为极化上皮细胞注射质粒的小GTP酶的功能分析
2011年5月31日
本文详细介绍了在极化上皮细胞，利用显微注射技术的小GTP酶的过度表达和分析所涉及的程序。
该程序测定小 GTP ACE 对极化膜运输的影响。首先，将编码小 GTP ACE 和报告蛋白的 DNA 质粒共注射到极化细胞的细胞核中。然后在将报告蛋白停滞在内质网或 TGN 中的温度下表达 DNA，同时小 GTPA 在胞质溶胶中积累，在环 heide 存在下继续将报告蛋白追逐到细胞表面，以防止进一步的蛋白质合成。
最后，在细胞表面标记报告蛋白以进行免疫荧光分析。从该测定中获得的结果允许通过共聚焦显微镜观察表面定位的变化。现有方法（如转染）的这种技术的主要优点是，在通过显微注射实现的短时间过表达期间，次要效应很小，使我们能够研究目标蛋白质的主要效应。
该方法可以帮助回答细胞极性场中的关键问题，例如小 gtpa 如何调节极化膜运输。该方法的视觉演示至关重要，因为如果没有视觉帮助，很难解释成功显微注射所需的各个步骤。根据制造商的方案，使用 Sigma Aldrich 无内毒素 maxi 制备试剂盒分离无内毒素的血浆 DNA。对于本实验，使用三个孔径为 0.4 微米的透明 12 毫米 transwell 过滤器进行培养。
细胞将第 5 个 MDCK 细胞的 4 乘以 10 个放在每个过滤器上。两天后，在显微镜下检查培养物，以验证细胞是否在封闭的单层中生长。用于显微注射。
在显微注射当天，准备 360 x 15 毫米的 5 升 MM 生长培养基和 15 毫米 heis 板，并将它们放入 39 摄氏度的培养箱中。此外，准备三个 12 孔板，分别是 1 毫升 MEM 生长培养基加 50 毫摩尔 heis 和 0.1 毫克/毫升放线菌酮，并将它们放入 31 摄氏度的培养箱中。打开显微注射显微镜，像这个倒置显微镜一样设置，带有加热的载物台 10 倍和 32 倍物镜，以及一个英飞秒射流。
将加热台设置为 39 摄氏度。还要打开气台的氮气罐供应。现在用过滤水稀释 DNA 至终浓度为 0.2 毫克/毫升。
随后，在 einor 微量离心机中以 13， 000 RPM 离心 DNA 30 分钟。取出顶部并放入新管中。接下来，用手术刀片从培养皿中取出第一个过滤器来制备 MDCK 细胞，从过滤器支架上切下过滤器并将其放入准备好的 60 x 15 毫米板中，该板含有 5 毫升 39 摄氏度加热的 MEM 生长培养基和 50 毫摩尔 heis。
要称量培养板中的过滤器，请将手术刀片放在过滤器的中央，然后将培养板转移到显微镜的加热台上。将 2 至 3 μL 稀释的 DNA 装入显微注射针中。扭动针头的保护盖，让它掉到地板上。
要将针定位到支架中，请按进样的菜单键并确保阀门已关闭。将针头拧入其支架中。注意不要将针拧得太紧。
由于这可能会导致破损，请再次按下菜单键。因此，施加的补偿压力将防止介质在显微注射过程中被吸入针头。最后，点击纵杆以擦除存储的归位，以将针降低到细胞上。
使用 10 x 物镜，将针头放入液体上方的光束中。现在专注于细胞。将调焦轮向上旋转 180 度，再次向上对焦，然后找到指针。
慢慢将针头移至焦点。然后再次将其移出焦点。努力使细胞再次聚焦。
再次将针头置于焦点上。重复直到针接触介质表面，此时观察到光晕。继续到达细胞聚焦的点，但针在焦平面外仍然模糊不清。
现在切换到 32 倍目标并查找课程设置。通过用针尖接触根尖膜并减去约 10 微米来设置 Z 限制。由于细胞核位于顶膜下方约 10 微米处。
现在，尽快将针头从焦平面中拉出几微米。用针头瞄准原子核上方，然后按下并松开纵杆的注射按钮。从 95 PSI 开始，找到合适的注射压力。
如果压力过高，细胞就会爆炸。如果压力过低，则会出现一个白点，但不会发生任何其他情况。成功执行涉及相变的进样，而不改变细胞大小。
在位于细胞上的手术刀片孔内注射 100 到 500 个细胞。然后将带有培养皿和手术刀片的细胞放入 39 摄氏度的培养箱中，孵育 2 小时。最后，将细胞转移到准备好的 1 毫升 12 孔板中，MEM 加 50 毫摩尔 0.1 毫克/毫升，环 heide 并在 31 摄氏度下孵育 2 小时。
为了避免表达的 GFP 信号漂白，在所有后续表面染色过程中用铝箔覆盖以保护标本避光。将培养皿中的细胞放在冰上的金属板上并洗涤。使用冰冷的 PBS plus plus 后，将一块干净的多聚糖放在金属板上，用移液 30 微升抗体滴入可识别目标蛋白质胞外结构域的抗体。
现在将含有细胞的过滤器倒置在液滴上，并在过滤器的背面添加几滴抗体。在冰上孵育 1 小时。用冰冷的 PBS plus plus 洗涤细胞 3 次，并在室温下用 3% 多聚甲醛固定 15 分钟。
继续用 PBS plus plus 洗涤细胞一次，并在 PBS plus plus 中平衡 5 分钟。现在在封闭可渗透缓冲液中孵育细胞。在室温下孵育 1 小时，在 BPB 中稀释 1 至 200 的一抗以检测表达的 RAB GTP ACE 离心机，离心 10 分钟在 13， 000 RPM 移液管中，将 30 微升抗体溶液滴到置于湿室中的干净参数上。
将细胞倒置在过滤器上，放在抗体滴剂上，孵育 1 小时。在室温下，将细胞正面朝上放入 12 中。在与适当的二抗孵育后，在室温下用 BPB 在 30 分钟内用孔板和洗涤 5 次，包括洗涤步骤。
将过滤器上的细胞浸入去离子水中 3 次，然后将右侧朝上放在 10 微升安装座的微载玻片上，将 18 x 18 毫米的微型覆盖玻璃放在顶部，并使用面巾纸轻轻将盖玻片压在细胞上。最后，在仅编码 V-S-V-G-T-S-O 45 GFP 的质粒的模拟注射中用指甲油密封。蛋白质被递送到极化良好的 MDCK 细胞的基底外侧表面，这可以通过未极化细胞中的红色表面染色来判断。
一些 GFP 融合蛋白将被输送到顶膜。如果对照标本看起来像这样，则数据不可信，应该用更好的极化细胞重复实验。请注意，在 31 摄氏度的追逐过程中，并非所有表达到 GFP 融合的物质都会被输送到基底外侧膜，总蛋白的广泛细胞内绿色信号证明了这一点一旦掌握，这项技术在开发后大约需要 10 到 12 小时。
这项技术为膜运输领域的研究人员探索极化上皮细胞中的调节蛋白铺平了道路。看完这个视频，你应该对如何使用显微注射技术在极化上皮细胞中表达蛋白质有了很好的了解。
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概述
本文详细介绍了使用微注射技术在极化上皮细胞中过表达和分析小GTP酶的程序。该方法允许研究蛋白质的主要效应，同时最小化次生效应。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 神经科学
- 蛋白质分析
背景
- 小GTP酶在细胞过程中起着关键作用。
- 了解它们在极化细胞中的功能对于各种生物学应用至关重要。
- 微注射为研究这些蛋白质提供了独特的方法。
- 以前的方法可能会引入复杂结果的次生效应。
研究目的
- 分析小GTP酶对极化膜运输的影响。
- 使用共聚焦显微镜可视化蛋白质定位的变化。
- 建立一种可靠的方法来研究细胞中蛋白质动力学。
使用的方法
- 将编码小GTP酶和报告蛋白的DNA质粒共同注射到细胞核中。
- 在特定温度下表达DNA以控制蛋白质定位。
- 使用环己酰亚胺防止分析过程中进一步的蛋白质合成。
- 在细胞表面对报告蛋白进行免疫荧光标记。
主要结果
- 成功可视化了极化细胞中表面定位的变化。
- 在短期过表达期间展示了最小的次生效应。
- 提供了对细胞环境中小GTP酶动力学的见解。
- 结果通过共聚焦显微镜技术得到验证。
结论
- 微注射技术对于研究小GTP酶是有效的。
- 它允许对蛋白质表达和定位进行精确控制。
