Name: 发展中国家斑马鱼的表皮细胞挤压实时成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: 了解斑马鱼表皮细胞挤压的实时成像方法，利用荧光蛋白标记和转盘共聚焦显微镜观察肌动蛋白动态变化。该技术有助于研究上皮组织如何维持屏障功能并清除凋亡细胞。

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我们感谢Rosenblatt实验室成员提供的科学讨论、建议和意见。我们还要感谢Mary Halloran慷慨提供了编码RFP-UtrCH的质粒，以及David Grunwald提供了CK:GFP转基因斑马鱼。同时感谢Gretchen King及犹他大学中央斑马鱼资源中心的工作人员对斑马鱼的优良维护与照料。本研究工作由美国国立卫生研究院（NIH）国家普通医学科学研究所（NIGMS）NIH主任新创新者奖1 DP2 OD002056-01资助，授予JR。GTE获得了NIH多学科癌症培训项目资助5T32 CA03247-8的支持。

斑马鱼表皮发育过程中细胞挤压期间肌动蛋白动态变化的可视化基本操作流程
发育中的斑马鱼表皮由两个不同的层组成：表层（或称外胚层）和一层与基底膜接触的基底层细胞2。外层表层细胞经历凋亡，并通过挤压作用从组织中被清除3 （图1）。为了实时观察这一过程，我们将编码红色荧光蛋白与肌动蛋白结合蛋白utrophin的calponin同源结构域融合蛋白（RFP-UtrCH）的RNA4,5，注射到在分层上皮启动子cytokeratin 8驱动下表达绿色荧光蛋白（GFP）的转基因斑马鱼单细胞期胚胎中6 （图2A）。尽管注射RNA后RFP-UtrCH在整个动物体内普遍表达，我们重点关注同时表达RFP和GFP的浅层表皮细胞，以特异性追踪表皮中的肌动蛋白动态变化（图2B）。随后，我们用G418处理幼鱼以诱导凋亡细胞的挤压排出，并使用转盘共聚焦显微镜对表皮及肌动蛋白丝进行成像，获取四维数据集。
实验开始前
<ol>
	<li>体外 使用 mMessage mMachine SP6 试剂盒（Ambion）以线性化 DNA 模板转录 RNA，并使用 RNeasy Mini 试剂盒（Qiagen）纯化加帽 RNA。用无菌水将 RNA 稀释至约 60 ng/μl，分装 3-5μl 分装并储存于 -80°C 直至准备注射时为止。注意：避免反复冻融，以防RNA降解。</li>
 <li>用移液管将40 mL含2%琼脂糖的E3胚胎培养基（E3）倒入一个100 × 15 mm的培养皿中，制作用于固定注射过程中胚胎的模具，并将微注射模具（Adaptive Science Tools，# I-34）放入该培养皿中。待琼脂糖凝固后，取出模具，暴露出琼脂糖中的凹槽。将培养皿储存于 4°C 直至准备使用为止。 </li>
 <li>使用带细丝的硼硅酸盐玻璃管（外径 1.0 mm，内径 0.78 mm，长度 10 cm）和 Sutter P-97 拉针仪，在以下参数下拉制毛细注射针（加热 485，拉力 50，速度 60，延迟/时间 90，气压 200）。注意：不同类型的玻璃需对上述条件进行优化。</li>
 <li>配制1%低熔点（LM）琼脂糖E3溶液，分装为每份1 mL，保存于 42°C注意：E3 储液蒸发可能导致琼脂糖浓度升高。</li>
 <li>在标准实验室条件下饲养成年斑马鱼，保持14小时光照和10小时黑暗的规律光暗循环7实验前一晚，将3条雌鱼和2条雄鱼放入同一鱼缸中，并用隔板分开以配对交配。次日早晨，更换鱼缸中的水，并在开灯后移除隔板。</li>
</ol>
1. 注射编码荧光标记肌动蛋白结合蛋白的RNA
<ol>
	<li>将 RNA 置于冰上解冻。按 1:1 比例向 RNA 中加入 0.5% 酚红，使最终 RNA 浓度约为 30 ng/μl，通过反向填充法将 1 μl 溶液装入拉制的毛细玻璃针中。</li>
 <li>在 E3 培养基中收集约 75 个单细胞期8 CK:GFP 胚胎。使用 5 ¾ 号巴斯德移液管将收集的胚胎转移至显微注射模具中，并用 FST Dumont #5 镊子轻轻将胚胎在凹槽中排列定向。注意：操作应迅速，避免对已进入多细胞期的胚胎进行注射，否则可能导致注射 RNA 的嵌合表达。</li>
 <li>在标准实验室解剖体视显微镜下，使用压力控制的显微注射仪（Harvard Apparatus PLI-100 Pico-Injector）将 RNA 注射至胚胎卵黄中。注射后应在胚胎中可见红色斑点（酚红）。每次实验至少注射 50 个胚胎。（有关斑马鱼胚胎 RNA 注射的详细方案，请参见此前 JoVE 协议9）。
	注意：
 <ol type="A">
 	<li>向单细胞期胚胎注射时，注射体积应约为 2 nl。为确定实际注射量，可将 RNA 溶液在矿物油滴中喷出，置于校准过的显微测微尺上，或在目镜内置标尺的显微镜下观察。RNA 液滴应呈完美球形。通过公式计算注射体积：体积（nl）= 4/3πr3。通过调节仪器的注射压力或时间来调整实际注射体积。</li>
 <li>还应注意使用能够观察到荧光蛋白表达的最低 RNA 用量，因高浓度 RNA 可能对发育中的胚胎产生毒性。为确定合适的表达水平，应在正式实验前进行剂量梯度实验。</li>
 
