Name: 微操作系统技术允许分析骨架调节器的形态发生动力学和营业额 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: 学习利用FRAP和光激活等显微操作技术研究迁移细胞中细胞骨架调节蛋白的时空动态。该方法可实时追踪蛋白质运动性参数与周转率，为细胞生物学和神经科学研究提供重要工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢德国研究基金会（DFG）提供的资金支持（项目编号 RO2414/5-1，授予 KR）。

<ol><li>Day, R. N., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluorescent+protein+palette%3A+tools+for+cellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging.</a> Chem Soc Rev. 38 (10), 2887-2921 (2009).</li>
<li>Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+fluorescence+microscopy+techniques--FRAP%2C+FLIP%2C+FLAP%2C+FRET+and+FLIM%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Advanced fluorescence microscopy techniques--FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM.</a> Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).</li>
<li>Koestler, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arp2%2F3+complex+is+essential+for+actin+network+treadmilling+as+well+as+for+targeting+of+capping+protein+and+cofilin%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Arp2/3 complex is essential for actin network treadmilling as well as for targeting of capping protein and cofilin.</a> Mol Biol Cell. 24 (18), 2861-2875 (2013).</li>
<li>Steffen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rac+function+is+crucial+for+cell+migration+but+is+not+required+for+spreading+and+focal+adhesion+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Rac function is crucial for cell migration but is not required for spreading and focal adhesion formation.</a> J Cell Sci. 126, Pt 20 4572-4588 (2013).</li>
<li>Lai, F. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arp2%2F3+complex+interactions+and+actin+network+turnover+in+lamellipodia%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Arp2/3 complex interactions and actin network turnover in lamellipodia.</a> EMBO J. 27 (7), 982-992 (2008).</li>
<li>Dimchev, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficiency+of+lamellipodia+protrusion+is+determined+by+the+extent+of+cytosolic+actin+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Efficiency of lamellipodia protrusion is determined by the extent of cytosolic actin assembly.</a> Mol Biol Cell. 28 (10), 1311-1325 (2017).</li>
<li>Koppel, D. E., Axelrod, D., Schlessinger, J., Elson, E. L., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+fluorescence+marker+concentration+as+a+probe+of+mobility%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Dynamics of fluorescence marker concentration as a probe of mobility.</a> Biophys J. 16 (11), 1315-1329 (1976).</li>
<li>Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photoactivatable+GFP+for+selective+photolabeling+of+proteins+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells.</a> Science. 297 (5588), 1873-1877 (2002).</li>
<li>McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bright+and+photostable+photoconvertible+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein.</a> Nat Methods. 6 (2), 131-133 (2009).</li>
<li>Gurskaya, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+a+monomeric+green-to-red+photoactivatable+fluorescent+protein+induced+by+blue+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light.</a> Nat Biotechnol. 24 (4), 461-465 (2006).</li>
<li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivatable+fluorescent+proteins+for+diffraction-limited+and+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Photoactivatable fluorescent proteins for diffraction-limited and super-resolution imaging.</a> Trends Cell Biol. 19 (11), 555-565 (2009).</li>
<li>Kremers, G. J., Piston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoconversion+of+purified+fluorescent+proteins+and+dual-probe+optical+highlighting+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Photoconversion of purified fluorescent proteins and dual-probe optical highlighting in live cells.</a> J Vis Exp. (40), (2010).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21356831">Preparation of slides and coverslips for microscopy.</a> CSH Protoc. 2008, 4988(2008).</li>
<li>Small, J. V., Rottner, K. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/book/10.1007/978-90-481-9301-1">Actin-based Motility</a>. Carlier, M. F. , Springer. Dordrecht. (2010).</li>
<li>Kaverina, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enforced+polarisation+and+locomotion+of+fibroblasts+lacking+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Enforced polarisation and locomotion of fibroblasts lacking microtubules.</a> Curr Biol. 10 (12), 739-742 (2000).</li>
<li>Small, J., Rottner, K., Hahne, P., Anderson, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualising+the+actin+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Visualising the actin cytoskeleton.</a> Microsc Res Tech. 47 (1), 3-17 (1999).</li>
<li>Mikhailov, A. V., Gundersen, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centripetal+transport+of+microtubules+in+motile+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Centripetal transport of microtubules in motile cells.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 32 (3), 173-186 (1995).</li>
<li>Rottner, K., Behrendt, B., Small, J. V., Wehland, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VASP+dynamics+during+lamellipodia+protrusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">VASP dynamics during lamellipodia protrusion.</a> Nat Cell Biol. 1 (5), 321-322 (1999).</li>
<li>Svitkina, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+filopodia+initiation+by+reorganization+of+a+dendritic+network%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanism of filopodia initiation by reorganization of a dendritic network.</a> J Cell Biol. 160 (3), 409-421 (2003).</li>
<li>Small, J. V., Isenberg, G., Celis, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarity+of+actin+at+the+leading+edge+of+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Polarity of actin at the leading edge of cultured cells.</a> Nature. 272 (5654), 638-639 (1978).</li>
<li>Dang, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+signalling+to+the+Arp2%2F3+complex+steers+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inhibitory signalling to the Arp2/3 complex steers cell migration.</a> Nature. 503 (7475), 281-284 (2013).</li>
<li>Anderson, K. I., Cross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contact+dynamics+during+keratocyte+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Contact dynamics during keratocyte motility.</a> Curr Biol. 10 (5), 253-260 (2000).</li>
