Name: 确定基因表达概况 C。线虫使用微阵列和实时PCR (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: 了解如何使用微阵列分析和实时PCR技术确定秀丽隐杆线虫的基因表达谱，并通过生物信息学工具进行数据处理和验证，为神经科学和遗传学研究提供可靠的实验框架。

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本工作由位于俄克拉荷马州韦瑟福德的南俄克拉荷马州立大学的本科学生完成。本研究得到美国国家科学基金会RUI-0963258项目、美国国立卫生研究院俄克拉荷马州INBRE项目2P20RR016478、GCAT以及OCAST HR09-137S项目的资助。
vsm1(ok1468) 突变体由俄克拉荷马基因敲除联盟分离获得。 
作者感谢 Dan Stefanovic 和 Tanner Wheeler 在项目执行过程中提供的宝贵帮助。

<ol><li>Chai, A., Withers, J., Koh, Y. H., Parry, K., Bao, H., Zhang, B., Budnik, V., Pennetta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hVAPB%2C+the+causative+gene+of+a+heterogeneous+group+of+motor+neuron+diseases+in+humans%2C+is+functionally+interchangeable+with+its+Drosophila+homologue+DVAP-33A+at+the+Neuromuscular+Junction%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">hVAPB, the causative gene of a heterogeneous group of motor neuron diseases in humans, is functionally interchangeable with its Drosophila homologue DVAP-33A at the Neuromuscular Junction.</a> Hum Mol Genet. 17, 266-280 (2008).</li>
<li>Tsuda, H., Han, S. M., Yang, Y., Tong, C., Lin, Y. Q., Mohan, K., Haueter, C., Zoghbi, A., Harati, Y., Kwan, J., Miller, M., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis+8+protein+VAPB+is+cleaved%2C+secreted%2C+and+acts+as+a+ligand+for+Eph+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Amyotrophic Lateral Sclerosis 8 protein VAPB is cleaved, secreted, and acts as a ligand for Eph receptors.</a> Cell. 133, 963-977 (2008).</li>
<li>Dresbach, T., Torres, V., Wittenmayer, N., Altrock, W. D., Zamorano, P., Zuschratter, W., Nawrotzki, R., Ziv, N. E., Garner, C. C., Gundelfinger, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+Active+Zone+Precursor+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Assembly of Active Zone Precursor Vesicles.</a> Journal of Biological Chemistry. 281, 6038-6047 (2005).</li>
<li>Lustgarten, V., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+VSM1+Encodes+a+v-SNARE+Binding+Protein+That+May+Act+as+a+Negative+Regulator+of+Constitutive+Exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Yeast VSM1 Encodes a v-SNARE Binding Protein That May Act as a Negative Regulator of Constitutive Exocytosis.</a> Molecular and Cellular Biology. 19, 4480-4494 (1999).</li>
<li>Viñuela, A., Snoek, L., Riksen, J., Kammenga, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+Gene+Expression+Analysis+in+Response+to+Organophosphorous+Pesticide+Chlorpyrifos+and+Diazinon+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide Gene Expression Analysis in Response to Organophosphorous Pesticide Chlorpyrifos and Diazinon in C. elegans.</a> PloS one. 5, 1-8 (2010).</li>
<li>Niwa, R., Hada, K., Moliyama, K., Ohniwa, R., Tan, Y., Olsson-Carter, K., Chi, W., Reinke, V., Slack, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((elegans+sym-1+is+downstream+target+of+the+hunchback-like-1+developmental+timing+transcription+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">elegans sym-1 is downstream target of the hunchback-like-1 developmental timing transcription factor.</a> Cell Cycle. 8, 4147-4154 (2009).</li>
<li>Kershner, A., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+mRNA+targets+for+Caenorhabditis+elegans+FBF%2C+a+conserved+stem+cell+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of mRNA targets for Caenorhabditis elegans FBF, a conserved stem cell regulator.</a> PNAS. 107, 3963-3941 (2010).</li>
<li>Hammock, E., Eagleson, K., Barlow, S., Earls, L., Miller, D., Levitt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologs+of+genes+expressed+in+Caenorhabditis+elegans+GABAergic+neurons+are+also+found+in+the+developing+mouse+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Development%22%5BJournal%5D)">Homologs of genes expressed in Caenorhabditis elegans GABAergic neurons are also found in the developing mouse forebrain.</a> Neural Development. 5, 1-14 (2010).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

