允许分析细胞骨架调节因子形态发生动力学与周转的显微操作技术

结合显微操作与荧光漂白恢复（FRAP）和光激活等光学显微技术，其总体目标是监测在不同条件或信号通路依赖性情况下，参与细胞骨架调控和细胞迁移的蛋白质的时空动态变化。本文讨论的显微操作方法可用于将任意类型的分子直接递送至细胞内，也可用于在特定亚细胞区域诱导光控蛋白质活性的调控。因此，这些技术的主要优势在于，能够在追踪蛋白质在整个细胞内运动性的同时，确定蛋白质对细胞产生的瞬时效应。

开始此操作时，将先前培养的 B16-F1 细胞按 1:5 的比例传代至一个 3 厘米的塑料培养皿中。吸除细胞培养基，用 PBS 洗涤细胞，吸除 PBS 后加入胰蛋白酶-EDTA 溶液以解离细胞。

向消化后的细胞中加入细胞培养基。重悬细胞并转移至离心管中，随后以1000 rpm离心3至5分钟。将B16-F1细胞接种至3厘米培养皿中，静置至少6小时使其充分铺展后，通过加入含有500纳克DNA构建体和1微升转染试剂的混合物进行转染，该混合物溶于150毫摩尔/升氯化钠溶液中。

对于 B16-F1 细胞，用 150 微升层粘连蛋白溶液覆盖 15 毫米的盖玻片，并在室温下孵育 1 小时。对于 NIH 3T3 细胞，用纤连蛋白溶液覆盖盖玻片，并在室温下孵育 1 小时。孵育后，用 PBS 洗涤经层粘连蛋白和纤连蛋白孵育的盖玻片，然后吸除 PBS。

将汇合的 NIH 3T3 成纤维细胞以 1:20 的比例接种 2 毫升至纤维连接蛋白包被的盖玻片上。将转染的 B16-F1 细胞以 1:30 的比例吸取 2 毫升接种至层粘连蛋白包被的盖玻片上。随后，将细胞置于 37 摄氏度的组织培养孵育箱中，使其在包被了层粘连蛋白和纤维连接蛋白的盖玻片上贴壁过夜，之后进行显微镜观察。

将盖玻片细胞面向上放置于导热的 RC-26 铝制成像腔室中。接着，在盖玻片上方放置一个塑料密封圈，使盖玻片与腔室之间形成严密密封，并通过拧紧腔室的滑动夹具固定塑料密封圈，以防止培养基泄漏。随后，用移液器将预热至 37 摄氏度的显微镜成像培养基加入腔室中央区域。

将热探测器插入腔室的指定插槽中，并将腔室的电极连接至TC-324B型自动温度控制器，以维持37摄氏度的恒定温度。将先前解冻的蛋白质溶液在10,000G条件下离心至少30分钟，以去除可能堵塞显微注射毛细管的蛋白质聚集体。使用柔性移液器吸头从后端向显微注射针中加入1微升蛋白质溶液。

如果针尖存在气泡，应轻轻敲击针的基部以去除气泡。然后仔细调整显微操作装置上的持针器。将显微注射针旋入持针器后，在将针尖移入细胞培养基之前，需使用显微注射压力装置对针施加压力。

接下来，使用低倍物镜将针头置于视野中，找到目标细胞，并逐渐将针头降低至细胞上方。进行显微注射时，轻轻接触细胞的质膜，这可能足以刺穿细胞，或通过极其轻柔地敲击显微镜装置辅助实现细胞膜的瞬时破裂。一旦观察到液体流入细胞，立即将针尖上移至培养基中，停止注射过程。

在触发激光之前，切换至GFP通道并启动图像时间序列采集。随后，在观察显示器的同时，手动绘制GFP通道中需要进行光漂白的区域。在图像采集开始后至少三到四个帧之后，通过手动触发405纳米激光来启动光漂白。

在软件中将GFP 488纳米图像采集的曝光时间设置为500毫秒，时间间隔设置为1500毫秒。接下来，通过勾选波长序列方框并在采集波长菜单中选择所需的通道数量，调整软件设置以获取双通道或三通道延时成像视频。在触发激光之前，启动图像延时采集，并在观察显示器的同时，于相差通道上手动绘制需要光激活的区域。