<li>Burnette, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+actin+arcs+in+the+leading-edge+advance+of+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A role for actin arcs in the leading-edge advance of migrating cells.</a> Nat Cell Biol. 13 (4), 371-381 (2011).</li>
<li>Humphries, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clathrin+potentiates+vaccinia-induced+actin+polymerization+to+facilitate+viral+spread%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Clathrin potentiates vaccinia-induced actin polymerization to facilitate viral spread.</a> Cell Host Microbe. 12 (3), 346-359 (2012).</li>
<li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifeact%3A+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nat Methods. 5 (7), 605-607 (2008).</li>
<li>Kage, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FMNL+formins+boost+lamellipodial+force+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">FMNL formins boost lamellipodial force generation.</a> Nat Commun. 8, 14832(2017).</li>
<li>Peckham, M., Miller, G., Wells, C., Zicha, D., Dunn, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+changes+to+the+mechanism+of+cell+locomotion+induced+by+overexpression+of+beta-actin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Specific changes to the mechanism of cell locomotion induced by overexpression of beta-actin.</a> J Cell Sci. 114, Pt 7 1367-1377 (2001).</li>
<li>Salmon, E. D., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+we+discovered+fluorescent+speckle+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">How we discovered fluorescent speckle microscopy.</a> Mol Biol Cell. 22 (21), 3940-3942 (2011).</li>
<li>Machan, R., Wohland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+applications+of+fluorescence+correlation+spectroscopy+in+live+systems%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Recent applications of fluorescence correlation spectroscopy in live systems.</a> FEBS Lett. 588 (19), 3571-3584 (2014).</li>
<li>Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+lifetime+imaging--techniques+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Fluorescence lifetime imaging--techniques and applications.</a> J Microsc. 247 (2), 119-136 (2012).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文讨论了本研究所述技术中的关键步骤，以及如何针对不同实验条件的应用对这些步骤进行优化。
显微注射是一种可用于监测细胞中引入外源蛋白、抑制剂或药物后瞬时效应的方法。该方法在确定难以转染的细胞类型中蛋白质功能，或在不希望实现长期表达的情况下尤为有利。需要注意的是，某些细胞类型的存活率会因其接种的细胞外基质不同而有所差异。大多数内皮细胞、上皮细胞或成纤维细胞样细胞类型，即使体积较小（如鱼类角质细胞，参见 Dang 等21 安德森和克罗斯22) 可成功进行显微注射。然而也存在例外情况，例如接种在层粘连蛋白（laminin）上的 B16-F1 细胞，虽然是细胞迁移研究的优良模型系统，但由于未知原因，无法在此类基质上进行注射。对于 NIH3T3 成纤维细胞，我们通常在纤连蛋白（fibronectin）基质上进行注射，且在此类成纤维细胞中同样可良好实施其他光操控技术，如荧光漂白恢复（FRAP）（包括光激活，本文中以 B16-F1 细胞为例展示）（参见 例如， Köstler 等3）。还必须考虑到，不同的蛋白质根据其功能特性和实验目的，引起变化所需的时间可能不同，从数秒到数小时不等。该技术的一个优点是，相较于整体水平，可在单细胞水平上更精确地控制外源试剂的剂量/浓度 例如，使用质粒转染时。此外，对蛋白质进行荧光标记并非确保其存在于细胞内的必要条件，这在需要同时进行其他荧光标记蛋白质的多通道可视化时可提高灵活性。显微注射在分析特定蛋白质或蛋白质混合物对细胞形态或细胞骨架动态变化的即时效应时尤为有用（例如， Dang 等21 以Arp2/3复合物抑制剂Arpin对细胞迁移的即时效应为例）。该技术的一个缺点是其侵入性，可能造成细胞损伤或影响细胞形态。因此，在进行显微注射时，一个重要考虑因素是监测细胞活力。本文所介绍的方法依赖于手动操作。在已验证与成功注射相容的条件下（如生长于纤连蛋白基质上的成纤维细胞），此处描述的手动注射方案可实现接近100%的成功率；这对于将该方法与复杂的、耗时的后续实验（包括视频显微镜观察或荧光漂白恢复技术（FRAP））相结合尤为关键，相关应用此前已有发表3这并不排除偶尔个别细胞可能受到显微注射事件的影响，可通过细胞核和细胞质对比度的突然变化，继而出现细胞边缘回缩的现象安全识别。此类罕见的实验情况将被排除，不纳入后续分析。
然而，半自动方法也常被采用，例如使用快速（&#60;300 毫秒）的机械控制针头下降与注射压力升高同步进行，因此在每次注射前只需将针头定位在目标细胞上方即可。半自动注射的成功率从定义上低于上述手动方法，因为它优先考虑速度，随后对成功经受该处理的多个细胞进行分析；因此其结果不依赖于单个细胞注射的成功与否。因此，与单细胞分析不同，半自动注射更适用于分析数百个细胞的注射效应， 例如， 通过低倍视频显微镜观察或细胞固定与染色后进行检测。无论采用何种具体方法，显微注射本身并不构成终点检测，但可与多种技术联用，包括荧光漂白恢复（FRAP）或光激活3.
在利用FRAP测定蛋白质周转率时，必须根据显微镜配置和成像条件（放大倍数、物镜、 等等。，以及用于光漂白的细胞类型、结构和荧光蛋白）。需要注意的是，在最佳激光功率下，应实现高效的漂白效果，同时将光损伤降至最低，以避免分析结构发生收缩或完全回缩。例如， 片状伪足或丝状伪足）甚至造成细胞水平的损伤。理想情况下，漂白效率应达到至少70–80%，尽管在蛋白质周转极快的情况下，完全漂白可能受限，此时漂白效率高于50%也可接受。针对特定结构和荧光染料，最佳漂白功率应通过实验确定，从低激光功率开始，逐步增加。原则上，任何荧光染料均可使用接近其激发峰波长的激光进行漂白（例如常用绿色染料FITC或EGFP的激发波长为488 nm）。然而，波长较短的激光（如近紫外激光）可提供更高功率，因此也可用于常用荧光染料的高效漂白。我们常规使用405 nm二极管激光器（120 mW）对EGFP和红色荧光染料（如mCherry）进行漂白，尽管后者漂白效率略低（数据未显示）。由于405 nm二极管激光器还可用于PA-GFP的光激活（见下文），因此该系统具有最大的灵活性。
对于此处光漂白的 B16-F1 细胞结构和荧光蛋白，应用的 405 nm 激光功率范围为 65–100 mW。在分析光漂白区域时，需考虑在分析时间段内该结构是否保持其原始形态。例如，在分析板状伪足尖端蛋白质周转时，应注意板状伪足的曲率是否随时间发生显著变化，因为曲率的变化可能导致分析结果不准确，如果所分析的区域/轮廓未能在每一帧测量中完全覆盖该结构的全部范围。此外，应注意嵌入板状伪足的束状结构（如微棘）可能会引起荧光强度的偏差。如图 2b（9 秒时间点的白色箭头所示）所示，一个类似微棘的结构位于测量的光漂白区域旁边，但在整个测量过程中始终处于该区域之外，因此不会造成任何误差。在分析蛋白质周转时，选择分析区域的位置和大小需重点考虑：其随时间变化的荧光信号不应受到细胞形态变化或其他难以避免的成像过程中光漂白因素的显著影响。例如，在分析过程中，对所分析结构有显著定量贡献的结构不应移出测量区域；此外，与分析无关的荧光实体（如吸引该蛋白的囊泡结构）也不应在分析期间进入感兴趣区域。在测定板状伪足肌动蛋白聚合速率时，应注意避免分析发生回缩或起皱（即向上折叠）的板状伪足，因为这将严重影响结果的准确性。此外，板状伪足区域的回缩可能表现为快速的向后移位，从而可能导致高估板状伪足肌动蛋白的聚合速率。另一个需考虑的因素是细胞内归一化区域（作为校正&#160;成像过程中光漂白的参考位置）与实际光漂白位置之间的距离，该距离应足够大，以避免受到光漂白区域的直接影响。
在设置PA-GFP标记构建体光激活的最佳条件时，应注意避免在光激活过程中发生立即漂白。在我们的研究中，使用比通常用于EGFP漂白低5至10倍的激光功率可获得最佳效果。对于光激活分子的图像采集，应根据待光激活和分析的区域与结构的大小，以及光激活蛋白向其他亚细胞位置可能发生的移动性，优化曝光时间及帧间时间间隔。与所有类型的荧光成像一样，维持细胞活力对于获得具有生理相关性的结果至关重要。
原则上，荧光蛋白（如 mEos 或 Dronpa 变体）的绿色到红色光转化12 是追踪亚细胞结构（如片状伪足）动态变化和周转的同样有效的方法（参见 例如， 伯内特 等23）。与PA-GFP相比，后一种方法的优势在于能够利用两种不同的颜色在光转化前后同时追踪蛋白质动态，而无需共表达额外的红色荧光蛋白。然而，在我们的初步实验中，PA-GFP光激活后所产生的荧光信号强度及对比度变化均优于光转化探针，这可能归因于绿色荧光探针相较于红色荧光探针具有更优越的光谱特性（数据未显示）。无论如何，迄今为止关于板状伪足或痘苗病毒诱导的肌动蛋白尾部等细胞边缘突起中肌动蛋白丝周转的详细研究，仅见使用PA-GFP衍生物进行报道5,6,24.
在考虑光激活后应分析的细胞区域时，需结合此处所示的具体实例（即细胞质中光激活后肌动蛋白单体在细胞边缘的整合）来讨论若干因素，但这些因素显然可推广至其他类似的科学问题。首先，在测量细胞质中光激活蛋白在片状伪足处的整合速率时（例如在不同实验条件下，如Dimchev et al.6 所示），各实验组之间细胞质区域的大小及其与片状伪足边缘的距离应具有可比性。此外需注意，当对细胞质区域进行光激活时，靠近细胞核的位置细胞厚度更大。如果待激活蛋白在细胞质中呈均匀分布，则激活较厚的细胞区域可能导致更多的蛋白被激活。最后，待激活蛋白的表达水平在单个细胞之间可能存在显著差异。鉴于上述各种变异因素，在比较细胞其他部位中细胞质激活蛋白的整合水平时，必须相对于特定区域光激活后获得的总荧光强度进行归一化处理。
我们已阐述了显微注射如何作为一种研究工具，用于探究蛋白质对细胞形态的影响，并通过在NIH3T3成纤维细胞中显微注射小GTP酶Rac1后显著诱导片状伪足结构的形成，对此进行了实例展示。此前，我们已应用该技术，在显微注射了Scar/WAVE蛋白C端WCA结构域的细胞中干扰Arp2/3复合物的功能3可通过其他检测方法分析显微注射细胞中的各种参数，例如荧光漂白恢复（FRAP）或光激活。我们已阐述如何利用FRAP和光激活技术研究肌动蛋白单体的亚细胞动态行为与移动性。本课题组此前已应用过FRAP技术。5 研究定位于片状伪足的蛋白质（如 VASP、Abi、cortactin、cofilin 和帽蛋白）的周转，或阐明在有无 Rac 信号存在条件下黏着斑组分的周转4此外，通过光漂白EGFP标记的β-actin可实现对肌动蛋白聚合速率的测量。5，但存在其他替代方法。可通过活细胞成像兼容的探针标记细胞肌动蛋白纤维，追踪荧光分布的不均一性，例如使用Lifeact25，也可被采用6,26其优势在于可避免β-actin的过表达，后者可能增强细胞边缘突起和迁移，从而造成潜在干扰&#160;根据具体的检测方法或实验问题（参见 例如， Kage 等26；Peckham 等27）。然而，Lifeact探针的一个明显缺点是其与肌动蛋白丝结合的快速结合/解离动力学，导致在细胞中标记的肌动蛋白丝结构在成像过程中易发生光漂白&#160;仅提供探针的周转信息，而不提供其结合的肌动蛋白丝的周转信息25先前采用的荧光不均匀性追踪方法6,26 确实提供了一种实用的折中方案，与广泛使用的荧光斑点追踪技术类似，后者用于整合到丝状细胞骨架结构中的荧光标记（参见 例如， 鲑鱼与沃特曼28），但其使用可能不如EGFP标记的F-actin结构的荧光漂白恢复（FRAP）技术那样直接和精确。我们已应用光激活技术来估算单体肌动蛋白掺入伸出的片状伪足的速率，以及其在细胞质中的整体移动性，这些研究是在实验调控的细胞质F-actin水平背景下进行的6该技术在检测来自较大区域（如胞质溶胶区域）的蛋白质的迁移性和分布时具有实用价值。然而，在检测来自较小光激活结构的蛋白质分布时， 例如， 由于被激活的荧光分子数量较少、信号微弱，因此检测生长锥可能具有挑战性。除上述荧光光激活或光转换技术外，潜在的替代方法包括逆向荧光漂白恢复技术（inverse FRAP），该方法通过光漂白整个细胞中除感兴趣区域（ROI）以外的部分，随后追踪荧光分子从该区域向外的移动情况。该技术无需过表达光可激活蛋白，但始终需要暴露于异常高强度的激光功率下，可能引起光损伤等非预期的副作用。
显然，光激活和荧光漂白后恢复技术无法区分蛋白质是以单体、二聚体还是甚至小寡聚体形式移动，也无法判断其是否与额外的结合伴侣共同移动。此类信息可通过荧光相关光谱技术29或 alternatively，FLIM-FRET30获得。尽管如此，FRAP 和光激活仍是直接评估细胞中局部和全局蛋白质动态的简便方法，且不受所研究蛋白质的种类、亚细胞定位或细胞类型的影响。

