非R5型，则该患者对CCR5拮抗剂治疗的应答可能性较低。

HIV嗜性可根据病毒包膜的V3区推断。使用巢式RT-PCR对V3区进行三重PCR扩增，随后进行测序，并利用生物信息学软件进行分析。若样本中存在一个或多个序列的g2P评分较低，则被归类为非R5病毒。

基于V3区群体测序进行HIV-1嗜性基因型推断

背景：在为HIV感染者选择CCR5拮抗剂类药物进行治疗前，患者必须接受HIV嗜性检测，以确认其病毒株为CCR5嗜性。

本实验的总体目标是通过测序HIV病毒包膜基因的V3区，推断HIV感染患者的病毒嗜性，首先从患者血浆中提取HIV RNA。接着，使用巢式RT-PCR扩增HIV gp120的V3区。然后通过凝胶电泳检测扩增产物的存在，随后对扩增的V3区产物进行基于群体的测序分析。最后，使用碱基识别软件分析序列，并利用基因组到表型（genome to pheno）算法推断共受体使用情况。最终，通过基于群体的HIV V3环测序，这些结果可以显示患者体内的病毒群是否为R5型或非R5型。因此，该技术相较于现有的表型细胞实验等方法的主要优势在于，它可在任何配备测序设备的实验室中进行，成本更低、耗时更短，且所需起始材料更少。该技术与抗逆转录病毒治疗相关，因为它可以判断患者的病毒群体是否可能对CCR5拮抗剂产生应答。从500 µL血浆中，使用Easy Mag自动提取仪提取HIV RNA。随后转移至PCR洁净室进行RT-PCR反应体系的建立，以确保对病毒群体进行充分取样。本一步法反应中，每个逆转录反应均需设置三个重复。使用病毒RNA合成cDNA，并利用SQV three F1和CO 6 0 2 prime repair特异性扩增HIVV的three区域。各组分用量基于每个反应进行计算。使用重复移液器配制足够用于待扩增样本数量的储存混合液。将36 µL样本混合液加入PCR板的每个孔中。随后切换为多通道移液器，将微升级的RNA样本提取物转移至指定的各个孔中。每次加样时务必更换吸头。转移完成后，用PCR条形管盖封闭各孔。然后将PCR板放入已编程的热循环仪中，对HIVV三区进行一步法反转录-聚合酶链式反应（R-T-P-C-R）。对于巢式PCR，使用SQV三F二和CD四R引物对。根据待扩增的样本数量，计算在PCR洁净室中所需的试剂用量。配制巢式PCR反应混合液，然后使用多通道移液器将19微升分装至洁净PCR板的每个孔中。完成逆转录-聚合酶链式反应（R-T-P-C-R）后，转移至扩增后操作区。使用八通道多通道移液器将一微升 R-T-P-C-R 模板转移至巢式 PCR 反应体系中。每次加样后均需更换吸头。用 PCR 排管盖密封各孔，并将反应板转移至热循环仪中进行扩增。当温度降至25摄氏度后，从热循环仪中取出反应板。为确认V3区已成功扩增，首先通过凝胶电泳分析扩增产物。使用Cyber Safe染料制备1.6%琼脂糖凝胶。使用10微升多通道移液器，将8微升PCR样品转移至相应的孔中。同时，每行至少在一个孔中加入DNA分子量标记物。以约 100 伏电压电泳运行 10 分钟。通过紫外荧光观察条带，并拍照记录图像。记录所有三个重复扩增均成功的样品。如有必要，对扩增产物少于三次的样品重复进行逆转录-聚合酶链式反应（R-T-P-C-R）。扩增的病毒cDNA样品将使用V 3 0 2 F和S QV three R one引物通过DNA测序反应进一步验证。从冷冻柜中取出大包装二试剂，在室温下解冻。 根据待测样本数量计算并配制所需的试剂。使用多通道移液器将5 µL测序反应混合液分装至相应的孔板孔中。用Kimwipe纸覆盖孔板，置于一旁备用。