比较GTP酶结合蛋白的使用竞争性试验的亲和

该程序的总体目标是在仔细控制的核苷酸加载条件下比较 Row 家族 GT P ACE 的蛋白质结合伴侣的相对亲和力。这是通过首先纯化假定的竞争性结合伴侣来实现的，每个伴侣都用相同的标签标记，例如绿色荧光蛋白或 GFP。第二步是纯化感兴趣的 GTPA。

例如，RAC 1 并加载适当的核苷酸，以实现所需的 GTPA 信号转导状态。接下来，将载有核苷酸的 gtpa 与固定量的一种结合竞争物和增加量的其他结合竞争物一起孵育，以获得滴定结合曲线。最后一步是通过蛋白质印迹分离与固定化 GT 酶结合的蛋白质，并探测膜中两个结合伴侣之间共享的 GFP 标签。

最终，Western blot 用于鉴定 GTP 酶捕获相似量的每个 GFP 标记的结合伴侣的相对浓度。与共沉淀等现有方法相比，该技术的主要优点是 gtpa 的蛋白质结合特性由细胞中结合的核苷酸决定。结合的核苷酸不稳定，因此难以解释蛋白质结合数据。

从纯化 GST 标记的 G tpa 和 gtpa 结合蛋白的表达开始此过程，如文本方案中所述。在磷酸盐缓冲液或 PBS 中对转染细胞的培养瓶进行 RIN，并将培养瓶排空 5 分钟。吸出游离液体，然后在 500 μL 裂解缓冲液中刮下细胞，放入微量离心管中，混合细胞，在 4 摄氏度下倒置裂解 30 分钟。

在裂解过程中，用新鲜裂解缓冲液沉淀物洗涤两批 40 μL 的 GFP 捕获珠子 3 次。珠子在 2， 700 倍 G 之间保持 2 分钟。裂解后，以 21， 000 倍 G 离心 10 分钟，澄清裂解物。

将每种竞争蛋白的澄清裂解物转移至分离洗涤的 GFP 捕获珠。让 GFP 融合蛋白结合 2 小时，在 4 摄氏度下倒置混合。在裂解缓冲液中洗涤加载的 GFP 捕获珠子两次，在竞争中洗涤两次。

以 2， 700 倍 G 的浓度结合沉淀缓冲液珠子，两次洗涤之间保持 2 分钟。通过加入 40 μL 0.2 摩尔甘氨酸并上下吹打 30 秒来洗脱 GFP 融合蛋白，立即以 21， 000 倍 G 沉淀珠子 60 秒，然后将液体转移到含有 4 微升 1 摩尔 tris HCL 的新离心管中，快速执行此步骤，以限制对纯化蛋白质的损伤。通过蛋白质印迹分析每种纯化蛋白的一微升，并用抗 GFP 抗体探测，以根据制造商的方案使用定量印迹系统确定相对产量。

通过添加竞争结合缓冲液来平衡摩尔蛋白浓度。取 90 微升准备好的 GST 架 1 珠子，用核苷酸上样缓冲液洗涤 3 次，使用磁珠分选仪在每个步骤中沉淀珠子。从磁珠中吸出缓冲液，并根据是否需要 G-D-P-G-T-P 或不需要核苷酸上样而加入 100 μL 核苷酸上样缓冲液。

对于竞争实验，将 12 微升 100 毫摩尔 GDP、12 微升 10 毫摩尔 GTP γ S 或无核苷酸添加到 60 微升 GST 机架一珠中，用于核苷酸加载对照。将剩余的珠子分成三个 10 微升季铵盐，并向每个试管中加入 2 微升 100 毫摩尔 GDP、2 微升 10 毫摩尔 GTP γ S 或无核苷酸。将微珠混合物在 30 摄氏度下搅拌孵育 30 分钟。

稳定核苷酸结合的架子，向实验混合物和对照混合物中加入一摩尔氯化镁进行竞争结合。设置六个微量离心管。每个含有 200 μL 竞争结合缓冲液。

每管还应包含 10 μL 载有核苷酸的架子、1 个珠子和 5 μL 的架子。一种结合蛋白 A 作为恒定结合蛋白，向每根试管中加入 0 1 2 0.55、10 或 20 微升机架 1 结合蛋白 B 作为可变结合蛋白。这些体积假设恒定和可变结合蛋白的储备浓度大致相等，并且可能需要调整。

通过添加竞争结合缓冲液，将结合混合物的总体积补足至 235 μL。接下来，设置一个含有 200 微升竞争缓冲液的微量离心管。10 微升实验核苷酸加载架、一个珠子和 10 微升架一个结合蛋白 A.然后按照文本方案中的说明设置 G-D-P-G-T-P γ S 和无核苷酸对照管。

后，在 4 摄氏度下倒置混合试管 2 小时。用竞争结合缓冲液洗涤珠子 3 次。最后，在 20 μL 还原性样品缓冲液中洗脱结合的蛋白质。

C.Propeller 结构域中对纯化的 GFP RCC 2 和 GFP Corona 的 GFP 标签进行定量蛋白质印迹显示，上带 GFP RCC 2 中的蛋白质丰度是下带的 1.4 倍，应稀释以达到竞争实验的一比一摩尔比。对照实验表明，机架 1 的核苷酸加载状态决定了结合特异性，在一个 C 螺旋桨结构域中，针对固定体积的等摩尔 GFP Corona 滴定增加的 GFP RCC 2 体积并印迹。与机架 1 结合的蛋白质允许可视化结合蛋白质的相对变化，在同一图表上绘制两个竞争对手的 GFP 条带强度，并确定线相交的点，从而可以识别平衡时可变结合蛋白的体积。

但是，必须注意确保竞争对手之间的相互作用或过量的诱饵 gtpa 等问题不会影响实验。如图所示，增加一个竞争对手而不损失另一个竞争对手，表示在尝试此过程时出现问题。重要的是要记住检查大量竞争性结合伴侣之间存在互惠关系。

有许多问题可能会扭曲结果，或者只要通过检查数据来识别它们就可以解决。