使用竞争实验比较GTP酶结合蛋白的亲和力

本实验的总体目标是在严格控制的核苷酸加载条件下，比较蛋白质结合伴侣对 Row 家族 GT P ACE 的相对亲和力。为此，首先纯化假定的竞争性结合伴侣，每个伴侣均标记相同的标签，例如绿色荧光蛋白（GFP）；第二步是纯化目标 GTPA。

例如，将RAC1与适当的核苷酸结合，以达到所需的GTPA信号状态。接下来，将加载了核苷酸的GTPA与固定量的一种结合竞争物以及递增浓度的另一种结合竞争物共同孵育，以获得滴定结合曲线。最后一步是通过蛋白质印迹分离与固定化GTP酶结合的蛋白质，并使用针对两种结合伴侣共有的GFP标签的探针检测膜上的信号。

最终，Western blot 用于确定 GTP 酶捕获每种 GFP 标记的结合伴侣蛋白时的相对浓度。与现有的共沉淀等方法相比，该技术的主要优势在于 GTP 酶的蛋白质结合特性由细胞内结合的核苷酸决定。由于结合的核苷酸具有不稳定性，使得蛋白质结合数据的解释变得困难。

按照文本方案中的详细步骤，首先纯化GST标记的G tpa，并表达gtpa结合蛋白。用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗转染细胞的培养瓶，倒置培养瓶静置五分钟。吸除多余液体后，加入500微升裂解缓冲液刮取细胞至微量离心管中，于4摄氏度通过倒置混匀裂解细胞30分钟。

裂解过程中，用新鲜裂解缓冲液将两份各40 µL的GFP捕获珠子洗涤三次，每次洗涤之间在2,700 × g下离心沉淀2分钟。裂解完成后，将裂解液在21,000 × g下离心10分钟以澄清。

将每种竞争蛋白的澄清裂解液分别转移至已洗涤的GFP捕获珠中。在4摄氏度下颠倒混匀，孵育两小时，使GFP融合蛋白结合。用裂解缓冲液将负载的GFP捕获珠洗涤两次，再用竞争缓冲液洗涤两次。

洗涤期间，将结合缓冲液中的珠子在 2,700 × g 条件下离心 2 分钟。通过加入 40 µL 0.2 M 甘氨酸并上下吹打 30 秒来洗脱 GFP 融合蛋白，立即在 21,000 × g 条件下离心 60 秒，将上清液转移至含有 4 µL 1 M Tris-HCl 的新离心管中。此步骤需快速操作，以尽量减少对纯化蛋白的损伤。使用定量印迹系统，按照生产商说明书，取 1 µL 每种纯化蛋白进行 Western 印迹分析，并用抗 GFP 抗体探针检测，以确定相对得率。

通过添加竞争结合缓冲液来调整蛋白质的摩尔浓度至相等。取90微升制备好的GST架一珠子，每次使用磁性粒子分选器沉淀珠子，用核苷酸加载缓冲液洗涤三次。从珠子中吸除缓冲液，并根据是否需要G-D-P-G-T-P或无核苷酸加载，加入100微升核苷酸加载缓冲液。

进行竞争实验时，向 60 微升 GST Rack1 珠中加入 12 微升 100 毫摩尔 GDP、12 微升 10 毫摩尔 GTPγS 或不加核苷酸，作为核苷酸负载对照。将剩余的珠子均分为三份，每份 10 微升，分别向每个管中加入 2 微升 100 毫摩尔 GDP、2 微升 10 毫摩尔 GTPγS 或不加核苷酸。将珠子混合物在 30 摄氏度下振荡孵育 30 分钟。

通过向实验组和对照组的反应体系中各加入一摩尔浓度的氯化镁，以稳定结合了核苷酸的支架结构，从而进行竞争结合实验。准备六根微量离心管，每管含有 200 µL 竞争结合缓冲液。

每个离心管还应含有 10 µL 核苷酸加载架溶液、一颗磁珠以及 5 µL 架溶液。向每管中加入 0、1、2、0.55、10 或 20 µL 的架一结合蛋白 A 作为恒定结合蛋白，同时加入架一结合蛋白 B 作为可变结合蛋白。这些体积基于恒定与可变结合蛋白的储备浓度大致相等的前提，可能需要根据实际情况进行调整。

加入竞争性结合缓冲液，将结合反应体系的总体积补至235微升。接着，准备一个微型离心管，其中加入200微升竞争性缓冲液、10微升实验核苷酸负载的RACK1珠粒、10微升RACK1结合蛋白A。然后按照文本方案所述，设置GDP-GTPγS和无核苷酸对照管。

将试管在4°C下孵育两小时，孵育后通过倒置混匀。用竞争结合缓冲液洗涤磁珠三次。最后，用20 µL还原性上样缓冲液洗脱结合的蛋白质。

对纯化的GFP RCC2和GFP Corona in one C-Propeller结构域的GFP标签进行定量Western印迹分析，结果显示上条带（GFP RCC2）的蛋白丰度是下条带的1.4倍，因此在竞争实验中需进行稀释以达到1:1的摩尔比。对照实验表明，RACK1的核苷酸结合状态决定了其结合特异性，通过将不同体积的GFP RCC2与固定体积的等摩尔GFP Corona in one C-Propeller结构域进行滴定并进行印迹分析。结合到RACK1上的蛋白可通过在同一图中绘制两种竞争蛋白的GFP条带强度，观察两条线的交点，从而可视化结合蛋白的相对变化，并确定平衡时可变结合蛋白的体积。

然而，必须注意确保竞争者之间的相互作用或过量的诱饵GTPA等问题不会影响实验结果。在尝试该实验流程时，若出现如本例中一个竞争者的信号增强而另一个未相应减少的情况，则表明存在问题。需要牢记的是，应验证相互竞争的结合伙伴的丰度之间是否存在此消彼长的对应关系。

有许多问题可能会扭曲结果，但只要通过检查数据识别出来，这些问题通常都可以解决。