确定基因表达概况 C。线虫使用微阵列和实时PCR
2011年7月30日
进行微阵列分析，以确定基因的表达谱 C。线虫，并实时PCR是用来验证和量化的微阵列数据。
该程序的总体目标是研究许多表型或代谢途径背后的基因表达谱。这是通过首先从两种对比的线虫菌株中分离 mRNA 来实现的。该程序的第二步是合成包含 S SI 3 或 SFI 捕获序列的 CD NA，并将它们杂交到微阵列中。
该程序的第三步是将微阵列芯片与含有 S SI 3 和 SCIFI 荧光 4 的抗捕获序列杂交。该程序的最后一步是扫描微阵列并使用生物信息学工具（如 magic tool 软件）分析数据。最终，鉴定出介导所研究生物现象的候选基因，并可以通过实时 PCR 等替代技术进行验证和量化。
通常，刚接触这种方法的个体会很困难，因为用户看不到斑点核苷酸，因此很难将均质杂交混合物叠加到 23， 000 多个上。独特打印的核苷酸 首先从健康的同步线虫中收集 RNA。首先，将它们洗涤，重悬于 15 毫升试管中，将沉淀的蠕虫沉淀重悬于 7 毫升 0.1 摩尔氯化钠和 7 毫升冰冷、每体积重量为 60% 的蔗糖中。
在冰上孵育 15 分钟后，蠕虫再次沉淀。现在，无细菌的蠕虫会游上来，被收集，用 RNA 洗涤，用游离水洗涤并沉淀。同样，干净、松散压实的颗粒被转移到以最大速度旋转 30 秒的微型离心管中。
吸出并储存在 10 体积的 RNA 中，然后在 4 °C 下进行，直到准备好继续。为了制备总 RNA 样品，以最大速度离心制备的沉淀，丢弃 supernat 并向沉淀中加入一小撮分子研磨树脂。然后用研杵用液氮冷冻混合物。
将冷冻蠕虫悬浮液研磨成细粉，研磨后根据需要加入液氮以保持粉末低温。将提取物放在冰上 5 分钟。五分钟后，将提取物与 700 微升 R-L-T-B-M-E 和 472 微升 100% 乙醇共混。
现在可以使用市售试剂盒分离 RNA，每个生物样品的最终分离 RNA 体积为 60 μL。在继续之前，先用 DNAS one 处理去除潜在的基因组 DNA 污染，然后使用市售的 RNA 纯化试剂盒。通过暗示 60 微升的体积来完成套件。
最后，在微阵列杂交之前，通过乙二醛样品上样、染料和凝胶分析处理来确定 RNA 浓度并评估 RNA 的完整性使用常规方法，纯化的 RNA 被反向转录成互补的 DNA，该 DNA 使用市售试剂盒从降解的模板中纯化，并称为 60 微升的体积。通过封闭 sea elegance 开始微阵列杂交。使用超声处理的鲑鱼精子 DNA 进行微阵列载玻片一小时后，将堵塞的载玻片倒入双蒸水中并旋转。
在 50 毫升锥形管中干燥载玻片，并用 kim 抹布填充。现在准备一种基于 2 x 酰胺的杂交缓冲液。首先，将其加热至 55 摄氏度 10 分钟以完全溶解其晶体。
然后以 10， 000 gs 离心 1 分钟。接下来，将 25 微升 CD NA 与 25 微升杂交缓冲液混合，然后轻轻弹动混合物。现在快速旋转混合物并在 80 摄氏度下孵育 10 分钟。
孵育后，小心地将整个 CDNA 样品移液到微阵列玻片上，不要接触玻片。将样品均匀地铺展到微阵列玻片上。在盖玻片完全下降之前，使用注射器针头轻轻地将盖玻片降低到载玻片上，再次用针头向上和向下拉，让盖玻片轻轻落到位。
这种技术最大限度地减少了气泡的形成。现在将玻片水平放置在玻片下方的 50 毫升锥形管中，加入 50 微升双蒸水，并在第二天在 37 摄氏度下孵育过夜。洗涤玻片后短暂进行第二次杂交。
在 SSC 中多次应用包含光敏捕获试剂和 Antifa 试剂的第二种缓冲液，使用相同的技术，然后进行短暂孵育、更多洗涤和干燥。然后可以扫描载玻片。可以使用带有开源魔术工具的免费软件分析图像。
在 project 选项卡下，在 build expression profile 选项卡下创建并保存一个新项目，选择 Load image pair 并选择红色图像文件为红色，绿色图像文件为绿色。然后选择 build expression profile 选项卡。选择加载基因列表以上传从 GCAT 网站获取的 C 优雅基因列表文件，以对微阵列图像进行寻址和网格化。
选择 build expression profile 选项卡和 create edit grid 选项。现在编辑网格。设置对话框，使用 48 表示网格数，每个网格使用 22 行和 22 列，并选择从左到右和从上到下对点进行编号。
增加百分比对比度变化并放大网格，直到容易区分各个点。通过选择左侧面板上的设置左上角位置，然后单击左上角位置的中心，然后单击网格 1 上的右上角位置和底行来创建网格。对 48 个网格中的每一个重复此网格化过程，从左到右、从上到下。
然后通过选择 file 选项卡进行保存，并将当前网格保存为保存后的状态。选择 finished 选项卡以从分析中消除任何不相关的点。打开 build expression profile 选项卡，然后在 addressing gridding 选项下，选择 spot flagging。
现在标记任何条纹斑点或背景荧光，并通过选择 Save current flags （保存当前标记） 进行保存。与 file 选项卡一样，标记的文件应该被分段。最后，通过选择表达选项卡下的 explore 来分析由指定因子诱导或抑制的基因。
在 exploring 对话框中，设置 fine genes 匹配标准。表达的 2 倍数增加或减少。强度称为 x，X 的值是表达式变化的标准。
对于诱导基因，X 的输入大于 X，对于抑制基因，输入小于 x 的最小值。在本实验中，进行染料交换对照，将来自第三阶段和第四阶段幼虫的两个独立总 RNA 分离物杂交为绿色突变体与红色野生型，而红色突变体与绿色野生型杂交以确认基因表达变化，使用相同的程序进行三个独立的总 RNA 分离，用市售试剂盒合成 CDNA， 对于每个 CD NA 样品，使用三个管家基因作为对照进行实时 PCR 和一式三份。为了证明，以下结果检查了 VSM one 中诱导的基因表达。
AK 1468 突变体 一种以突触增强为特征的线虫菌株 在进行微阵列分析之前，使用凝胶电泳检查提取的 RNA 的质量。dase one 处理前后存在两个完整的核糖体亚基表明微阵列野生型 CDNA 标记为红色，VSM one 突变体 CD NA 标记为绿色。在每个微阵列分析的 48 个网格中，每个小方块代表每个阵列中的单个打印寡核苷酸，每个唯一的寡核苷酸都表示。
一旦对从第四阶段幼虫中分离的转录本进行微阵列分析，表明编码主要精子蛋白或 MSP 的基因在 VSM one 突变体中被诱导，第三阶段幼虫的微阵列分析也揭示了突变体中同一基因家族内的表达变化。测试。通过实时 PCR 分析从微阵列中预测显示，M ms P 基因家族 MS P 32 的一个成员在 VSM one 突变体中被诱导。该数据表示来自同一 RNA 集合的 3 次实时荧光定量 PCR 重复的平均值。
看完这个视频后，你应该对如何使用生物信息学工具进行全基因组分析有了很好的了解，特别是考虑到科学界有许多开源的生物信息学软件程序。
概述
本研究通过微阵列分析和实时PCR验证来研究秀丽隐杆线虫的基因表达谱。该方法涉及从不同线虫株系中分离mRNA，以了解潜在的生物学现象。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 遗传学
- 微阵列技术
背景
- 秀丽隐杆线虫作为研究基因表达的模式生物。
- 微阵列分析允许同时检查数千个基因。
- 实时PCR用于确认微阵列结果。
- 了解基因表达可以阐明代谢途径和表型。
研究目的
- 识别参与特定生物过程的候选基因。
- 通过实时PCR验证微阵列数据。
- 增强对线虫基因表达的理解。
使用的方法
- 从不同线虫株系中分离mRNA。
- 合成cDNA并与微阵列杂交。
- 使用生物信息学工具进行数据分析。
- 通过实时PCR验证结果。
主要结果
- 识别介导生物现象的候选基因。
- 成功通过实时PCR验证微阵列数据。
- 洞察不同株系中的基因表达谱。
- 利用生物信息学工具进行全面的数据分析。
结论
- 该研究为分析秀丽隐杆线虫的基因表达提供了框架。
- 实时PCR作为微阵列结果的有效验证方法。
