微操作系统技术允许分析骨架调节器的形态发生动力学和营业额

结合使用显微作和光学显微镜技术（如 FRAP 和光激活）的总体目标是在不同条件或信号通路依赖性方式下监测参与细胞骨架调节和迁移的蛋白质的时空动力学。此处讨论的显微作方法可用于将任何类型的分子直接递送到细胞中，以及在确定的亚细胞位置内对蛋白质活性进行光诱导作。因此，这里介绍的技术的主要优点是它们允许确定蛋白质对细胞施加的瞬时效应，同时跟踪它们在整个细胞中的活动性。

要开始此过程，将先前生长的 B16-F1 细胞以 1 比 5 的比例传代到 3 厘米的塑料培养皿中。吸出细胞培养基。用 PBS 洗涤细胞，吸出 PBS 并添加胰蛋白酶 EDTA 以分离细胞。

向胰蛋白酶消化的细胞中加入细胞培养基。重新悬浮细胞并将其转移到猎鹰管中，然后以 1000 rpm 离心 3 至 5 分钟。将 B16-F1 细胞放入 3 cm 培养皿中并扩散至少 6 小时后，在含有 150 毫摩尔氯化钠的溶液中加入 500 ng DNA 构建体和 1 μL 转染试剂的混合物，转染 B16-F1 细胞。

对于 B16-F1 细胞，用 150 μL 层粘连蛋白溶液包被 15 毫米盖玻片，并在室温下孵育 1 小时。对于 NIH 3T3 细胞，用纤连蛋白溶液包被盖玻片，并在室温下孵育 1 小时。孵育后，用 PBS 洗涤层粘连蛋白和纤连蛋白孵育的盖玻片，然后吸出 PBS。

2 毫升 NIH 3T3 成纤维细胞以 1 比 20 的比例从汇合培养皿中接种到纤连蛋白涂层的盖玻片上。以 1 比 30 的比例从汇合培养皿中吸取 2 毫升转染的 B16-F1 细胞到层粘连蛋白包被的盖玻片上。在此之后，允许细胞在层粘连蛋白和纤连蛋白包被的盖玻片上扩散，在显微镜检查前在 37 摄氏度的组织培养箱中过夜。

将盖玻片的电池面朝上放在导热 RC-26 铝制成像室上。接下来，在盖玻片顶部放置塑料密封剂，在盖玻片和腔室之间形成牢固密封，用腔室的滑动夹拧紧塑料密封剂进行固定，以避免介质泄漏。现在，将 37 摄氏度预热的显微镜培养基吸取到中心区域。

将热检测器插入腔室的指定插槽中，并将腔室的电极连接到保持 37 摄氏度恒定温度的 TC-324B 自动温度控制器上。将先前解冻的蛋白质溶液以 10， 000G 离心至少 30 分钟，以去除显微注射毛细管中存在的蛋白质聚集体，这些聚集体会导致针头堵塞。使用灵活的移液器吸头，从背面向显微注射针头加载 1 微升蛋白质溶液。

如果针尖有气泡，请轻轻敲击针根以将其去除。然后小心调整显微作设备上的持针器。将显微注射针拧入针架后，使用显微注射压力装置对针头施加压力，然后将针尖移位到细胞培养基中。

接下来，使用低放大倍率物镜将针头定位在视野中，然后找到感兴趣的细胞并逐渐将针头降低到细胞上方。对于显微注射，轻轻触摸细胞的质膜，这可能足以穿透细胞或通过非常轻敲显微镜设置来帮助瞬时膜破裂。一旦看到流入细胞，就通过将针尖向上移动到培养基中来停止注射过程。

在触发激光之前，切换到 GFP 通道并启动图像延时采集。在此之后，在查看显示时在 GFP 通道上手动绘制要光漂白的区域。在图像采集开始后至少 3 到 4 帧，通过 405 纳米激光的手动触发开始光漂白。

在软件中将 GFP 488 纳米图像采集设置为 500 毫秒曝光和 1500 毫秒时间间隔。接下来，通过标记波长序列方块并在采集波长菜单中选择所需的通道数，调整用于采集双通道或三通道延时视频的软件设置。在触发激光之前，启动图像延时采集并在相差通道上手动绘制要光激活的区域 viewing显示。