在开始图像采集后至少三到四个帧，通过手动触发405纳米激光器启动光激活。为分析FRAP结果，使用MetaMorph软件打开由VisiView生成的时间序列视频。在MetaMorph中通过手动绘制相应区域，获取每个荧光恢复时间点的光漂白区域的强度值。

在片状伪足的尖端绘制一个形状，覆盖光漂白区域的全部或部分，并在后续帧中根据需要手动调整其位置，以追踪该区域在片状伪足前进过程中随时间推移的荧光强度变化。为校正背景信号和光漂白效应，应分别分析细胞外和细胞内的区域。选定感兴趣区域后，通过 MetaMorph 软件中的“测量区域”菜单提取其强度值。

在配置菜单中确保已选择“经过时间”和“平均强度”选项。单击“打开日志”，选择“动态数据交换”。然后单击“确定”以打开 Excel 电子表格，再次单击“打开日志”按钮，将 MetaMorph 数值粘贴到 Excel 中。

使用 MetaMorph 获得的强度值，将这些强度值粘贴到包含适当公式的 Excel 电子表格中，以计算 FRAP 荧光恢复曲线。光漂白区域的荧光恢复需相对于背景和内部区域进行归一化处理。在计算荧光恢复半时间时，将荧光恢复曲线的数值及其对应时间点粘贴至 SigmaPlot，然后使用动态拟合向导中的“指数上升至最大值”工具进行曲线拟合，根据最佳拟合效果选择单指数或双指数函数。

通过求解选定函数获得的参数可粘贴至包含相应公式的 Excel 电子表格中，从而计算出以秒为单位的相应恢复半衰期。为测量光激活肌动蛋白在激活后的扩散情况及其在特定区域（如片状伪足）内的累积情况，可使用 MetaMorph 软件测定相应区域以及细胞外区域随时间变化的荧光强度，以确定背景荧光用于归一化。为分析光激活肌动蛋白从激活区域向外位移的确切速率，或其在片状伪足内整合的速率，可基于先前由 MetaMorph 获得的数据生成荧光强度曲线。

将用于归一化的背景区域、光激活的细胞质区域或待研究的片状伪足区域的强度值，输入至包含适当公式的 Excel 电子表格中。此处展示了一株 NIH 3T3 成纤维细胞在显微注射小 GTP 酶 Rac1 前后的相衬图像。在显微注射后约 12 分钟，细胞形态发生改变，表明注射已成功。

此处展示了在片状伪足尖端，非漂白的EGFP VASP分子对已漂白分子的回收过程。在此特定示例中，漂白后荧光恢复的平台期约为漂白前荧光强度的80%。光激活后，光激活的GFP标记肌动蛋白迅速从细胞质区域扩散出去。

部分光激活的肌动蛋白单体转位至细胞前缘，在片状伪足中产生快速的荧光爆发。随着光激活的肌动蛋白单体在穿越细胞质的过程中与非激活的单体混合而被稀释，距离光激活区域较远的片状伪足中的荧光掺入量明显降低。随着时间推移，光激活的GFP标记肌动蛋白从光激活区域扩散出去，持续被非光激活的非荧光肌动蛋白所取代。

因此可观察到该区域荧光强度逐渐降低。随着时间推移，靠近胞质激活区域的片状伪足迅速掺入荧光标记的肌动蛋白。随后荧光的下降仅仅是由于肌动蛋白解聚以及单体从片状伪足区域扩散离去所致。

因此，当在单一显微成像系统上进行实验时，显微注射与FRAP或光激活技术的结合通常可在数分钟内完成，具体时间取决于所研究蛋白质的性质。在显微操作之前、期间和之后，或在暴露于激光照射后，务必始终保持良好的身心状态。对于FRAP和光激活实验，尤其重要的是所选区域在整个成像过程中必须保持其结构完整性。

通过局部施加细胞膜通透性药物或细胞骨架抑制剂，可进一步补充显微注射技术，从而在亚细胞水平上研究特定处理的即时效应。显微操作技术为探索细胞骨架组分及复合物的扩散特性与亚细胞动态行为，以及理解调控细胞形态发生的间接通路开辟了道路。观看本视频后，您应能够充分掌握如何追踪和监测细胞质蛋白、整合于细胞骨架内肌动蛋白中的蛋白，以及定位于不同亚细胞器中的蛋白的时空动态，最终揭示细胞调控的动力学过程。