Name: 量化的信息编码的基因表达水平在寿命调制下线虫的宽范围饮食限制 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: 了解量化饮食限制下基因表达编码环境信息的方法，使用C. elegans模型分析神经回路编码策略。该技术可识别调控寿命的关键基因并解析衰老神经生物学机制。

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感谢 Bargmann 实验室和 Horvitz 实验室提供试剂。部分菌株由 CGC 提供，CGC 由美国国立卫生研究院研究基础设施项目（P40 OD010440）资助。我们还感谢 M. Lipovsek 对手稿提出的修改意见。本研究得到了惠康信托基金（项目资助号 087146，授予 Q.C.）、英国生物技术和生物科学研究生院（BB/H020500/1 和 BB/M00757X/1，授予 Q.C.）、欧洲研究理事会（NeuroAge 242666，授予 Q.C.）、美国国立卫生研究院（R01AG035317 和 R01GM088333，授予 H.L.）以及美国国家科学基金会（0954578，授予 H.L.；0946809 GRFP，授予 M.Z.）的支持。

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作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种新的饮食限制方法，该方法涵盖的食物浓度范围远比以往发表的方案更为广泛。该方法将秀丽隐杆线虫（C. elegans）饮食限制研究中曾被分别看待的两种现象——细菌剥夺和经典饮食限制——联系起来，使得在同一实验方案下可同时研究这两种饮食效应。利用这种广谱饮食限制范式，我们提出了一种通用框架，用于检测单个细胞在特定环境刺激下的基因表达变化，并解析该细胞如何编码信息。本框架包含两个实验方案，分别说明如何在广谱饮食限制条件下进行寿命测定和定量成像。通过这些实验方案获得的数据，可结合本框架提供的计算分析方法，量化在不同食物条件下基因表达水平或寿命变化所编码的信息。
使用广谱饮食限制（DR）范式进行的寿命实验涉及六个不同的食物水平（表1）。这比在较少的食物水平（如饮食剥夺）下研究寿命需要更耗费人力的方法10,11 或使用 eat-2 遗传背景35然而，在单一条件下观察寿命可能会限制对基因在限制饮食（DR）中作用的解释。例如，我们最近的研究表明 daf-7 与野生型动物相比，突变体对食物浓度的反应呈现双向减弱12 (图1A）。在没有食物的情况下， daf-7 突变体的寿命相较于野生型动物有所缩短。如果我们仅考虑饮食限制，我们可能会得出这样的解释 daf-7 基因仅对寿命延长是必需的, 事实上 daf-7 因此，本部分实验方案的关键结果是确定目标基因是否参与调控生物体对食物丰度变化所引起的寿命整体反应。
与其它方法相比，本方案的一个主要优势在于采用了一种新颖的方法，在进行寿命分析的动物中消除其子代的产生。大多数研究使用药物FuDR来抑制成虫生殖系的增殖，使其不育。然而，近期研究表明，FuDR处理可能对寿命产生条件依赖性和基因特异性的效应17,18,19,20,21，因而对其普遍适用性提出了质疑。在本方案中，通过使用靶向egg-5基因的RNAi对动物进行24小时处理，从而阻断子代的产生。该处理可抑制受精的C. elegans卵母细胞几丁质卵壳的形成，导致其死亡22,23。该方法的优势在于其作用时间较晚，因此不会干扰生殖系——而生殖系是C. elegans寿命的重要调控因素。
广谱DR方案的一个潜在局限在于其依赖抗生素来控制细菌增殖，以确保对细菌浓度的严格调控。已知线虫肠道内细菌的过度增殖是导致C. elegans16死亡的主要原因之一。因此，在NGM琼脂中使用抑菌性抗生素（如羧苄西林）可抑制细菌增殖，并延长线虫寿命，相较于不含抗生素的对照组具有更长的寿命16。某些类型的抗生素，例如利福平36以及四环素类家族成员37,38，已被证明可在不依赖其对细菌增殖影响的情况下独立延长C. elegans的寿命。然而，目前文献中尚无证据表明羧苄西林或链霉素能够在不依赖其对细菌增殖作用的前提下独立延长寿命。
寿命可被视为一种复杂计算的结果，其中通过神经网络中的基因表达传递的环境信息被传导至生理过程。本方案提供了一种方法，用于理解特定基因如何影响这一环境信息流。为回答这一问题，我们需要可靠的图像处理技术，以确定基因表达响应在单细胞水平上的分布情况。不仅能够估计基因表达对食物丰度变化的平均响应，还能从大规模细胞群体中获得其完整的统计分布，这是我们方法得以应用的重要前提。对基因表达响应食物丰度的精确描述，使得信息论可用于量化特定神经元所编码的信息，以及神经回路所采用的编码策略。
本方案中所述方法的成像与计算方面可适用于更广泛的生物学背景。在我们的研究中，重点关注了一个参与食物感知的小型神经网络，但对信息处理特征的分析并不局限于特定细胞类型或特定环境信号。未来，这些方法有望扩展到更多种类的输入变量，从而影响任何生理输出。这些方法将有助于更深入地理解基因调控网络如何编码、处理和传递信息。

