使用一种基因编码的钙传感器来监测细胞凋亡过程中线粒体钙水平的动态变化
April 1st, 2011
本协议描述了线粒体钙通量实时荧光成像测量方法。该方法采用一个基于循环permutated YFP的双激励比例的钙传感器选择性表达在线粒体（比例pericam吨）的优势。
该程序的总体目标是监测活细胞中线粒体钙浓度的变化。这是通过在转染后 1 或 2 天首先使用钙指示蛋白比率公制 peram （靶向线粒体基质）对细胞进行横切来实现的。荧光显微镜和软件用于活细胞成像。
然后在添加钙动员激动剂后获取表达比率公制 peram 的细胞的图像。该程序的最后一步是对采集的图像进行定量分析。最终，通过对表达比率公制钙指示蛋白的活细胞进行荧光显微镜检查，可以获得显示线粒体钙浓度动态变化的结果。
与现有方法（例如使用合成钙指示剂测量钙水平）相比，该技术的主要优点是公制比率 peram 是遗传编码的，因此可以靶向线粒体或任何其他感兴趣的有机物。您好，我是 Ascar 博士，Benning 博士实验室的博士后，我今天将演示该程序 为了在前一天晚上开始实验方案板 helo 细胞，在放置在标准六孔培养板中的无菌玻璃盖玻片上以大约 70% 的密度进行转染，以便第二天进行转染。第二天，根据制造商的说明准备 DNA 脂质切除术 2000 复合物，其中包含 4 微克公制 peram 线粒体表达载体和 10 微升脂质切除术 2000，稀释在 0.5 毫升最佳培养基中，用于每个待转染的孔。
接下来，用 1.5 毫升不含抗生素的相同培养基替换每个孔中的 D-M-E-M-F-B-S HELOC 培养基。将 LIPECTOMY 溶液添加到 DNA 溶液中，并在复合物形成后轻轻混合。将 DNA 脂质切除术溶液滴加到每个要转染的孔中，轻轻摇动板混合，孵育后在 37 摄氏度、5% 二氧化碳的细胞培养箱中孵育 4 小时。
用含有抗生素的 D-M-E-M-F-B-S 替换培养基。在使用镊子成像之前，让细胞表达公制 peram 一到两天。轻轻地将装有 HELOC 细胞的盖玻片放入装有成像溶液的适当成像室中。
将成像室安装在倒置显微镜载物台中。接下来，使用 40 倍或更高的油浸物镜和 380 纳米的波长。为了找到包含一个或多个表达比率公制的细胞的感兴趣区域，这里使用 peram 380 纳米来识别细胞作为比率公制。
Peram 在此波长下对光漂白的抵抗力较差。确定感兴趣区域后，设置 495 和 380 纳米双激发软件。接下来，通过在 495 和 380 纳米处交替激发来依次获取图像。
在应用激动剂前至少 30 秒获取基线钙水平的图像。然后通过大量装置施用钙动员激动剂，注意应优化每种激动剂曝光时间和采集间隔的添加时间，以防止光漂白，同时仍允许足够的时间分辨率。实验完成后，可以离线分析图像。
要开始分析，请在字段的空白区域内选择一个感兴趣的区域，以根据需要减去背景荧光。接下来，将感兴趣区域中的 4 95 3 80 比率测量值导出到 Excel 或类似的绘图软件。这组图像显示了比率公制 peram 和线粒体的亚细胞定位。
左侧是表达公制 peram 比率的 helo 细胞的活细胞图像。中间是线粒体的荧光染色和选择性染料 MIT 追踪剂红色 CMX Ross。最后在右侧，此处显示的合并图像是线粒体中四个舌细胞表达比率公制 peram 的一系列伪彩 4 95、3 80 纳米比率图像，并且线粒体中表达比率公制 peram 的 hela 细胞的线粒体钙水平变化的量化显示在线粒体中表达比率公制 peram 的 hela 细胞图像中。
个体线粒体中钙反应的异质性以及线粒体的显着碎裂通过 0.5 微摩尔 stor 孢子蛋白处理 60 分钟是显而易见的。一些线粒体的钙呈振荡状增加（白色箭头所示），而其他线粒体的钙水平没有显著变化（黄色箭头所示）。该图揭示了使用 0.5 微摩尔 stor 孢菌素诱导细胞凋亡 120 分钟后单个肝细胞中整体线粒体钙水平的变化。
看完这个视频，你应该对如何使用选择性靶向线粒体基质的钙药蛋白 R 几何 peram 来测量线粒体钙水平响应各种 tli 的动态变化。
概述
本协议描述了一种使用基因编码钙指示剂，比值型pericam-mt进行线粒体钙通量实时测量的方法。该技术允许动态监测活细胞中的钙水平，为线粒体功能提供洞见。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 荧光成像
背景
- 线粒体钙水平对于细胞代谢和信号传导至关重要。
- 测量钙水平的传统方法通常依赖于合成指示剂。
- 基因编码指示剂在特异性和靶向性方面提供优势。
- 本研究利用比值型pericam-mt来增强线粒体钙动力学的成像。
研究目的
- 监测活细胞中线粒体钙浓度的变化。
- 展示使用基因编码钙指示剂定向到线粒体的用途。
- 提供详细的成像和分析线粒体钙通量的协议。
使用的方法
- 用比值型pericam-mt转染细胞。
- 使用荧光显微镜进行活细胞成像。
- 对钙测量进行双波长顺序激发。
- 定量分析荧光图像以评估钙动力学。
主要结果
- 成功测量了线粒体钙水平的动态变化。
- 观察到个体线粒体之间钙响应的异质性。
- 在某些处理条件下观察到线粒体的显著碎片化。
- 结果证明了比值型pericam-mt在实时成像中的有效性。
结论
- 该协议为研究线粒体钙动力学提供了可靠的方法。
- 像比值型pericam-mt这样的基因编码指示剂增强了成像能力。
- 该技术可以应用于各种实验条件来研究线粒体功能。
常见问题
Executive Industry Relevance
Monitoring mitochondrial calcium dynamics provides critical mechanistic insights into apoptosis pathways, enabling target validation in cell death mechanisms. This genetically encoded sensor approach supports predictive confidence in preclinical models by quantifying organelle-specific calcium fluxes with temporal resolution. The method facilitates early de-risking of therapeutic hypotheses involving mitochondrial dysfunction in disease models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of mitochondrial calcium as a regulator of apoptotic pathways for target hypothesis testing.
- Operational Value: Provides organelle-specific readouts that reduce ambiguity in mechanistic studies of cell death.