监测活细胞中蛋白质及其他分子的时空动态已成为细胞生物学和分子生物学多个领域的基本工具。先进的荧光显微技术，包括荧光共振能量转移（FRET）和FRET-荧光寿命成像（FRET-FLIM），以及光漂白后荧光恢复（FRAP）、光漂白过程中的荧光丢失（FLIP）和光激活等技术，以及其他多种方法，能够实现对蛋白质-蛋白质相互作用、构象变化以及细胞内不同蛋白质扩散和定位动力学的时空追踪1，2。特别是FRAP和光激活技术，广泛适用于研究肌动蛋白细胞骨架和细胞迁移的调控因子。这些技术可单独使用，也可与其他微操作技术（如显微注射3）结合使用，并涉及荧光标记蛋白的表达。它们可用于估算蛋白质与富含肌动蛋白的结构（如丝状伪足或片状伪足）结合的动力学过程、局灶性黏附4或分支状肌动蛋白网络5中蛋白质的更新速率。此外，这些技术还可用于测定片状伪足中肌动蛋白聚合速率、评估单体肌动蛋白在细胞质中的扩散情况，以及测定亚细胞内单体肌动蛋白向突出片状伪足中正在聚合的肌动蛋白丝转运的速率6等其他参数。
FRAP 是一种用于在活细胞内可视化并定量蛋白质移动性的方法，最初由 Axelrod 于 20 世纪 70 年代开发7。在细胞内选择一个感兴趣区域（ROI），该区域含有荧光标记的蛋白质，短暂暴露于高强度激光下，足以在给定的短时间内使该区域内存在的荧光分子发生淬灭。在淬灭期间位于 ROI 外部的未淬灭荧光标记蛋白质会根据其时空动态扩散并侵入淬灭区域，导致光淬灭分子随时间发生置换。淬灭区域中荧光恢复的速率取决于多种因素，包括特定分子的大小、扩散速率，以及其在假定相关淬灭结构中的周转速率。因此，可溶性蛋白质将通过扩散迅速介导淬灭 ROI 内荧光的恢复，而与结构（如黏着斑）紧密结合的蛋白质则具有较长的周转时间，因为其荧光恢复既依赖于蛋白质可溶部分的扩散，也依赖于与结构结合部分的解离-结合动力学。通常，荧光恢复过程会被持续采集并定量，直至达到初始淬灭前的荧光强度水平。然而，如果初始荧光强度的一部分属于所谓的不可移动组分（即无法通过扩散补充，或其补充速率远慢于构成可移动组分的大多数分子），则无法完全恢复。为了确定蛋白质周转速率，可生成 FRAP 曲线，用以表示荧光恢复程度随时间的变化。从这些恢复曲线中可计算出蛋白质恢复的平均半衰期。通过对平均 FRAP 数据进行曲线拟合，进而开展数学分析，还可以推断可移动组分的平均周转速率是否由单一均质分子群体构成，或是否由两个或多个以不同速率周转的亚群组成。除了通过定量方法估算蛋白质周转速率外，追踪伪足中光淬灭区域的恢复过程还可实现对伪足运动参数的精确定量，例如逆行流、前伸运动以及肌动蛋白聚合速率。因此，FRAP 是一种多功能工具，可用于评估活细胞内多种结构的相关参数。
光激活是一种用于追踪源自特定细胞位置的蛋白质或分子扩散与运动性的方法。该技术采用例如由Patterson和Lippincott-Schwartz最初开发的野生型绿色荧光蛋白（GFP）的一种变体8，该蛋白经过突变，使其在暴露于紫外光（UV）（约400 nm；此处为405 nm）后荧光显著增强。根据Patterson 等的描述，野生型GFP的发色团以中性酚和阴离子酚盐的混合群体存在，分别在约397 nm处产生主要吸收峰，在475 nm处产生次要吸收峰。当用紫外光照射该蛋白时，该群体发生光转化，向阴离子形式转变。在488 nm激发下，光转化/光激活的蛋白荧光增强约3倍，但由于固有的背景荧光较高，实际中不足以区分激活与未激活的GFP。然而，通过在GFP序列中引入单个氨基酸突变（第203位组氨酸取代），已实现了背景强度的降低。由此产生的T203H突变体，也称为光激活型GFP（PA-GFP），其特征是次要吸收峰的吸收显著降低，而在经紫外光照射后，再用488 nm光激发时，其吸收几乎增加100倍。因此，过表达PA-GFP标记的蛋白是一种广泛应用的方法，可用于确定分子在细胞内的扩散和运动性。我们此前曾应用PA-GFP标记的肌动蛋白来测定肌动蛋白单体从胞质区域扩散的速率，不仅可探究其在胞质中的运动性，还可测定其掺入前缘片状伪足肌动蛋白网络的速率6。近期文献还描述了新型的光转化蛋白，原则上可类似地使用，并具有在光转化前即可被观察到的潜在优势。属于此类荧光蛋白的例子包括Dendra2和mEos29,10,11,12。
本文介绍了将蛋白质显微注射入细胞的方法学。进一步阐述了如何将该技术与荧光漂白后恢复（FRAP）技术相结合，通过光漂白参与肌动蛋白细胞骨架调控和细胞运动的蛋白质，并获得FRAP恢复曲线及可移动组分的半恢复时间。此外，我们提供了一个应用FRAP技术测定片状伪足网络中肌动蛋白聚合速率的实例。我们还提供了光激活实验的操作步骤与技术要点，该实验可用于测定胞质中单体肌动蛋白的流动性以及肌动蛋白掺入片状伪足的速率。当然，这些技术不仅限于追踪肌动蛋白细胞骨架组分，经过适当调整或优化后，亦可广泛应用于其他细胞类型，或用于研究不同的蛋白质、结构和参数。