所有生物都必须能够感知并响应环境变化，以确保其生存。在动物中，神经系统是感知和转导环境信息的主要系统，并协调生理反应以应对可能影响生物体生存的任何变化1。食物丰度是一种在多种情境下被广泛研究的环境信号，它不仅调控与进食相关的行为（如觅食行为）2，还影响动物的寿命。食物丰度变化对寿命的调节现象被称为饮食限制（dietary restriction, DR），该现象在进化上具有广泛的保守性3。
线虫 秀丽隐杆线虫 是研究基本生物学问题的有力模型系统。已开发出大量技术用于操控线虫基因组，例如RNAi和 体内 基因编辑技术。线虫体型微小且具有光学透明性，也使其适用于 体内 转录和翻译荧光报告基因的成像，以及微流控等高通量技术的应用4这些工具可联合用于研究神经回路如何调控动物行为。
C. elegans 是一种以细菌为食的生物，已有多种方法被发表，可通过调控细菌浓度来精确控制食物丰度5,6,7,8。在 C. elegans 研究领域中，限制饮食（DR）已在两种不同背景下被研究。第一种可称为“经典限制饮食”，因其模拟了其他生物在食物水平降低时所表现出的反应变化。在此背景下，将食物丰度从自由摄食（ad libitum）水平逐步降低，可使寿命逐渐延长，直至达到最佳值；超过该点后，进一步减少食物将导致寿命缩短6,7,9。第二种研究 C. elegans 限制饮食的背景是饮食剥夺，即通过完全去除任何细菌性食物来源来延长线虫的寿命10,11。在 Entchev 等（2015）12 的研究中，我们表明，由这两种不同范式所导致的限制饮食复杂性，可在我们称之为“宽范围限制饮食”（broad-range DR）的背景下同时进行研究。通过采用下述实验方案，我们鉴定出一类新的与限制饮食相关的基因，这类基因可双向调节生物体对食物丰度的寿命响应，并参与感知食物的神经回路12（图 1）。
动物对环境变化的响应整合了一系列生物学过程，将感觉系统与复杂的调控相互作用联系起来，从而将环境信息传递给生理系统。尽管这种&#34;信息流&#34;的具体机制细节常常未知，但可以利用遗传学工具深入了解这种复杂计算是如何在不同生物组分之间组织的。在我们近期的研究中，我们发现daf-7和tph-1通过一个感知食物的神经回路参与传递有关食物丰度的环境信息，从而调控秀丽隐杆线虫（C. elegans）的寿命12,13。通过应用信息论的数学框架14，我们能够量化在不同食物条件下，特定神经元中daf-7和tph-1基因表达变化所表征的环境信息量（以比特为单位）。由此，我们进一步揭示了该神经回路所采用的信息编码策略及其遗传调控机制（图2）。
在以下实验方案中，我们概述了研究在特定神经元中表达的目的基因的功能及其如何参与将环境中的食物信息传递至寿命调控过程的步骤。总体而言，我们的研究框架分为两个实验方案和一个计算分析流程。在实验方面，关键是要获得目的基因的突变体，以便在宽范围饮食限制（DR）条件下进行检测。同时还需要可靠的转录报告系统，以量化目的基因在不同食物水平下的表达量。为了能够实施本方法中讨论的计算分析，数据集必须具有足够的规模，以提供对表达分布的有意义估计。尽管我们提供了分析所用的模板源代码，使用者仍需熟悉信息论的相关术语，这些术语在我们的计算框架中被广泛使用。源代码采用 R 和 C++ 编写，因此应用这些代码还需具备一定的编程能力。