在此之后，在图像采集开始后至少 3 到 4 帧通过 405 纳米激光的手动触发启动光激活。要分析 FRAP 结果，请在 MetaMorph 软件上打开从 VisiView 派生的延时电影。通过使用 MetaMorph 手动绘制各个区域，得出荧光恢复的每个时间点的光漂白区域的强度值。

在层状足状体的尖端绘制一个覆盖全部或部分光漂白区域的形状，并在需要时在后续帧上手动调整其位置，以便在前进尖端位移期间跟踪相应区域的层状足密度随时间的变化。对于背景校正和光漂白采集，分别分析细胞外部和内部的区域。选择感兴趣区域后，使用菜单 measure region measurements（测量区域测量）在 MetaMorph 上提取其强度值。

确保在配置菜单中选择 lapsed time （经过的时间） 和 average intensity （平均强度） 选项。单击 open log 并选择 Dynamic Data Exchange。然后单击 确定 打开一个 excel 电子表格，并再次单击 打开日志 按钮将 MetaMorph 值粘贴到 excel 中。

通过将强度值粘贴到包含适当公式的 excel 电子表格中，使用从 MetaMorph 得出的强度值来计算 FRAP 荧光恢复曲线。光漂白区域的荧光恢复归一化为背景和内部区域。为了计算荧光恢复的一半时间，将荧光恢复曲线的值和相应的时间粘贴到 SigmaPlot 中，然后使用动态拟合向导指数上升到最大值工具执行曲线拟合，根据最佳曲线拟合选择单指数或双指数函数。

通过求解所选函数获得的参数可以粘贴到包含适当公式的 excel 电子表格中，该公式允许以秒为单位计算相应的恢复半衰时间。为了测量光激活肌动蛋白在激活时的扩散及其在特定区域（如板状足）内的积累，使用 MetaMorph 来确定各个区域以及细胞外随时间变化的强度，以确定用于标准化的背景荧光。为了检查光激活肌动蛋白从激活区移出的精确速率或其在板状足中的掺入速率，从先前从 MetaMorph 得出的数据生成荧光曲线。

将用于归一化的背景区域、光活化胞质区域或要研究的层状足部区域的强度值粘贴到包含适当公式的 excel 电子表格中。此处显示了显微注射小 GTP 酶 Rac1 前后 NIH 3T3 成纤维细胞的面部对比图像。在显微注射后大约 12 分钟，细胞的形态发生了变化，这表明注射成功。

这里显示了层状足尖处未漂白分子对漂白 EGFP VASP 的回收。在这个特定示例中，回收荧光在漂白前稳定在大约 80% 的荧光处。光活化后，光活化的 GFP 肌动蛋白迅速扩散出胞质区域。

一小部分光活化肌动蛋白单体转移到前面，在板状伪足中产生快速的荧光爆发。在远离光活化区域的板状伪足中，荧光的掺入率非常低，因为光活化肌动蛋白单体的分数在通过胞质溶胶的过程中被未活化的单体稀释。随着光活性 GFP 肌动蛋白随着时间的推移从光激活区域扩散出去，它不断被非光激活的非荧光肌动蛋白取代。

因此，观察到该区域的荧光强度逐渐降低。随着时间的推移，靠近胞质激活区的板状伪足迅速掺入荧光肌动蛋白。接下来的荧光下降仅仅是由于肌动蛋白解聚和单体从板状足处扩散开来。

因此，当在单个显微镜系统上进行实验时，显微注射与 FRAP 或光活化技术的组合实际上可以在几分钟内完成，具体取决于所研究蛋白质的性质。永远记住，在显微作之前、期间和之后或暴露于激光之后要让自己保持快乐。对于 FRAP 和光活化，所选区域在整个电影持续时间内保持其结构完整性尤为重要。

显微注射程序可以通过质膜渗透性药物或细胞骨架抑制剂的局部应用来补充，以便在亚细胞水平上解决给定治疗的直接后果。显微作技术为探索细胞骨架成分和复合物的扩散特性和亚细胞动力学以及了解调节细胞形态发生的二手途径铺平了道路。观看此视频后，您应该对如何跟踪和监测胞质蛋白的时空动力学、掺入细胞骨架内部或驻留在不同亚细胞器中的蛋白质的时空动力学有很好的了解，最终揭示细胞调节的动力学。