同时，通过向剩余的PCR扩增产物中加入180微升无菌水，制备1:15的稀释液。取1微升稀释后的样品，用移液器将其加入相应孔板的底部。每次转移样品后，均须更换新的吸头。用八联管盖密封反应板，涡旋振荡1秒。离心反应板时，将转速设为1405 ×g。当转速达到1405 ×g时，停止离心。将培养板放入热循环仪中以进行反应。在每个孔中加入4微升3摩尔的醋酸钠和40微升预冷的95%乙醇，使DNA沉淀，重新密封盖子。离心培养板10秒，并轻敲培养板以去除任何气泡。将培养板置于 -20 摄氏度下 30 分钟至 2 小时。在 2000 ×g 条件下离心 20 分钟以回收 DNA。移除并弃去条状盖。将培养皿倒置在废液容器上方，倾倒出上清液。通过将倒置的培养皿在纸巾上轻压，去除残留的上清液。将两张纸巾对折，包裹住培养皿。将培养皿倒扣放入离心机中，以 140 5G 离心，当转速达到 140 5G 时停止离心。然后用155微升95%乙醇洗涤并倾去。随后重复离心步骤。让酶标板静置2至5分钟，以使残留的乙醇完全挥发。为了使 DNA 样本变性，使用多通道移液器将 10 微升高染料加入板上的所有孔中，包括空孔。用封膜密封反应板，并置于 90 摄氏度的热循环仪中孵育 2 分钟。最后，将样本板放入测序板中，并送入测序仪进行测序。一种可行的数据分析途径是使用软件 Recall 进行自动碱基识别，无需人工干预。Recall 是一款免费的基于自定义的碱基识别软件，登录后选择“浏览”选项以上传样本文件。找到原始测序数据文件，并上传最多 20 兆字节的数据。接下来，将参考序列设置为 V3。点击处理数据。在页面右侧选择生成的文件夹以显示样本列表。红色表示未通过，绿色表示已通过。点击特定样本并点击“查看”按钮后，您可查看序列，按照页面右侧的说明浏览序列，并将文件下载到一个压缩文件夹中。可通过基于群体测序生成的序列，利用基因型到表型的共受体算法推断病毒嗜性。在显著性设置的下拉菜单中，选择基于 MOTIVATE 临床数据分析得出的优化选项，对应 2% 和 5.75% 的假阳性率（FPR）。现在请选择上传或粘贴待分析序列。可接受 FASTA 文件格式。请勿添加其他内容，以获取用于预测对 CCR5 拮抗剂应答性的基因型 Tono FPRA。生成的 G2P 报告将提供 V3 环的氨基酸序列，并标示与非 R5 嗜性病毒相关的突变位点。在报告底部给出了假阳性率，并以对 CCR5 拮抗剂的应答情况对其进行解释。该报告可下载为 PDF 文件。如果某个样本的三个序列中任意一个被推断为非 R5 型，则该患者不太可能对 CCR5 拮抗剂产生预期的应答。HIV-1 V3 环的 RT-PCR 扩增产物进行凝胶电泳的结果表明，并非所有临床样本都能扩增出产物。通过召回读取，可以以色谱图形式显示扩增样品产生的序列。预期结果为混合信号较少的清晰序列。偶尔序列可能杂乱，难以进行准确的碱基判定。一些患者可能被鉴定为携带非 CCR5 利用型病毒，如上图所示。这些患者不太可能对 CCR5 拮抗剂治疗产生应答。然而，大多数患者被发现其病毒群体由 CCR5 利用型病毒组成，G2P 分析报告底部的绿色框即指示了这一点。因此，一旦掌握该技术，从开始到结束（从提取到分析）大约可在四天内完成。观看本视频后，您应能充分理解如何结合基于群体的测序方法与基因组表型生物信息学算法来预测病毒嗜性。好了，就到这里。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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