<table><tbody><tr><td>B16-F1 小鼠皮肤黑色素瘤细胞&amp;nbsp;</td><td>美国模式培养物集存库，马纳萨斯，弗吉尼亚州</td><td>CRL-6323</td><td></td></tr><tr><td>NIH-3T3 细胞</td><td>美国模式培养物集存库，马纳萨斯，弗吉尼亚州</td><td>CRL-1658</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 4.5g/L 葡萄糖&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies，赛默飞世尔科技，德国</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>Ham&amp;rsquo;s F-12 培养基</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N8641</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清&amp;nbsp;（FCS）</td><td>PAA 实验室，林茨，奥地利</td><td>A15-102</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Sigma-Aldrich，德国</td><td>F7524</td><td>批号 054M3396</td></tr><tr><td>MEM 非必需氨基酸&amp;nbsp;</td><td>Gibco，赛默飞世尔科技，德国</td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺 200 mM（100 倍）</td><td>Life Technologies</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（5000 U/mL）</td><td>Life Technologies</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠（100 mM）</td><td>Gibco，赛默飞世尔科技，德国</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>层粘连蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-2020</td><td></td></tr><tr><td>层粘连蛋白包被缓冲液&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>自配：50 mM Tris pH 7.4，150 mM NaCl</td></tr><tr><td>人血浆来源纤连蛋白&amp;nbsp;</td><td>罗氏诊断，曼海姆，德国</td><td>11 051 407 001</td><td></td></tr><tr><td>Jetpei</td><td>Polyplus 转染，伊尔基希，法国</td><td>101-10N</td><td></td></tr><tr><td>JetPei 缓冲液</td><td>Polyplus 转染，伊尔基希，法国</td><td>702-50</td><td>150 mM NaCl</td></tr><tr><td>PA-GFP-肌动蛋白质粒 DNA&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>见 Koestler 等人，2008</td></tr><tr><td>pEGFP-肌动蛋白质粒 DNA</td><td>Clontech，山景城，加利福尼亚州，美国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微注射用 Rac1 蛋白</td><td></td><td></td><td>以 GST 标签形式纯化，并在注射前切除 GST 标签</td></tr><tr><td>显微注射缓冲液</td><td></td><td></td><td>自配：100 mM NaCl，50 mM Tris-HCl pH 7.5，5 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，1 mM DTT</td></tr><tr><td>葡聚糖，德克萨斯红，70,000 MW，赖氨酸可固定</td><td>Molecular Probes，赛默飞世尔科技，德国</td><td>D1864</td><td></td></tr><tr><td>圆形显微镜盖玻片 15 mm，1 号&amp;nbsp;</td><td>Karl Hecht，艾森特，松德海姆，德国</td><td>1001/15</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Femtotips 微量加样尖端</td><td>Eppendorf，汉堡，德国</td><td>5242 956 003</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Femtotip 显微注射毛细管尖端</td><td>Eppendorf，汉堡，德国</td><td>930000035</td><td></td></tr><tr><td>硅脂&amp;nbsp;</td><td>ACC Silicones，布里奇沃特，英格兰</td><td>SGM494</td><td></td></tr><tr><td>铝制开放式钻石浴成像室</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26</td><td></td></tr><tr><td>自动温度控制器</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-324B</td><td></td></tr><tr><td>显微镜：Axio Observer&amp;nbsp;</td><td>卡尔·蔡司，耶拿，德国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CoolSnap-HQ2 相机&amp;nbsp;</td><td>Photometrics，图森，亚利桑那州</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lambda DG4 光源&amp;nbsp;</td><td>Sutter Instrument，诺瓦托，加利福尼亚州</td><td></td><td></td></tr><tr><td>激光光源&amp;nbsp;</td><td>Visitron Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf FemtoJet 显微注射仪&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf，汉堡，德国</td><td></td><td>内置压缩机供压</td></tr><tr><td>Nikon Narishige 显微操作系统</td><td>Nikon Instruments，日本</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Visiview 软件 v2.1.4</td><td>Visitron Systems，普赫海姆，德国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metamorph 软件 v7.8.10</td><td>Molecular Devices，森尼韦尔，加利福尼亚州</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sigma Plot v.12</td><td>Systat Software Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