 </ol>
</li>
<li>筛选胚胎，剔除未受精或受损的卵，并将剩余胚胎置于 28.5°C 培养。</li>
<li>24 小时后，使用荧光体视显微镜挑选表皮 GFP 和肌动蛋白 RFP 荧光强度较高的斑马鱼胚胎。将选中的胚胎继续置于 28.5°C 培养，待进行药物处理以诱导细胞凋亡时再继续后续操作。</li>
</ol>

2. 使用 G418 诱导斑马鱼幼鱼细胞外排
我们发现，氨基糖苷类抗生素 G418（又称 Geneticin）以一种未知机制诱导发育中斑马鱼幼鱼表皮细胞发生凋亡并脱落3。重要的是，该处理仅对受精后 4 天及更年长的幼鱼有效。我们观察到，在任一时间点，经 G418 处理的斑马鱼幼鱼鳍部上皮可观察到约 5–25 个正在脱落的细胞。由于不同个体间凋亡脱落细胞的数量可能存在差异，我们建议在成像时同时制备多条鱼样。
<ol>
	<li>收集受精后4天（dpf）同时表现出GFP和RFP荧光的斑马鱼幼鱼，放入含有3毫升（mL）E3培养液的35 × 10 mm培养皿中。每个该规格的培养皿最多可处理25条幼鱼。</li>
	<li>小心吸除原有培养液，更换为含1 mg/mL G418的3 mL E3培养液，并在28.5°C条件下将幼鱼在药物中孵育4小时。注意G418对光敏感，因此需确保培养皿保持遮盖或置于避光环境中。</li>
	<li>移除培养液，替换为预热至28.5°C、含0.02% Tricaine的E3培养液，随后进行幼鱼的封片操作。</li>
</ol>