- Predictive Value: Supports functional validation of targets involved in calcium-mediated apoptosis through real-time flux measurements.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative ratiometric data enabling dose-response analysis of compounds affecting mitochondrial calcium.
- Operational Value: Compatible with standard wide-field microscopy, allowing integration into existing imaging platforms without specialized equipment.
- Scalability Value: Enables longitudinal tracking of calcium dynamics and mitochondrial morphology in live cells over hours.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links mitochondrial calcium changes to apoptotic outcomes, supporting biomarker relevance in disease models.
- Operational Value: Demonstrates utility with both ATP (physiological agonist) and staurosporine (apoptosis inducer), broadening applicability across experimental conditions.
- Translational Continuity: Facilitates progression from mechanism discovery to preclinical validation by providing dynamic, physiologically relevant readouts.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through mechanistic de-risking to preclinical assessment by providing dynamic, quantifiable data on mitochondrial function.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of calcium-dependent apoptotic pathways through real-time mitochondrial flux measurements.
- Screening: Enables assay-ready systems with standardized, reproducible calcium readouts for compound screening campaigns.
- Analytics: Delivers quantitative ratiometric outputs (495nm/380nm excitation ratio) that allow statistical comparison of calcium dynamics across conditions.
- Translational Research: Connects mitochondrial calcium changes to apoptotic phenotypes, supporting continuity from mechanism to phenotypic outcome.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging capability for studying mitochondrial dysfunction across multiple disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in apoptosis pathways.
- Operational Value: Enhances reproducibility through genetically encoded, organelle-targeted indicators that avoid dye leakage and artifacts.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, quantitative insights into mitochondrial mechanisms of compound action.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on mitochondrial calcium modulation profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology for transfection and live-cell imaging.
- Dependent on fluorescence microscopy with dual-excitation capability (380nm and 495nm) and standard filter sets.
- Necessitates standardization of image acquisition protocols and region-of-interest analysis across teams.
- Adaptation considerations include mitochondrial targeting efficiency and potential overexpression artifacts in different cell models.
- Practical limitations include photobleaching risks during long-term imaging and need for optimization of agonist exposure intervals.