允许分析细胞骨架调节因子形态发生动力学与周转的显微操作技术

Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators

研究蛋白质的时空动态可以揭示其在不同背景下的功能重要性。本文讨论了如何利用光漂白后荧光恢复（FRAP）和光激活技术来研究蛋白质在亚细胞区域的时空动态。我们还展示了这些技术如何能够简便地测定与肌动蛋白细胞骨架调控及细胞运动性相关的多种参数。此外，本文进一步描述了细胞显微注射作为一种替代处理方法（可能在前述光操控技术之前或同时进行），以触发转位蛋白对细胞形态和功能的即时效应。诸如蛋白质注射或局部施加细胞膜通透性药物或细胞骨架抑制剂等显微操作手段，可作为强大工具，用于记录特定处理对单个细胞及亚细胞水平上细胞行为的即时影响。本文以注射重组Rac1蛋白后立即诱导片状伪足边缘突起为例，该现象早在二十五年前即已确立。此外，我们提供了一项实验方案，用于测定增强型绿色荧光蛋白（EGFP）-VASP的周转率，该蛋白是一种肌动蛋白丝聚合酶，在B16-F1细胞的片状伪足尖端显著富集，实验采用FRAP技术，并包含相应的数据分析与曲线拟合方法。我们还提供了估算片状伪足中肌动蛋白网络聚合速率的指导原则，以表达EGFP标记的β-actin的细胞为例进行说明。最后，本文给出了如何利用光激活方法研究细胞质中肌动蛋白单体的移动速率及其在快速纤维组装位点（如突出的片状伪足尖端）整合过程的指导步骤。这些方案均&#160;不仅限于肌动蛋白细胞骨架的组分或调控因子，还可轻易扩展应用于以类似方式探究各种不同亚细胞结构或功能背景下蛋白质的时空动态与功能。