3. 用于成像的斑马鱼幼体固定

<ol>
	<li>将3条幼鱼转移至1.5 ml离心管中，在鱼沉入管底后吸除大部分E3培养液。我们发现，在琼脂糖凝固前最多可妥善固定3只动物。</li>
 <li>使用剪去尖端的移液枪头，向管内加入120 µl 1% LM-琼脂糖（42°C），混匀，然后轻柔地将幼鱼与琼脂糖混合物转移至MatTek培养皿底部的盖玻片上。</li>
 <li>使用FST针持器并安装插入针或钨针，迅速调整幼鱼方向，使其平直贴附于MatTek培养皿的盖玻片表面。 
	注意：我们通常先用直针初步调整幼鱼位置，再用L形针确保其完全贴附于盖玻片，同时避免损伤样本。
</li>
 <li>待琼脂糖完全凝固后，轻柔地向培养皿中加入含0.02%三卡因（Tricaine）的E3培养液。
	注意：也可在成像用培养皿的E3中添加G418以持续诱导细胞外排，但长期暴露于1 mg/mL G418会导致幼鱼死亡。
</li>
</ol>
4. 利用转盘共聚焦显微镜对细胞挤出过程中肌动蛋白动态及单个上皮细胞行为进行活体成像

我们发现，凋亡细胞从斑马鱼幼体表皮中挤出的整个过程大约需要20分钟3。本文将演示如何设置延时成像实验，以采集穿过斑马鱼表皮单层的系列z平面图像，从而可视化细胞挤出过程。我们发现，普通的宽场荧光显微镜会导致肌动蛋白纤维发生显著的光漂白，无法实现延时成像。因此，为了最大限度地提高分辨率并防止光漂白，我们采用转盘共聚焦显微镜。以下我们将描述如何使用Andor IQ软件与尼康显微镜设置该实验，尽管所述原理也可适用于类似的显微镜系统。
<ol>
	<li>首先，打开氩离子激光器（用于在488 nm激发GFP）和氦氖激光器（用于在561 nm激发RFP）、显微镜、相机以及落射荧光灯。 </li>
 <li>在Andor IQ软件（版本1.10.1）中，创建一个时间序列采集方案，包含你希望成像的波长、图像采集之间的时间间隔频率以及采集重复的次数。 </li>
 <li>将装有样品的MatTek培养皿轻轻放置在显微镜载物台上，并使用20倍物镜配合透射光对幼虫进行调焦。 </li>
 <li>将40倍水浸物镜（数值孔径N.A. 0.8）移至正确位置。使用该物镜，我们每个视野可拍摄约20–25个细胞，既能追踪细胞在挤压过程中的行为，也能分辨亚细胞水平的肌动蛋白动态变化。注意：相同的样品固定与成像策略也可应用于正置显微镜，但必须使用具有长工作距离的40倍水浸物镜。 </li>
 <li>小心地在40倍物镜顶部滴加一滴水，然后迅速将MatTek培养皿置于其上。注意：如果水容易蒸发，可改用Zeiss Immersol浸没液。 </li>
 <li>使用相差或微分干涉（DIC）照明识别样品，然后使用488 nm落射荧光专门对GFP标记的表皮进行聚焦。 </li>
 <li>切换至共聚焦扫描模式。相应调整各通道（488 nm和561 nm）的激光强度和曝光时间。需谨慎平衡激光功率与曝光时间，以实现信号的最佳检测，同时避免光漂白或光毒性。 </li>
 <li>为识别正在挤压的细胞，先使用落射荧光观察GFP标记的表皮，寻找呈典型玫瑰花环样结构的一组细胞，即多个细胞围绕中央一个较小圆形细胞的排列。在共聚焦扫描模式下，应可见RFP标记的肌动蛋白在中央小细胞周围形成环状聚集，这是细胞挤压的标志性特征。一旦识别出正在挤压的细胞，应迅速设置显微镜以采集4D（X-Y-Z-时间）共聚焦数据集。 </li>
 <li>设定Z平面的上下限，以观察包含挤压细胞在内的单层表皮，并选择步进尺寸。对于延时成像，设定图像采集的时间间隔和重复次数。例如，我们通常每1–2分钟采集一次Z序列，总时长30分钟，Z序列范围为5–10 μm，步长为1 μm。 </li>
 <li>为查看数据，我们通常对Z序列进行三维投影重建，并将数据集保存为兼容QuickTime（Apple）的视频文件。通过这种方式，可随时间动态观察肌动蛋白环的收缩以及围绕死亡细胞发生的上皮行为变化。 </li>
</ol>
5. 代表性结果
<img src="/files/ftp_upload/2689/2689fig1.jpg" alt="细胞挤出示意图；肌动蛋白丝环的组装、收缩及细胞凋亡过程。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 凋亡细胞挤出的示意图。肌动蛋白丝以红色显示，GFP阳性表皮细胞为绿色。
<img src="/files/ftp_upload/2689/2689fig2.jpg" alt="鳍上皮细胞的4D数据集；RFP-UtrCH、CK:GFP幼鱼细胞外排，显微镜示意图。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2. 实验流程。A. 实验工作流程示意图。B. RFP-UtrCH在4日龄CK:GFP斑马鱼表皮中的表达。
<img src="/files/ftp_upload/2689/2689fig3.jpg" alt="荧光显微镜显示CK:GFP和RFP-UtrCH蛋白的定位；合并图像突出显示共定位情况。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 来自延时录像的静态帧（z投影），记录了上皮细胞脱落过程中活体肌动蛋白动态变化。箭头指示邻近细胞形成的肌动蛋白环，在2分钟内逐渐收缩并闭合。

