发展中国家斑马鱼的表皮细胞挤压实时成像

维持上皮组织需要连续去除受损和垂死的细胞，而不会破坏屏障功能。为了实现这一点，上皮通过在垂死细胞周围的细胞中形成和收缩肌动蛋白和肌球蛋白环来挤出垂死细胞，将其弹出，同时关闭可能因其退出而导致的任何间隙。在这篇视频文章中，一种从斑马鱼幼鱼表皮实时诱导和成像凋亡细胞挤出的方法。

如图所示，这是通过将红色荧光蛋白标记的 F 肌动蛋白探针注射到一个细胞阶段的转基因斑马鱼胚胎中来实现的，该胚胎在表皮中表达绿色荧光蛋白，以可视化上皮组织中的作用丝。第 4 天，然后用 G four 18 处理同时表达 GFP 和 RFP 的个性化后幼虫以诱导表皮细胞凋亡。挤出过程中发生的肌动蛋白动力学和上皮细胞形状变化通过转盘共聚焦显微镜上的延时成像可视化。

与免疫力和分析等现有方法相比，该技术的主要优点是，我们可以观察到在活上皮组织中挤出过程中发生的快速变化和肌动蛋白动力学。在本视频中，我们将向您展示一种从发育中的斑马鱼表皮中实时挤出凋亡细胞的成像程序。我们在实验室中使用该程序来了解细胞如何协调地重排其作用细胞骨架以去除凋亡细胞，同时保持屏障功能，以及破坏挤出过程如何导致某些疾病状态。

那么让我们开始吧：为了可视化发育中的斑马鱼表皮中细胞挤出过程中的作用动力学，首先在冰上解冻先前转录的 RNA。我们转录编码红色荧光蛋白的 Mr.mRNA，该蛋白与 utrophin 同源结构域中的 calp 融合，并参与结合蛋白。以 1：1 的比例向 RNA 中加入酚红，使最终 RNA 浓度约为 30 ng/μL，并通过回填将 1 μL 溶液加载到拉出的毛细管针中。

在 E 3 缓冲液中收集大约 75 个 1 细胞期 C-K-G-F-P 胚胎。用 5 和 3/4 意大利面移液管将收集的胚胎移液到显微注射模具中，并使用 FST Dumont 轻轻地将胚胎定位在槽中。第五，镊子起效迅速，以避免在标准实验室解剖立体显微镜下将 RNA 注射到多阶段胚胎中。

使用压力控制的微型注射器将 RNA 作为苯酚化石注射到胚胎的轭中。注射后，胚胎中应可见红色。确保每个实验至少注射 50 个胚胎。

对胚胎进行分类以去除任何未受精或损坏的鸡蛋，并在 28 摄氏度下孵化所有剩余的胚胎。24 小时后，使用荧光解剖显微镜选择在表皮中具有高水平 GFP 荧光和 RFP 标记的作用荧光的斑马鱼胚胎。在 28 摄氏度下孵育选定的胚胎，直到准备好进行药物治疗以诱导细胞凋亡暴露于氨基糖苷。

抗生素 G four 18 或药物导致凋亡细胞从发育中的斑马鱼幼虫的表皮中挤出。重要的是，这种处理仅适用于受精后 4 天及以上的幼虫，以诱导细胞挤出。将多达 25 只同时表达 GFP 和 RFP 的受精后 4 天的斑马鱼幼虫收集到含有 3 毫升 E 3 培养基的 35 x 10 毫米培养皿中。

小心地用 3 毫升 E 三替换培养基，每毫升含有 1 毫克 G four 18，并将幼虫在药物中在 28 摄氏度的黑暗中孵育 4 小时。然后取出培养基，用预热的 E 替换三种含有 0.02% trica 的培养基，然后继续安装幼虫以安装幼虫进行成像。将最多三只幼虫转移到 1.5 毫升的 fendor 管中，并去除大部分 E 三种培养基。

使用切割的移液器吸头将 120 微升 1% 低熔点吸管加入试管混合物中。然后轻轻地将幼虫和 aro 混合物移液到 matech 培养皿底部的盖玻片上。使用附有插入针或钨针的 FST 针架，快速调整幼虫的方向，使它们笔直平放在盖玻片上。

让 aose 凝固。然后用含有 0.02% trica 的 E 3 培养基轻轻填充培养皿。我们发现，从发育中的斑马鱼幼虫的表皮挤出凋亡细胞的整个过程大约需要 20 分钟。

在这里，我们演示了如何使用转盘共聚焦显微镜和或或IQ软件设置延时成像实验，以通过斑马鱼表皮的单层收集一系列Z平面。首先，在 AND / 或 IQ 软件中启动氩和氦氖激光器显微镜相机和 Epi 荧光灯。创建包含要成像的波长的时间序列协议。

图像捕获间隔的频率和重复捕获的次数 轻轻地将包含标本的 mattec 培养皿放在显微镜载物台上，然后使用带有透射光的 20 倍物镜聚焦在幼虫上。将 40 倍水浸物镜移至正确位置。使用这个物镜，我们可以每个视野拍摄大约 20 到 25 个细胞，这使我们能够跟踪挤出过程中的细胞行为，同时还可以解析亚细胞作用动力学。

小心地将一滴水滴在 40 倍物镜的顶部，然后快速将 mattec 培养皿放在上面。使用明场照明识别标本，然后使用 488 纳米落射荧光专门聚焦在 GFP 阳性表皮上。切换到共聚焦扫描模式。

相应地调整每个通道的激光强度和曝光时间。注意平衡激光功率和曝光时间，以最佳方式检测您的信号并防止任何光毒性。为了识别挤出细胞，使用落射荧光可视化 GFP 标记的表皮，并识别一组经典玫瑰花结图案中的细胞，该细胞由一组细胞组成，围绕着中间的一个小圆形细胞。

此外，应该有 RFP 标记的肌动蛋白的积累，可见为在中间的小圆形细胞周围形成一个环，这是细胞挤压的标志。确定凸出单元后，快速设置 Z 系列的上限和下限以及步长。然后开始采集四个 D 共聚焦数据集，以查看数据并可视化肌动蛋白环的收缩和垂死细胞周围发生的上皮行为。

随着时间的推移，制作 Z 系列的 3D 投影并将数据保存为影片文件。可以使用各种软件包来执行此步骤。该图显示了受精后 4 天的 CK GFP 斑马鱼幼虫表皮中 RFP UTR CH 的表达。

此处仍帧延时电影的 Z 投影，这些投影遵循实时表演动态。在上皮细胞挤压过程中，箭头表示由相邻细胞形成的肌动蛋白环，该环在两分钟内收缩和闭合。遵循此程序，我们可以将其他方法与该技术结合使用，例如使用化学抑制剂或基因突变，以更好地了解改变挤出如何导致某些疾病状态。

由于未能清除凋亡细胞，我们刚刚向您展示了如何设置延时成像实验，以可视化发育中的斑马鱼表皮的挤出过程。执行此程序时，请务必记住限制暴露于标本的光量，以防止任何光漂白或毒性。就是这样。

感谢您的观看，祝您的实验好运。