在本研究中，我们开发了一种简便且用户友好的实验方案，可用于确定各种生物学现象背后的基因表达谱。该方案首先分离总RNA，并用DNase I进行处理。我们的RNA提取方法通过省略苯酚抽提步骤并采用亲和树脂纯化，已得到显著简化5,6。简言之，通过液氮冷冻线虫并用分子树脂研磨，使C. elegans的角质层和细胞膜破裂。随后，在cDNA合成前，将提取的RNA用DNase I处理。此步骤的加入旨在最大限度减少非特异性杂交；若RNA样品被基因组DNA污染，可能引入干扰并产生大量假阳性结果。接着，将野生型和vsm-1(ok1468)突变体的cDNA分别标记Cy3和Cy5捕获序列，并杂交至通过GCAT项目获得的C. elegans微阵列芯片上。该系统比类似产品更灵敏，其双色设计减少了所需芯片数量，从而提高了时间和成本效率7,8。此外，该系统无需其他类似系统所需的专用设备，因此可在任何标准实验室环境中完成7。第三步，使用开源软件MAGICTool分析荧光杂交芯片图像，并生成基因表达谱。MAGICTool是一款用户友好的程序，适用于从本科生到博士后各级经验水平的研究人员。然而，其最佳性能需要较大的内存支持。最后，通过实时PCR验证微阵列分析获得的候选基因。
尽管基因组学方法是研究生物学现象的有效手段，但仍有一些局限性需要考虑。首先，尽管本微阵列实验方案具有特异性，但如果所使用的寡核苷酸探针来自保守序列，则同一基因家族内的转录本彼此之间无法区分。实时PCR可弥补基因家族内部序列相似性带来的问题，甚至能够区分同一基因的不同异构体。然而，实时PCR面临的一个挑战是难以找到在整个生物体生命周期中表达水平恒定的真正对照基因，因此其结果只能是相对定量。蛋白质组学方法是本技术的一种替代方案，可通过二维凝胶电泳分离单个蛋白质，并利用质谱技术进行鉴定。
我们的研究明确表明，在突触密度增加的 vsm-1 突变型线虫中，主要精子蛋白（Major Sperm Protein, MSP）家族的多个成员被诱导表达。MSP 是 C. elegans 特有的蛋白，负责卵母细胞成熟和排卵过程。Chai 1 的研究证明，在果蝇神经肌肉接头处，突触前小体的数量和大小可能由含有主要精子蛋白结构域的分子调控。Tsuda 及其同事的研究 2 表明，主要精子蛋白结构域可能作为Ephrin受体的配体，触发受体酪氨酸激酶信号级联反应。此外，实时PCR分析验证并缩小了微阵列结果的范围，最终聚焦于 msp 家族中的一个成员——msp-32。综上所述，本文所呈现的工作不仅对神经科学领域的一个核心难题进行了全基因组水平的分析，也彰显了本科生科研在科学探索中的重要作用。

<table><tbody><tr><td>RNA Later</td><td>Ambion</td><td>AM7020</td><td></td></tr><tr><td>分子研磨树脂</td><td>G-Biosciences</td><td>786-138</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>无RNase琼脂糖LE</td><td>Ambion</td><td>AM9040</td><td></td></tr><tr><td>NorthernMax Gly 10X 凝胶配制/电泳缓冲液</td><td>Ambion</td><td>8678</td><td></td></tr><tr><td>RNA Millenium 标记物</td><td>Ambion</td><td>AM7150</td><td></td></tr><tr><td>乙二醛上样染料</td><td>Ambion</td><td>8551</td><td></td></tr><tr><td>DNase 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy MinElute 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>逆转录酶及5X反应缓冲液</td><td>Genisphere</td><td>RT300320</td><td></td></tr><tr><td>Array 350</td><td>Genisphere</td><td>W300180</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR 纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>20X SSC</td><td>VWR international</td><td>82021-4846</td><td></td></tr><tr><td>剪切鲑精DNA</td><td>Ambion</td><td>AM9680</td><td></td></tr><tr><td>SDS溶液</td><td>Promega Corp.</td><td>V6551</td><td></td></tr><tr><td>DTT EM</td><td>VWR international</td><td>3860</td><td></td></tr><tr><td>iScript cDNA 合成试剂盒</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8890</td><td></td></tr><tr><td>iQ SYBR Green 超级混合液</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8880</td><td></td></tr></tbody></table>