<ol><li>Rosenblatt, J., Raff, M. C., Cramer, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+epithelial+cell+destined+for+apoptosis+signals+its+neighbors+to+extrude+it+by+an+actin-+and+myosin-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">An epithelial cell destined for apoptosis signals its neighbors to extrude it by an actin- and myosin-dependent mechanism.</a> Curr Biol. 11, 1847-1857 (2001).</li>
<li>Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+development+in+bony+fish+with+particular+emphasis+on+collagen+deposition+in+the+dermis+of+the+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio).</a> Int J Dev Biol. 48, 217-231 (2004).</li>
<li>Slattum, G., McGee, K. M., Rosenblatt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P115+RhoGEF+and+microtubules+decide+the+direction+apoptotic+cells+extrude+from+an+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">P115 RhoGEF and microtubules decide the direction apoptotic cells extrude from an epithelium.</a> J Cell Biol. 186, 693-702 (2009).</li>
<li>Burkel, B. M., Dassow, G. von, Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+fluorescent+probes+for+actin+filaments+based+on+the+actin-binding+domain+of+utrophin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 64, 822-832 (2007).</li>
<li>Berndt, J. D., Clay, M. R., Langenberg, T., Halloran, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho-kinase+and+myosin+II+affect+dynamic+neural+crest+cell+behaviors+during+epithelial+to+mesenchymal+transition+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Rho-kinase and myosin II affect dynamic neural crest cell behaviors during epithelial to mesenchymal transition in vivo.</a> Dev Biol. 324, 236-244 (2008).</li>
<li>Gong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fluorescent+protein+expression+in+germ-line+transmitted+transgenic+zebrafish+under+a+stratified+epithelial+promoter+from+keratin8%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">fluorescent protein expression in germ-line transmitted transgenic zebrafish under a stratified epithelial promoter from keratin8.</a> Dev Dyn. 223, 204-215 (2002).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%2C+A+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The Zebrafish Book, A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio)</a>. , 4th edition, University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2000).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Curado, S., Stainier, D. Y., Anderson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitroreductase-mediated+cell%2Ftissue+ablation+in+zebrafish%3A+a+spatially+and+temporally+controlled+ablation+method+with+applications+in+developmental+and+regeneration+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies.</a> Nat Protoc. 3, 948-954 (2008).</li>
</ol>

动物福利保证
本方案中使用斑马鱼（Danio rerio）开展的所有操作均已获得犹他大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准（动物福利保证编号：#10-07017）。

