V3的HIV - 1取向的基因型推理使用人口为基础的测序

该程序的总体目标是通过对病毒包膜基因的 V 三个区域进行测序以开始从患者的血浆中提取 H-I-V-R-N-A 来推断 HIV 感染患者的病毒嗜性。接下来，使用嵌套的 R-T-P-C-R 扩增 HIV GP one 20 的 V 三个区域。然后使用凝胶电泳鉴定产物的存在，然后对扩增的 V 3 产物进行基于群体的测序。

最后，使用碱基调用软件分析序列，并使用基因组到表型算法推断共受体的使用。最终，这些结果可以通过基于人群的 HIVV 三环测序来显示患者的病毒群是 R 5 还是非 R 5。因此，与现有方法（例如基于表型细胞的测定）相比，该技术的主要优点是可以在任何配备测序设备的实验室中进行，从而在更短的时间内以更少的起始材料降低成本。

该技术与抗逆转录病毒治疗相关，因为它可以确定患者的病毒种群是否可能对 CCR 5 拮抗剂有反应 从 500 微升血浆中。使用 Easy mag 自动提取器提取 H-I-V-R-N-A。现在移至 PCR 洁净室设置 R-T-P-C-R，以确保对病毒种群进行充分采样。

计划在这个一步反应中一式三份进行每个逆转录反应。使用病毒 RNA 合成 CDNA，用 SQV 三个 F1 和 CO 6 0 2 引物修复特异性扩增 HIVV 三个区域。基于每个反应组分。

使用连续移液管制备足以扩增样品数量的储备混合溶液向 PCR 板的每个孔中加入 36 微升样品混合物。现在切换到多通道移液器，将 μL RNA 样品提取物转化到每个指定孔中。注意在每次添加之间更换提示。

转移完成后，用 PCR 条帽盖住孔。然后将 PCR 板放入热循环仪中，该热循环仪针对 HIVV 三个区域的一步 R-T-P-C-R 进行编程。对于巢式 PCR，使用 SQV 3 F 2 和 CD 4 R 引物修复。

计算在 PCR 洁净室中扩增样品数量所需的试剂量。生成巢式 PCR 混合物，然后使用连续移液管将干净的 PCR 板每孔等分 19 μL。完成 R-T-P-C-R 后，移至后放大室。

使用八通道多通道移液器将 1 微升 R-T-P-C-R 模板转移到巢式 PCR 混合物中。在每次添加之间更换提示。用 PCR 条盖盖住孔，然后将板转移到热循环仪进行扩增。

恢复到 25 摄氏度后，从热循环仪中取出板。为了确认 V 3 区已成功扩增，首先通过凝胶电泳分析产物。制备带有 Cyber Safe 凝胶染料的 1.6% AROS 凝胶。

使用 10 μL 多通道移液器。将 8 μL PCR 样品转移到相应的孔中。此外，将 DNA 分子量标准上样至每行至少一个孔中。

在大约 100 伏特的电压下运行凝胶 10 分钟。通过紫外荧光可视化条带，并通过摄影记录图像。记下所有一式三份扩增都成功的样品。

如有必要，对产物扩增次数少于 3 次的样品重复 R-T-P-C-R。扩增的病毒 CDNA 样品通过 DNA 测序进一步验证，反应将使用 V 3、0、2 F 和 S QV 三个 R one 引物进行。从冰箱中取出 big di 试剂并在室温下解冻。

计算并制备要运行的样品数量所需的试剂。使用多通道移液器将 5 μL 测序反应混合物分装到适当的板孔中。用 Kim 抹布盖住盘子，放在一边。

同时，通过向剩余的 PCR 产物中加入 180 μL 无菌水，制备 1 至 15 倍稀释的扩增 PCR 产物。将 1 微升稀释的样品移液到相应板的底部。样品转移完成后，孔总是在样品之间更换吸头。

用联排管盖密封板并涡旋一秒钟。要离心板，请将速度设置为 140 5G。当旋转速度达到 140 5G 时，停止旋转。

将板放入热循环仪中，让反应继续进行。在每个孔中，用 4 微升 3 摩尔乙酸钠和 40 微升冷冻 95% 乙醇沉淀 DNA，重新密封瓶盖。将板皮质 10 秒钟，然后轻敲板以去除任何气泡。

将板子放在零下 20 摄氏度下 30 分钟到 2 小时。以 2000 G 离心 20 分钟回收 DNA。取下并丢弃条盖。

将板子倒置在废液容器上，倒出 super natin。去除任何剩余的 super natin。通过在纸巾上吸干倒置的板。

折叠两张纸巾以夹住盘子。将板面朝下放入离心机中，并以 140 5G 离心。当它达到 140 5G 时停止旋转。

然后用 155 微升 95% 乙醇洗涤并倒出。然后重复离心。让板静置 2 到 5 分钟，让最后的乙醇蒸发。

为了使 DNA 样品变性，使用多通道移液器将 10 微升高染料分配到板上的所有孔中，包括空孔。用隔垫密封板，并置于 90 摄氏度的热循环仪中 2 分钟。最后，将样品板放入测序板和测序仪中。

一种可接受的数据分析途径是使用软件召回来执行自动碱基检出，无需人工干预。Recall 是一款免费的基于自定义的呼叫软件，登录并使用浏览选项选择要上传的示例文件。找到原始测序数据文件并上传最多 20 MB。

接下来，将参考序列设置为 V 3。单击 process data（处理数据）。在页面右侧选择生成的文件夹以显示示例列表。

红色的 API 失败了。那些绿色的已经通过。通过单击特定示例和"查看"按钮，您可以查看序列，按照页面右侧的说明浏览序列，将文件下载到 zip 文件夹中。

病毒嗜性可以从使用 geno 到 pheno 共受体算法的基于群体的测序生成的序列中推断出来。从显著设置的下拉菜单中，根据 motivate 2% 和 5.75%FPR 的临床数据分析选择优化。现在，选择上传或粘贴序列以进行分析。

FASTA 文件是可接受的。不要添加其他程序以获得对 CCR 五拮抗剂反应性的 geno Tono FPRA 预测因子。生成的 G two P 报告提供了氨基酸中的 V 3 环序列，并指示与使用病毒的非 R 5 相关的突变的相关位置。

在报告的底部，给出了假阳性率，并根据对 CCR 5 拮抗剂的反应进行了解释。此报告可以 PDF 文件下载。如果样本的三个序列中的任何一个被推断为非 R 5，则患者不太可能像预期的那样对 CCR 5 拮抗剂产生反应 RTP CR 的凝胶电泳 HIV 一 V 三环的扩增表明并非所有临床样本都能产生产品。

从扩增样品生成的序列可以在 Recall 读取的色谱图中可视化。预期序列干净，混合物很少。有时，序列可能会很混乱，不适合准确的碱基分配。

一些患者可能被识别为使用病毒的非 CCR 5，如此处所示。这些患者不太可能对 CCR 5 拮抗剂的治疗产生反应。然而，发现大多数患者的病毒种群由 CCR 5 组成，使用病毒，如 G two P 分析报告底部的绿色框所示。

因此，一旦掌握，这项技术可以从头到尾大约四天完成。从提取到分析。观看此视频后，您应该对如何使用基于群体的测序方法结合基因组表型生物信息学算法来预测病毒嗜性有很好的了解。

好了，就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。