使用微阵列和实时 pcr 确定秀丽隐杆线虫（c. elegans）的基因表达谱

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

突触由信号细胞中的突触前活性区和靶细胞中的突触后终末组成。在化学突触中，信息通过从突触前终末释放的神经递质传递，并由突触后细胞上的受体接收。我们先前在Caenorhabditis elegans中的研究表明，VSM-1负调控胞吐作用。此外，对vsm-1突变体中突触的分析显示，缺乏完全功能性VSM-1的动物其突触连接性增加。基于这些初步发现，我们假设C. elegans中的VSM-1可能在突触形成过程中发挥关键作用。为验证这一假设，我们进行了双标记微阵列分析，并确定了基因表达谱。首先，提取总RNA，逆转录为cDNA，然后与DNA微阵列杂交。随后，对荧光探针杂交结果进行计算机分析，发现突触形成增强的突变体中，编码主要精子蛋白家族（MSP）成员的多个基因显著上调。MSP是C. elegans精子的主要成分，似乎可促进线虫卵母细胞的成熟和排卵。在果蝇中，Chai及其同事1证明MSP样分子可调控神经肌肉接头处突触前小结的数量和大小。此外，Tsuda及其合作者2的研究表明，MSP可能作为Eph受体的配体，触发受体酪氨酸激酶信号级联反应。最后，实时PCR分析证实，在vsm-1(ok1468)突变体中编码MSP-32的基因表达上调。综上所述，我们实验室的研究表明，vsm-1突变体的突触密度显著增加，这一现象可能由MSP-32信号通路介导。