本文所述方案展示了一种简单直接的方法，用于在活体上皮组织中可视化细胞挤压过程。此类实验使我们能够观察到在固定组织分析中此前未被充分认识的肌动蛋白动态的细微特征，从而补充了常用的免疫荧光方法。我们可以将本方案与化学抑制剂或遗传突变体结合使用，以更深入地分析细胞挤压过程，并研究因无法清除凋亡细胞而导致的疾病状态，我们预计这将引发炎症反应或受损细胞的积累，如在癌症中所见。例如，我们实验室此前已证明，化学抑制剂可与G418联合使用，以改变肌动蛋白丝在细胞基底外侧表面的定位，从而影响细胞挤压的方向3。当前方法的一个局限性在于，由于细胞死亡具有随机性和不可预测性，我们的数据集通常集中在挤压过程的后期阶段。为了研究多细胞肌动蛋白环的形成及收缩的启动，未来的实验将采用技术手段，在一组经荧光标记且遗传靶向诱导凋亡的上皮细胞中诱导细胞凋亡10。将该策略与我们在表皮中成像肌动蛋白动态的方法相结合，应有助于研究导致凋亡细胞挤压的早期步骤。总体而言，这些实验所获得的信息将显著增进我们对上皮细胞挤压及其医学意义的理解。

<table><tbody><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>试剂</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>mMessage mMachine SP6 Kit</td><td>试剂</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>交配箱</td><td>工具</td><td>Thoren Aquatic Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>移液器泵</td><td>工具</td><td>Bel Art Products</td><td>F3789</td><td></td></tr><tr><td>5&lt;sup&gt; &amp;#190;&lt;/sup&gt; 巴斯德移液管</td><td>工具</td><td>VWR international</td><td>14672-608</td><td></td></tr><tr><td>显微注射模具</td><td>工具</td><td>Adaptive Science Tools</td><td>I-34</td><td></td></tr><tr><td>100x15mm 培养皿</td><td>工具</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>Flamming/Brown 微量移液管拉制仪</td><td>工具</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Model P97</td><td></td></tr><tr><td>带纤维的硼硅酸盐玻璃毛细管</td><td>工具</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>B1400-78-10</td><td>外径 1.0mm，内径 0.78mm，长度 10cm</td></tr><tr><td>电极储存罐</td><td>工具</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>E210</td><td></td></tr><tr><td>酚红</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290</td><td>DPBS 中 0.5%</td></tr><tr><td>压力控制显微注射仪和显微操作器</td><td>工具</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PLI-100</td><td></td></tr><tr><td>35x10mm 培养皿</td><td>工具</td><td>Cellstar</td><td>627-160</td><td></td></tr><tr><td>G418（遗传霉素）</td><td>试剂</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10131-035</td><td>dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0 中 50 mg/mL</td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子</td><td>工具</td><td>Fine Science Tools</td><td>11253-20</td><td></td></tr><tr><td>12cm 针头夹持器</td><td>工具</td><td>Fine Science Tools</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>插入针</td><td>工具</td><td>Fine Science Tools</td><td>26007-02 和 -03</td><td></td></tr><tr><td>带 1.5 盖玻片的玻璃底培养皿</td><td>工具</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35G-1.5-10-C</td><td></td></tr><tr><td>低熔点琼脂糖</td><td>试剂</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1360-100</td><td></td></tr><tr><td>三卡因</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5040</td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>显微镜</td><td>Leica Microsystems</td><td>MZ6</td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>显微镜</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ645</td><td></td></tr><tr><td>荧光解剖显微镜</td><td>显微镜</td><td>Olympus Corporation</td><td>S2X12</td><td></td></tr><tr><td>转盘共聚焦显微镜</td><td>显微镜</td><td>Nikon Instruments</td><td>Eclipse Ti</td><td>配备 Yokagawa 转盘头</td></tr><tr><td>CCD 相机</td><td>相机</td><td>Andor</td><td>DV-885-VP</td><td>1002x1004 像素，8 微米方形像素</td></tr></tbody></table>

活体成像观察斑马鱼发育过程中表皮细胞的挤出

Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

上皮组织的稳态维持需要持续清除受损细胞，同时不破坏其屏障功能。我们的研究发现，即将死亡的细胞会向周围的活细胞发送信号，促使它们形成并收缩一个肌动蛋白和肌球蛋白构成的环状结构，将死亡细胞从上皮层中排出，并在细胞排出后及时闭合可能形成的空隙，这一过程称为细胞挤出1。斑马鱼发育过程中的光学透明性为在活体上皮组织中观察细胞挤出提供了理想的系统。本文描述了一种在幼年斑马鱼表皮中诱导并成像细胞挤出的方法。为了可视化细胞挤出过程，我们在表皮表达绿色荧光蛋白的转基因斑马鱼单细胞期胚胎中注射标记了红色荧光蛋白的F-肌动蛋白探针，并通过向幼鱼中添加G418诱导细胞凋亡。随后，利用转盘共聚焦显微镜进行延时成像，观察凋亡细胞挤出过程中肌动蛋白的动态变化及上皮细胞的行为。该方法使我们能够在活体上皮组织中研究细胞挤出过程，并为探索因无法有效清除凋亡细胞而导致的疾病状态提供途径。