图1g，h 显示NIH3T3成纤维细胞在显微注射Rac1前及注射后10分钟的相差图像。Rac1是一种小分子Rho家族GTP酶，可通过与WAVE复合物相互作用诱导片状伪足的形成。细胞首先在显微注射前进行观察（图1g），以确认其活力和形态， 例如， 缺乏片状伪足。显微注射后10分钟，细胞形态已明显改变，此现象符合该处理的预期结果，表明注射成功。图1h).
为简便起见并提高清晰度，我们接下来提供未进行额外显微注射的细胞中荧光漂白恢复（FRAP）和光激活分析的示例结果。
EGFP标记的VASP在片状伪足尖端的周转分析如图2a-f所示。需注意，VASP除了定位于片状伪足尖端外，还靶向新生黏着斑和局灶性黏着部位，即细胞内部的小而细长的点状结构18,19。通过追踪ROI在光漂白前、中、后随片状伪足向前延伸的轮廓，对具有明显VASP聚集的片状伪足区域的荧光强度在每一时间帧进行漂白和测量。由于漂白的EGFP-VASP蛋白在此位点被未漂白的分子所替换，因此可观察到荧光逐渐恢复（图2b）。以漂白前强度（表示为1）归一化后得到的FRAP恢复曲线如图2c所示。光漂白效率可能有所不同，在本示例中约为漂白前值的20%，该值由t0时刻（光漂白后的第一帧）的数值确定。荧光增加在本示例中达到一个平台期，约为漂白前荧光强度的80%。在实验时间范围内保持静态的结构（如局灶性黏着斑）中，漂白前荧光强度与恢复后达到的平台期荧光强度之间的差值定义为不可移动组分（IF，图2c, e中的红色箭头），而从漂白时刻到完全恢复之间恢复的荧光量则定义为可移动组分（图2c, e中的绿色双头箭头）。需要注意的是，在本研究分析的动态变化结构（如片状伪足尖端）中，IF的程度可能不仅代表不可移动的分子，也可能源于前伸速度的降低，因为已知EGFP-VASP的荧光强度依赖于这一参数18。为计算恢复半衰期，使用SigmaPlot生成拟合曲线（图2d）。在此情况下，由求解公式2得到的“b”参数值为0.0754，将其代入对数函数（公式4）后，估算出恢复半衰期为9.19 s（图2d最右侧面板），与先前报道的平均值相比，该细胞的恢复速度相对较快5。必须指出的是，在同一细胞群体中，恢复半衰期有时在不同细胞间可能存在显著差异。因此，为获得具有代表性的结果，建议至少从15–20个细胞中计算该参数的平均值。为说明变异程度，我们生成了每个时间点来自15个细胞的EGFP-VASP恢复值的算术平均值（图2e），并以类似方式创建和展示了平均拟合曲线（图2f）。
片状伪足肌动蛋白网络的聚合速率由前向网络突出和向后流动的速率之和构成。可通过将细胞（本例为B16-F1细胞）转染表达EGFP标记的β-actin，并对突出的片状伪足区域进行光漂白，利用荧光漂白后恢复技术（FRAP）测量肌动蛋白的聚合速率（图2g）。在分析片状伪足肌动蛋白网络聚合时，需随时间评估EGFP标记的β-actin在光漂白后的荧光恢复情况。由于肌动蛋白单体在片状伪足肌动蛋白丝的钝端持续聚合（所有钝端均朝向前缘20），该网络不断向后方转运并同时向前推进，其速率可通过光漂白后荧光的极性恢复过程简便获得。当漂白区域到达片状伪足后部与片层之间的过渡区时，片状伪足的荧光恢复即告完成；该过渡区的特征是含有密度较低、排列更水平的纤维束，其周转速率远慢于片状伪足区域。如图2g所示，荧光恢复可表现为一条与边缘平行并向片层方向向后移动的线，由此可测量突出距离和向后流动距离（分别在图2g最右侧图中以橙色和红色双头箭头单独表示）。
我们还应用光激活技术处理转染了PA-GFP-肌动蛋白的B16-F1细胞，以追踪肌动蛋白单体在细胞质中的移动性及其掺入伸出的片状伪足的速率。如图3a, b所示，使用405 nm激光照射细胞质区域进行光激活，同时每1.5秒在GFP通道采集图像，以观察GFP标记的光激活肌动蛋白的分布情况。在图3b中可见，光激活的GFP-肌动蛋白从细胞质区域向外扩散。光激活细胞质区域内荧光强度下降的速率以t0时刻（光激活后的第一帧）初始强度的百分比表示（图3c）。光激活的肌动蛋白也会掺入片状伪足的尖端，在此处新的肌动蛋白单体在突出过程中被添加到延长的肌动蛋白丝的正端。为了估算片状伪足的掺入速率，我们测量了一个约5 µm宽、1 µm高的二维轮廓/区域随时间变化的荧光强度；随着片状伪足的突出，该区域持续重新定位至其尖端。肌动蛋白的掺入量以t0时刻光激活细胞质区域的荧光强度百分比表示（图3d）。随着肌动蛋白丝的延长，新的肌动蛋白单体被掺入到片状伪足前端。其中一部分肌动蛋白单体随机来源于细胞质池，即单体被光激活的区域。这导致在光激活后的前20秒内，片状伪足中的荧光迅速增加。当新的单体不断添加到片状伪足前端时，先前掺入的肌动蛋白单体则通过逆行流随纤维向内侧区域移动。随着时间推移，感兴趣区域（ROI）完全被荧光单体填充，荧光达到平台期（图3d）。随后，当光激活的单体扩散至整个细胞后，未被光激活的肌动蛋白单体越来越多地重新加入片状伪足前端，此时观察到荧光逐渐下降。这种荧光下降将最终达到一个新的平台期，即当整个细胞内光激活与非光激活单体之间达到平衡时（数据未显示）。
通过测量远离光激活区域的等尺寸区域内的荧光强度，可获得肌动蛋白单体在整个细胞质中的迁移情况（如图3a中以不同颜色标记的R1-R5区域所示）。如图3e所示，随着光激活的肌动蛋白单体逐渐被未激活（即非荧光）的单体稀释，各区域的荧光强度自细胞质光激活区域向外逐渐降低。此外，荧光峰值出现的时间也更晚：测量区域距离光激活区域越远，肌动蛋白单体扩散至该区域所需的时间就越长。通过量化达到荧光平台期所需时间的半衰期，可获得每个区域肌动蛋白单体渗透程度的代表性数值。区域距离越远，光激活的肌动蛋白扩散进入所需时间越长，因此达到荧光平台期所需时间也更长，最终导致更高的t1/2值（图3e）。
<img alt="显微注射装置与过程；将物质注入细胞；显微镜成像结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57643/57643fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1：成像腔室组装与显微注射操作流程。（a）成像腔室的组成部件。（b）将硅脂小心涂抹在塑料封片环的开口周围。（c）将盖玻片细胞面朝上放置于成像腔室开口的中央位置。（d）将塑料封片环置于盖玻片上方，并拧紧侧边夹具，以形成牢固的密封。（e）用移液器将显微镜成像用培养基加入腔室槽中。（f）将成像腔室放置于显微镜载物台上，温度传感器和电极连接至预设为 37 °C 的加热装置，细胞需适应环境至少 30 分钟后方可开始显微观察。在此示例中，显微镜载物台还配备了显微操作仪用于执行显微注射，显微注射针浸入覆盖在成像腔室内细胞层表面的培养基中。（g）通过相差显微镜在显微注射前观察 NIH3T3 成纤维细胞。细胞核周区域的红色十字标记了即将进行显微注射的位置，该位置靠近体积较大的细胞核，属于胞质较丰富的区域。（h）显微注射 Rac1 后 10 分钟，细胞在整个周边显著形成片状伪足（绿色箭头所示）。<a href="/files/ftp_upload/57643/57643fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="FRAP分析肌动蛋白聚合速率；荧光恢复曲线；显微图像；计算过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57643/57643fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：FRAP可用于测定蛋白质周转速率或片状伪足中肌动蛋白的聚合速率。（a）表达EGFP-VASP的B16-F1细胞在片状伪足区域进行光漂白前的代表性示例，如图所示。不同颜色的轮廓/形状用于标记随时间进行荧光强度测量的区域。注意用感叹号标记的红色轮廓，其表示位于含有多个囊泡和细胞表面皱褶区域中的胞质区域。应避免将此类动态区域选作荧光参考区域，因为这些区域的荧光信号在短期内波动剧烈，可能导致结果不准确。（b）表达EGFP-VASP的细胞在光漂白前后片状伪足区域的变化。紫色标记区域内光漂白后荧光信号的恢复随时间变化情况被可视化显示。箭头指示微突起的尖端，该处VASP富集，可能是由于此处聚合的肌动蛋白丝密度较高所致19。（c）根据b图中光漂白片状伪足区域（紫色轮廓）的荧光强度定量分析所得的FRAP恢复曲线示例。右侧的红色和绿色线条分别表示不可移动组分和可移动组分。（d）c图中FRAP恢复曲线的拟合结果（左图），以及用于计算恢复半衰期的计算方法示例（右图）。（e）由15个细胞的荧光恢复曲线平均后得到的FRAP恢复曲线示例，误差条表示样本群体内的变异性程度。（f）由15个细胞的FRAP恢复曲线拟合结果平均后得到的曲线拟合（左图），以及用于计算恢复半衰期的计算方法示例（右图）。（g）表达EGFP标记的β-肌动蛋白的B16-F1细胞在片状伪足区域光漂白前后，片状伪足突出过程的时间序列图像，随后显示片状伪足中荧光信号随时间恢复的情况。最右侧图像中标注了测得的突出距离（橙色）和回撤距离（红色）。图像下方的计算说明展示了如何利用突出距离与回撤距离之和推导出片状伪足肌动蛋白网络的聚合速率。<a href="/files/ftp_upload/57643/57643fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="荧光光激活、显微镜设置的静态平衡示意图。光谱拟合数据。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57643/57643fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：在整个细胞中对PA-GFP-肌动蛋白进行光激活以追踪单体。（a）表达PA-GFP-肌动蛋白的B16-F1细胞在细胞质区域（由红色圆圈指示，PA）触发光激活前的代表性示例。不同颜色的轮廓标记用于指示随时间进行荧光强度测量所考虑的区域。（b）光激活后PA-GFP-肌动蛋白随时间分布的示意图。注意，在光激活的细胞质区域（红圈）中，由于光激活的肌动蛋白从该区域扩散出去，荧光逐渐减弱。由于扩散至前端并组装成网络，光激活的肌动蛋白单体在片状伪足（青色区域）以及整个细胞质（不同颜色编码的区域）中以距离和时间依赖的方式逐渐增强。（c）光激活细胞质区域（b中的红色轮廓）内荧光随时间的代表性衰减情况。（d）片状伪足区域（b中的青色轮廓）中荧光强度随时间的变化。（e）代表性的细胞质区域（在b中以颜色编码）中荧光强度随时间变化的曲线，这些区域与光激活区域的距离不同。注意，达到荧光平台期的半衰期（如右侧图例所示）随着给定区域与光激活区域之间距离的增加而延长，这可能与肌动蛋白单体扩散到相应区域所需时间的增加相关。<a href="/files/ftp_upload/57643/57643fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