- 研究结果有助于理解线虫中的遗传机制。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables biopharma researchers to profile gene expression changes in model organisms, supporting target validation by identifying differentially expressed genes linked to phenotypic outcomes. By combining microarray screening with real-time PCR confirmation, it provides a scalable approach for mechanistic de-risking in early discovery, helping prioritize targets with stronger predictive confidence before lead identification efforts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by revealing gene expression shifts associated with enhanced synaptic connectivity in mutant models.
- Operational Value: Enables pathway clarification through systematic screening of thousands of genes to pinpoint candidates like MSP-32 for further functional study.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by confirming gene induction via orthogonal real-time PCR validation.
- Operational Value: Supports assay standardization and reproducibility through dye-swap controls and triplicate measurements, reducing false positives in target identification.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with disease-relevant systems by linking synaptic phenotypes to MSP signaling pathways, which have conserved roles in neuromuscular junction regulation across species.
- Operational Value: Facilitates translational biomarker exploration by identifying secreted signaling molecules like MSPs that may serve as measurable indicators of pathway activity.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from hypothesis-driven target validation to lead identification, where expression profiling informs target selection and mechanistic follow-up.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and biological de-risking by connecting genetic perturbations to molecular phenotypes through expression profiling.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs via microarray intensity measurements and real-time PCR quantification, enabling condition comparisons.
- Analytics: Highlights bioinformatic-driven readouts such as fold-change thresholds and statistical significance, aiding in hit selection and prioritization.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by identifying evolutionarily conserved signaling families (e.g., MSP/Eph) with relevance to human synaptic biology.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for profiling genetic responses across diverse phenotypes, reducing redundant method development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by validating microarray hits with real-time PCR, reducing mechanistic ambiguity in target selection.
- Operational Value: Enhances standardization and scalability through standardized RNA isolation, labeling, and hybridization protocols applicable across strains.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing multi-modal evidence (transcriptomic + qPCR) for target prioritization, lowering late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement by distinguishing robust expression changes from noise, supporting data-driven resource allocation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology, RNA handling, and microarray hybridization techniques to ensure sample integrity and data quality.
- Dependent on access to microarray scanners, bioinformatic software (e.g., Magic Tool), and real-time PCR instrumentation for end-to-end execution.
- Necessitates cross-team standardization of protocols for RNA isolation, labeling, and data analysis to ensure reproducibility across laboratories.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different model systems or tissue types due to variability in RNA yield and hybridization efficiency.
- Includes practical limitations such as the need for technical skill in grid alignment and spot flagging during microarray analysis, which can affect data accuracy if not performed correctly.