濒死细胞通过邻近细胞的协同收缩从上皮组织中被挤出，而不会破坏其屏障功能。斑马鱼发育过程中具有良好的光学通透性，为在活体上皮中可视化观察细胞挤出提供了优良的实验系统。本文中，我们描述了在幼年斑马鱼表皮中诱导并以细胞分辨率成像细胞挤出的方法。

上皮组织的稳态维持需要在不破坏屏障功能的前提下持续清除受损细胞。我们的研究发现……

上皮组织的维持需要在不破坏屏障功能的前提下持续清除受损和死亡的细胞。为实现这一过程，上皮细胞会通过在包围死亡细胞的邻近细胞中形成并收缩由肌动蛋白和肌球蛋白构成的环状结构，将死亡细胞挤出，同时闭合其退出后可能产生的任何间隙。在本视频文章中，介绍了一种实时诱导并成像斑马鱼幼鱼表皮中凋亡细胞挤出的方法。如图所示，通过将红色荧光蛋白标记的F-肌动蛋白探针注射到表皮表达绿色荧光蛋白的单细胞阶段转基因斑马鱼胚胎中，以观察上皮组织中的肌动蛋白丝。在个性化处理后的第四天，选取同时表达GFP和RFP的幼鱼，用G418处理以诱导表皮细胞发生凋亡。通过转盘共聚焦显微镜进行延时成像，观察细胞挤压过程中肌动蛋白动态变化及上皮细胞形态的改变。与现有的免疫力学分析等方法相比，该技术的主要优势在于，我们能够观察到活体上皮组织中细胞挤出过程中发生的快速变化和肌动蛋白动态。在本视频中，我们将向您展示一种实时成像斑马鱼发育过程中表皮细胞凋亡挤出的方法。我们实验室利用该方法研究细胞如何协调重组其肌动蛋白细胞骨架，以清除凋亡细胞，同时维持屏障功能，以及挤出过程的紊乱如何可能导致某些疾病状态。接下来开始操作：为了观察斑马鱼发育过程中表皮细胞挤压时的肌动蛋白动态，首先将先前转录的RNA置于冰上解冻。我们转录编码红色荧光蛋白的mRNA，该蛋白与乌特罗菲蛋白（utrophin）的钙蛋白同源结构域及肌动蛋白结合蛋白相融合。按1:1比例向RNA中加入酚红，使RNA终浓度约为30纳克/微升，并通过反向填充将1微升溶液加入拉制的毛细玻璃针中。在 E3 缓冲液中收集约 75 个单细胞期的 C-K-G-F-P 胚胎。使用 5 又 3/4 号帕斯塔移液管将收集的胚胎转移至显微注射模具中，并用 FST Dumont #5 镊子在凹槽中轻柔地调整胚胎方向，操作需迅速，以避免在标准实验室解剖立体显微镜下对多阶段胚胎进行 RNA 注射。使用压力控制的显微注射器将RNA注入胚胎的卵黄中，以酚为化石。注射后，胚胎中应可见红色。每次实验务必至少注射50个胚胎。筛选胚胎，去除未受精或受损的卵，并将所有剩余胚胎在28 °C条件下孵育。24小时后，使用荧光解剖显微镜挑选表皮中具有高水平GFP荧光以及RFP标记肌动蛋白荧光的斑马鱼胚胎。将选出的胚胎在28 °C继续孵育，直至准备进行药物处理以诱导暴露于氨基糖苷类药物后的细胞凋亡。抗生素G four 18或药物可导致发育中的斑马鱼幼鱼表皮细胞发生凋亡性细胞外排。值得注意的是，该处理仅对受精后四天及更晚期的幼鱼诱导细胞外排有效。收集最多25条受精后四天、同时表达GFP和RFP的斑马鱼幼鱼，置于含有3毫升E three培养基的35 mm × 10 mm培养皿中。小心地将培养基更换为 3 毫升含有 1 毫克/毫升 G418 的 E3 培养基，并在 28 摄氏度避光条件下孵育幼虫 4 小时。