- 研究结果有助于更好地理解极化细胞中的膜运输。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables rapid, high-level overexpression of regulatory proteins in polarized epithelial cells with minimal secondary effects, supporting mechanistic de-risking in early discovery. By isolating the primary functional impact of small GTPases on membrane trafficking, it improves target validation confidence and predictive value for downstream screening. The approach provides a disease-relevant system for studying basolateral sorting pathways relevant to epithelial barrier function and drug absorption.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by testing how specific GTPase mutants affect polarized protein trafficking.
- Operational Value: Enables rapid functional assessment within 10–12 hours, accelerating early-stage target interrogation.
- Predictive Value: Reduces mechanistic ambiguity by minimizing compensatory responses during short overexpression windows.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates validated polarized cell systems expressing reporter proteins like VSVGts045 for basolateral sorting analysis.
- Quantitative Output: Enables surface localization measurement via immunofluorescence and confocal microscopy for comparative condition testing.
- Reproducibility: Standardized microinjection and temperature-shift protocol supports consistent results across experiments.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models epithelial polarity mechanisms implicated in barrier function and nutrient/drug transport.
- Translational Continuity: Links discovery-phase target modulation to preclinical validation of membrane trafficking pathways.
- Risk-Adjusted Decisions: Supports go/no-go decisions by clarifying whether a target modulates basolateral delivery in a polarized context.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to validate targets influencing epithelial membrane dynamics before assay development and lead identification stages.
- Discovery Biology: Tests how small GTPase activity states regulate apical-basolateral protein sorting, clarifying pathway involvement.
- Screening: Prepares standardized polarized monolayers for consistent reporter protein trafficking assays.
- Analytics: Provides quantitative readouts of surface localization changes to compare effector conditions.
- Translational Research: Connects GTPase function to epithelial barrier phenotypes relevant to absorption and toxicity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating multiple regulatory proteins in polarized trafficking.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Mechanistic de-risking of targets involved in polarized membrane trafficking through direct functional testing.
- Operational Value: High reproducibility and standardization via defined microinjection, temperature shift, and cycloheximide blockade steps.
- Strategic Value: Faster target triage by minimizing confounding secondary effects seen with prolonged overexpression.
- Portfolio Impact: Enables evidence-based prioritization of targets based on functional impact in disease-relevant epithelial systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microinjection techniques and polarized epithelial cell culture.
- Dependent on specialized equipment including heated-stage microscope and microinjection apparatus.
- Needs standardized protocols for DNA preparation, temperature cycling, and cycloheximide treatment.
- Must account for variability in monolayer polarization quality across cell preparations.
- Limited to adherent polarized cell models; not applicable to suspension or non-polarized systems.