我们介绍了如何利用微操作和光操控技术（如荧光漂白恢复技术FRAP和光激活技术），来测定迁移细胞内蛋白质的运动参数及其时空动态。实验读出结果包括运动调控因子或其下方肌动蛋白细胞骨架的亚细胞动态行为与更新速率。

研究蛋白质的时空动态可揭示其在不同生物学背景下的功能重要性。本文讨论了……

结合显微操作与荧光漂白恢复（FRAP）和光激活等光学显微技术，其总体目标是监测在不同条件或信号通路依赖性情况下，参与细胞骨架调控和细胞迁移的蛋白质的时空动态变化。本文讨论的显微操作方法可用于将任意类型的分子直接递送至细胞内，也可用于在特定亚细胞区域诱导光控蛋白质活性的调控。因此，这些技术的主要优势在于，能够在追踪蛋白质在整个细胞内运动性的同时，确定蛋白质对细胞产生的瞬时效应。开始此操作时，将先前培养的 B16-F1 细胞按 1:5 的比例传代至一个 3 厘米的塑料培养皿中。吸除细胞培养基，用 PBS 洗涤细胞，吸除 PBS 后加入胰蛋白酶-EDTA 溶液以解离细胞。向消化后的细胞中加入细胞培养基。重悬细胞并转移至离心管中，随后以1000 rpm离心3至5分钟。将B16-F1细胞接种至3厘米培养皿中，静置至少6小时使其充分铺展后，通过加入含有500纳克DNA构建体和1微升转染试剂的混合物进行转染，该混合物溶于150毫摩尔/升氯化钠溶液中。对于 B16-F1 细胞，用 150 微升层粘连蛋白溶液覆盖 15 毫米的盖玻片，并在室温下孵育 1 小时。对于 NIH 3T3 细胞，用纤连蛋白溶液覆盖盖玻片，并在室温下孵育 1 小时。孵育后，用 PBS 洗涤经层粘连蛋白和纤连蛋白孵育的盖玻片，然后吸除 PBS。将汇合的 NIH 3T3 成纤维细胞以 1:20 的比例接种 2 毫升至纤维连接蛋白包被的盖玻片上。将转染的 B16-F1 细胞以 1:30 的比例吸取 2 毫升接种至层粘连蛋白包被的盖玻片上。随后，将细胞置于 37 摄氏度的组织培养孵育箱中，使其在包被了层粘连蛋白和纤维连接蛋白的盖玻片上贴壁过夜，之后进行显微镜观察。将盖玻片细胞面向上放置于导热的 RC-26 铝制成像腔室中。接着，在盖玻片上方放置一个塑料密封圈，使盖玻片与腔室之间形成严密密封，并通过拧紧腔室的滑动夹具固定塑料密封圈，以防止培养基泄漏。随后，用移液器将预热至 37 摄氏度的显微镜成像培养基加入腔室中央区域。将热探测器插入腔室的指定插槽中，并将腔室的电极连接至TC-324B型自动温度控制器，以维持37摄氏度的恒定温度。将先前解冻的蛋白质溶液在10,000G条件下离心至少30分钟，以去除可能堵塞显微注射毛细管的蛋白质聚集体。使用柔性移液器吸头从后端向显微注射针中加入1微升蛋白质溶液。如果针尖存在气泡，应轻轻敲击针的基部以去除气泡。然后仔细调整显微操作装置上的持针器。将显微注射针旋入持针器后，在将针尖移入细胞培养基之前，需使用显微注射压力装置对针施加压力。接下来，使用低倍物镜将针头置于视野中，找到目标细胞，并逐渐将针头降低至细胞上方。进行显微注射时，轻轻接触细胞的质膜，这可能足以刺穿细胞，或通过极其轻柔地敲击显微镜装置辅助实现细胞膜的瞬时破裂。一旦观察到液体流入细胞，立即将针尖上移至培养基中，停止注射过程。在触发激光之前，切换至GFP通道并启动图像时间序列采集。随后，在观察显示器的同时，手动绘制GFP通道中需要进行光漂白的区域。在图像采集开始后至少三到四个帧之后，通过手动触发405纳米激光来启动光漂白。在软件中将GFP 488纳米图像采集的曝光时间设置为500毫秒，时间间隔设置为1500毫秒。接下来，通过勾选波长序列方框并在采集波长菜单中选择所需的通道数量，调整软件设置以获取双通道或三通道延时成像视频。在触发激光之前，启动图像延时采集，并在观察显示器的同时，于相差通道上手动绘制需要光激活的区域。在开始图像采集后至少三到四个帧，通过手动触发405纳米激光器启动光激活。为分析FRAP结果，使用MetaMorph软件打开由VisiView生成的时间序列视频。在MetaMorph中通过手动绘制相应区域，获取每个荧光恢复时间点的光漂白区域的强度值。在片状伪足的尖端绘制一个形状，覆盖光漂白区域的全部或部分，并在后续帧中根据需要手动调整其位置，以追踪该区域在片状伪足前进过程中随时间推移的荧光强度变化。为校正背景信号和光漂白效应，应分别分析细胞外和细胞内的区域。选定感兴趣区域后，通过 MetaMorph 软件中的“测量区域”菜单提取其强度值。在配置菜单中确保已选择“经过时间”和“平均强度”选项。单击“打开日志”，选择“动态数据交换”。然后单击“确定”以打开 Excel 电子表格，再次单击“打开日志”按钮，将 MetaMorph 数值粘贴到 Excel 中。使用 MetaMorph 获得的强度值，将这些强度值粘贴到包含适当公式的 Excel 电子表格中，以计算 FRAP 荧光恢复曲线。光漂白区域的荧光恢复需相对于背景和内部区域进行归一化处理。在计算荧光恢复半时间时，将荧光恢复曲线的数值及其对应时间点粘贴至 SigmaPlot，然后使用动态拟合向导中的“指数上升至最大值”工具进行曲线拟合，根据最佳拟合效果选择单指数或双指数函数。通过求解选定函数获得的参数可粘贴至包含相应公式的 Excel 电子表格中，从而计算出以秒为单位的相应恢复半衰期。为测量光激活肌动蛋白在激活后的扩散情况及其在特定区域（如片状伪足）内的累积情况，可使用 MetaMorph 软件测定相应区域以及细胞外区域随时间变化的荧光强度，以确定背景荧光用于归一化。为分析光激活肌动蛋白从激活区域向外位移的确切速率，或其在片状伪足内整合的速率，可基于先前由 MetaMorph 获得的数据生成荧光强度曲线。将用于归一化的背景区域、光激活的细胞质区域或待研究的片状伪足区域的强度值，输入至包含适当公式的 Excel 电子表格中。此处展示了一株 NIH 3T3 成纤维细胞在显微注射小 GTP 酶 Rac1 前后的相衬图像。在显微注射后约 12 分钟，细胞形态发生改变，表明注射已成功。此处展示了在片状伪足尖端，非漂白的EGFP VASP分子对已漂白分子的回收过程。在此特定示例中，漂白后荧光恢复的平台期约为漂白前荧光强度的80%。光激活后，光激活的GFP标记肌动蛋白迅速从细胞质区域扩散出去。部分光激活的肌动蛋白单体转位至细胞前缘，在片状伪足中产生快速的荧光爆发。随着光激活的肌动蛋白单体在穿越细胞质的过程中与非激活的单体混合而被稀释，距离光激活区域较远的片状伪足中的荧光掺入量明显降低。随着时间推移，光激活的GFP标记肌动蛋白从光激活区域扩散出去，持续被非光激活的非荧光肌动蛋白所取代。因此可观察到该区域荧光强度逐渐降低。随着时间推移，靠近胞质激活区域的片状伪足迅速掺入荧光标记的肌动蛋白。随后荧光的下降仅仅是由于肌动蛋白解聚以及单体从片状伪足区域扩散离去所致。因此，当在单一显微成像系统上进行实验时，显微注射与FRAP或光激活技术的结合通常可在数分钟内完成，具体时间取决于所研究蛋白质的性质。在显微操作之前、期间和之后，或在暴露于激光照射后，务必始终保持良好的身心状态。对于FRAP和光激活实验，尤其重要的是所选区域在整个成像过程中必须保持其结构完整性。通过局部施加细胞膜通透性药物或细胞骨架抑制剂，可进一步补充显微注射技术，从而在亚细胞水平上研究特定处理的即时效应。显微操作技术为探索细胞骨架组分及复合物的扩散特性与亚细胞动态行为，以及理解调控细胞形态发生的间接通路开辟了道路。观看本视频后，您应能够充分掌握如何追踪和监测细胞质蛋白、整合于细胞骨架内肌动蛋白中的蛋白，以及定位于不同亚细胞器中的蛋白的时空动态，最终揭示细胞调控的动力学过程。