随后移除培养基，更换为预热的含 0.02% 三卡因（trica）的 E3 培养基，准备进行幼虫封片以用于成像。将最多 3 条幼虫转移至 1.5 毫升离心管中，并吸除大部分 E3 培养基。使用剪切过的移液枪头，将 120 微升 1% 低熔点琼脂糖移入离心管中混合。然后轻柔地将幼虫与琼脂糖混合物移至 Matech 培养皿底部的盖玻片上。使用带有插针或连接钨针的 FST 针持器，迅速调整幼虫的方向，使其平直贴附于盖玻片表面。让琼脂糖凝固，然后轻轻加入含有0.02%曲拉通的E3培养基。我们发现，凋亡细胞从发育中的斑马鱼幼鱼表皮排出的整个过程大约需要20分钟。在此，我们演示如何使用转盘共聚焦显微镜及 Andor IQ 软件设置延时成像实验，以采集贯穿斑马鱼表皮单层的连续 Z 平面图像序列。首先，在 Andor IQ 软件中启动氩离子激光器、氦氖激光器、显微镜相机和落射荧光光源。创建一个时间序列实验方案，包含待成像的各波长参数。根据设定的时间间隔频率进行图像采集，并重复采集指定次数。轻柔地将装有样品的Mattec培养皿放置在显微镜载物台上，使用20倍物镜配合透射光对焦到幼虫上。将40倍水浸物镜移至正确位置。使用该物镜，我们每视野可拍摄约20至25个细胞，既能追踪细胞在挤出过程中的行为，又能分辨亚细胞水平的肌动蛋白动态变化。在40倍物镜顶部小心滴加一滴水，迅速将Mattec培养皿置于其上。先使用明场照明找到样本，然后使用488纳米的落射荧光，精确聚焦于GFP阳性的表皮。切换至共聚焦扫描模式。根据每个通道的情况调整激光强度和曝光时间。注意平衡激光功率和曝光时间，以实现信号的最佳检测，并防止任何光毒性。为了识别突出的细胞，使用落射荧光观察标记了GFP的表皮，并识别出呈典型玫瑰花环结构的细胞群，即一组细胞围绕中央一个小的圆形细胞排列。此外，应可见RFP标记的肌动蛋白在中央小圆形细胞周围聚集形成环状结构，这是细胞挤压的典型特征。一旦确定了正在挤压的细胞，应迅速设定Z系列的上下限及步长，然后开始采集四维共聚焦数据集，以观察数据并可视化肌动蛋白环的收缩以及围绕死亡细胞发生的上皮行为。随时间推移，对Z系列图像生成三维投影，并将数据保存为视频文件。此步骤可使用多种软件包完成。该图显示了受精后四天的CK GFP斑马鱼幼鱼表皮中RFP UTR CH的表达情况。此处显示的是来自延时电影的静止帧Z投影，用于追踪活体肌动蛋白的动力学过程。在上皮细胞挤出过程中，箭头指示的是邻近细胞形成的肌动蛋白环，该环在两分钟内逐渐收缩并闭合。通过此方法，我们可以将其与其他技术结合使用，例如化学抑制剂或基因突变，以更深入地理解细胞挤出过程的改变如何导致某些疾病状态。由于未能清除凋亡细胞，我们刚刚向您展示了如何建立延时成像实验，以观察斑马鱼发育过程中表皮细胞的挤出过程。在执行该操作时，重要的是要注意限制样品暴露在光照下的时间，以防止发生光漂白或光毒性。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利。

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