采用微阵列分析来确定秀丽隐杆线虫（C. elegans）的基因表达谱，并利用实时PCR对微阵列数据进行验证和定量。

使用微阵列和实时 PCR 确定秀丽隐杆线虫（C. elegans）的基因表达谱

突触由信号细胞中的突触前活性区和靶细胞中的突触后终末组成。在化学突触的情况下，……

本实验的总体目标是研究多种表型或代谢通路背后的基因表达谱。首先从两种不同的线虫品系中分离 mRNA，以实现这一目标。实验的第二步是合成含有 SSI three 或 SFI 捕获序列的 cDNA，并将其与微阵列进行杂交。该实验流程的第三步是将微阵列与含有S SI 3和SCIFI fluoro 4的抗捕获序列进行杂交。流程的最后一步是扫描微阵列，并使用生物信息学工具（如magic tool软件）分析数据。最终，可鉴定出介导所研究生物学现象的候选基因，并可通过实时PCR等替代技术对其进行验证和定量。通常，初次使用该方法的研究人员会遇到困难，因为用户无法直接观察到已点样的核苷酸，因此很难将均一的杂交混合物均匀覆盖在两万三千个以上的点样位点上。首先从健康且同步化的线虫中提取RNA。具体步骤为：先将线虫洗涤后重悬于15毫升离心管中，离心收集虫体沉淀，再将虫体沉淀重悬于7毫升0.1摩尔/升氯化钠溶液和7毫升冰冻的、60%（质量/体积）蔗糖溶液中。冰上孵育15分钟后，再次离心收集线虫。此时无菌线虫会游出，将其收集后用无RNA酶的水洗涤并离心成团。再次将干净且松散聚集的沉淀转移至微量离心管中，以最大速度离心30秒。吸取后，在4°C条件下用10倍体积的RNA later保存，直至准备进行后续操作。为制备总RNA样品，将制备好的沉淀在最大转速下离心，弃去上清液，并向沉淀中加入少量分子研磨树脂。然后使用液氮和研杵将混合物冷冻。将冷冻的线虫悬液在研磨过程中加入液氮，研磨成细粉，必要时补充液氮以保持粉末低温。将提取物置于冰上静置五分钟。五分钟后，将提取物与700 µL R-L-T-B-M-E和472 µL 100%乙醇充分混合。现在可以使用市售试剂盒从每个生物学样本中分离RNA，最终获得60 µL体积的RNA。在继续实验前，需先用DNase I处理以去除可能存在的基因组DNA污染，随后使用市售的RNA纯化试剂盒进行纯化。完成试剂盒操作后，确保最终RNA体积为60 µL。最后，通过乙二醛上样、染料处理及凝胶分析，在进行微阵列杂交前测定RNA浓度并评估其完整性。采用常规方法纯化的RNA被逆转录为互补DNA，随后使用市售试剂盒去除降解的模板，并浓缩至60 µL体积。开始微阵列杂交前，先用声波破碎的鲑鱼精子DNA对微阵列芯片进行封闭。封闭1小时后，将芯片浸入双蒸水中轻轻颠倒洗涤，然后离心。将载玻片放入由无尘纸垫底的50毫升锥形管中干燥。现在配制两倍浓度的甲酰胺杂交缓冲液。首先，在55摄氏度下预热10分钟，以充分溶解其中的晶体。然后在10,000 ×g下离心1分钟。接着，将25 µL的CD NA与25 µL杂交缓冲液混合，并轻轻弹击管壁使混合均匀。随后对混合液进行短暂离心，并在80 °C下孵育10分钟。孵育结束后，小心地用移液器将整个cDNA样品加到微阵列玻片上，注意不要触碰玻片。为使样品均匀分布在微阵列玻片上，使用注射器针头轻轻将盖玻片放低至玻片表面；在盖玻片完全放下之前，将其稍微抬起，再次用针头引导缓慢放下，使盖玻片轻柔地就位。该技术可最大限度地减少气泡的形成。现在将载玻片水平放置于一个50毫升的锥形管中，在载玻片下方加入50微升双蒸水，并于37摄氏度孵育过夜。次日，将载玻片洗涤后进行第二次短暂杂交。在第二缓冲液中多次进行 SSC 处理，该缓冲液包含对光敏感的捕获试剂和一种 Antifa 试剂，采用相同技术加入，随后进行短时间孵育，更多洗涤步骤以及干燥。然后即可扫描玻片。可使用免费的开源 magic 工具软件分析图像。在项目选项卡下，简要操作如下：在“构建表达谱”选项卡中创建并保存一个新项目，选择加载图像对，并将红色图像文件选为红色通道，绿色图像文件选为绿色通道。然后进入“构建表达谱”选项卡，选择加载基因列表，上传从GCAT网站获取的C. elegans基因列表文件，以对微阵列图像进行定位和网格化处理。选择“构建表达谱”选项卡并创建编辑网格选项。现在编辑网格。在设置对话框中，将网格数量设为48，每个网格的行数和列数均设为22，并选择从左到右、从上到下对点位进行编号。增加对比度变化百分比，并放大网格，直到各个斑点清晰可辨。通过在左侧面板上选择左上角的设定斑点，然后依次点击第一个网格中左上角斑点的中心、右上角斑点以及底行，来创建网格。按照从左到右、从上到下的顺序，对全部48个网格重复此网格划分操作。然后，通过选择文件选项卡并保存当前网格，完成保存操作。选择“完成”选项卡，以从分析中剔除任何无关的斑点。打开“构建表达谱”选项卡，在寻址网格选项下的“斑点标记”中进行选择。现在标记任何划线斑点或背景荧光，并通过选择“保存当前标记”进行保存。在文件选项卡下，应对接标记的文件进行分割。最后，在表达选项卡中选择“探索”，以分析由特定因子诱导或抑制的基因。在探索性对话框中，设置精细基因匹配标准。表达水平的两倍增加或减少，其强度记为 x，x 的值即为表达变化的标准。对于诱导基因，X 的输入条件为最大值大于 X；对于抑制基因，则为最小值小于 X。在本实验中，进行染料交换对照：分别从三龄和四龄幼虫中独立提取两份总 RNA，一份以绿色标记的突变体与红色标记的野生型杂交，另一份以红色标记的突变体与绿色标记的野生型杂交，以验证基因表达变化。采用相同方法制备三份独立的总 RNA 提取物，使用 commercially available kit 合成 cDNA，并对每份 cDNA 样本进行实时 PCR 检测，每样本设三个复孔，以内参基因为对照。作为示例，以下结果分析了 VSM1 中被诱导的基因表达情况。AK 1468 突变体是一种突触增强的线虫品系。在进行微阵列分析之前，需通过凝胶电泳检测所提取 RNA 的质量。在 DNase I 处理前后均出现两条完整的核糖体亚基，表明 RNA 样品质量良好。在微阵列中，野生型 cDNA 标记为红色，VSM-1 突变体 cDNA 标记为绿色。在此每张微阵列分析的 48 个网格之一中，每个小方格代表一个单独打印的寡核苷酸；在每个阵列中，每种独特的寡核苷酸均有对应位置。一旦对四龄幼虫中分离的转录本进行的微阵列分析显示，在VSM one突变体中编码主要精子蛋白（MSP）的基因被诱导，对三龄幼虫的微阵列分析也揭示了该突变体中同一基因家族内的表达变化。通过实时PCR分析验证微阵列的预测结果，发现MSP基因家族中的一个成员MSP32在VSM one突变体中被诱导。该数据来自同一批RNA样本的三次实时PCR重复实验的平均值。观看本视频后，您应能够充分理解如何运用生物信息学工具进行全基因组分析，尤其考虑到科学界目前已有大量可用的开源生物信息学软件程序。

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