micromanipulation-techniques-allowing-analysis-morphogenetic-dynamics

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

微操作系统技术允许分析骨架调节器的形态发生动力学和营业额

我们介绍了两种独立的基于显微镜的技术，用于测量单个活体贴壁细胞在整体或局部应变作用下所诱导的细胞核和细胞骨架形变。这些技术可用于测定细胞核的刚度（即形变能力），并探究细胞核与细胞骨架之间的细胞内力传递。...

探测间期细胞核机械特性的生物物理实验方法：基底应变施加与微针操控

本文描述了一种利用光控小GTP酶活性的时空调控方法。该方法基于雷帕霉素诱导的FKBP-FRB异源二聚化及光敏保护基团系统。通过优化光照条件，可实现亚细胞水平上小GTP酶活性的时空精确控制。...

活细胞中亚细胞水平及秒级时间尺度下小GTP酶活性的时空操控

芽殖酵母是研究微管动态的有利模型 体内 由于其强大的遗传学特性和微管细胞骨架的简单性。以下实验方案描述了如何转化和培养酵母细胞，获取共聚焦显微镜图像，以及在活体酵母细胞中对微管动态进行定量分析。...

高分辨率成像与分析酿酒酵母中单个星体微管的动力学行为

在本实验方案中，我们描述了用于显微操作的合适细胞的选择与制备方法，以及利用压电驱动显微操作仪在细胞内重新定位染色体的操作过程。...

昆虫精母细胞中染色体的显微操作

本方案提供了一种基于Fiji的、用户友好的方法，并附有简明的说明，解释如何可靠地分析单个细胞和弯曲上皮组织中的肌动球蛋白行为。遵循本教程无需编程技能；所有步骤均通过Fiji的图形用户界面及其相关插件以半交互方式进行。...

利用培养细胞延时成像分析局部细胞与组织尺度下的肌动球蛋白动力学 黑腹果蝇 卵室

本文介绍了一种利用活细胞旋转盘共聚焦显微镜和基于 MATLAB...

利用转盘显微镜测量单极有丝分裂纺锤体中微管的动力学

提供了一种在微流控芯片上培养和操作小鼠胚胎组织的方案。通过施加通路调节剂的脉冲，该系统可用于外部控制信号振荡，从而对小鼠体节发生进行功能研究。...

一种用于研究调控体节发生信号振荡功能的微流控方法

常用的微管抑制剂在基础和应用研究中被广泛使用，其对细胞具有广泛的影响。最近，光控微管抑制剂（photostatins）作为一种可光控的微管抑制剂新类别出现，能够实现对微管的瞬时、可逆且在空间和时间上精确的操控。本逐步实验方案详细描述了在三维活体小鼠着床前胚胎中应用光控微管抑制剂的具体方法。...

利用光控抑制剂在活体小鼠着床前胚胎中对微管细胞骨架进行时空分辨的亚细胞操控

本文提供了一种优化的分步实验方案，用于固定、免疫染色及切片小鼠胚胎组织，以检测发育中小鼠组织中一种称为细胞质丝（cytonemes）的特化信号突起结构。...

小鼠胚胎组织固定用于细胞突起分析

肌球蛋白收缩力在细胞和组织形态发生中起着重要作用。然而，调控肌动球蛋白收缩力具有挑战性 体内 急性地。本方案描述了一种光遗传学系统，可快速抑制由 Rho1 介导的肌动球蛋白收缩力 果蝇 胚胎，揭示肌动球蛋白失活后上皮张力的立即丧失 体内.

光遗传学抑制Rho1介导的肌动球蛋白收缩力并结合上皮张力测量 黑腹果蝇 胚胎

学习利用FRAP和光激活等显微操作技术研究迁移细胞中细胞骨架调节蛋白的时空动态。该方法可实时追踪蛋白质运动性参数与周转率，为细胞生物学和神经科学研究提供重要工具。

允许分析细胞骨架调节因子形态发生动力学与周转的显微操作技术

探索更多视频