<table><tbody><tr><td>羧苄西林二钠盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1389-5G</td><td>抗生素</td></tr><tr><td>硫酸链霉素盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6501-50G</td><td>抗生素</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;异丙基 &amp;beta;-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758-10G</td><td>RNAi 平板诱导剂</td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71380-1KG-M</td><td>用于S基础培养基和NGM琼脂</td></tr><tr><td>二水合磷酸氢二钾(K&lt;span class=&quot;font9&quot;&gt;&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;/span&gt;&lt;span class=&quot;font8&quot;&gt;HPO&lt;/span&gt;&lt;span class=&quot;font9&quot;&gt;&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&lt;/span&gt;&lt;span class=&quot;font8&quot;&gt;)&lt;/span&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.05104.1000</td><td>用于S基础培养基和NGM琼脂</td></tr><tr><td>磷酸二氢钾（KH₂PO₄）&lt;span class=&quot;font10&quot;&gt;&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;/span&gt;&lt;span class=&quot;font8&quot;&gt;PO&lt;/span&gt;&lt;span class=&quot;font10&quot;&gt;&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&lt;/span&gt;&lt;span class=&quot;font11&quot;&gt;)&lt;/span&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791-1KG</td><td>用于S基础培养基和NGM琼脂</td></tr><tr><td>硫酸镁（MgSO₄）&lt;span class=&quot;font9&quot;&gt;&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&lt;/span&gt;&lt;span class=&quot;字体8&quot;&gt;)&lt;/span&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643-1KG</td><td>用于 NGM 琼脂</td></tr><tr><td>氯化钙（CaCl&lt;span class=&quot;font9&quot;&gt;&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;/span&gt;&lt;span class=&quot;字体8&quot;&gt;)&lt;/span&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670-500G</td><td>用于 NGM 琼脂</td></tr><tr><td>氢氧化钠（NaOH）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71687-500G</td><td>用于漂白</td></tr><tr><td>Pluronic-F127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443-1KG</td><td>用于成像</td></tr><tr><td>次氯酸钠（NaClO）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.05614.2500</td><td>用于漂白</td></tr><tr><td>LB肉汤</td><td>Invitrogen</td><td>12780052</td><td>用于培养细菌</td></tr><tr><td>Adavanced TC 6 cm 组织培养板</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628960</td><td>寿命测定平板</td></tr><tr><td>CellStar 10 cm 组织培养板</td><td>Greiner Bio-One</td><td>664160</td><td>用于成像的培养板</td></tr><tr><td>低吸附 P200 吸头</td><td>布兰特</td><td>732832</td><td>液体中线虫操作的技巧</td></tr><tr><td>琼脂</td><td>BD</td><td>214510</td><td>NGM、RNAi 和 NSC 平板用琼脂</td></tr><tr><td>Bacto-peptone</td><td>BD</td><td>211820</td><td>NGM、RNAi 和 NSC 平板用蛋白胨</td></tr></tbody></table>

在 c. elegans 中通过基因表达水平编码的信息量化：广泛范围饮食限制下寿命调控过程中的研究

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

感觉系统使动物能够检测、处理并响应其环境。食物丰度是一种环境线索，对动物的生理和行为具有深远影响。最近，我们发现秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的寿命受食物丰度调控的机制比以往所认知的更为复杂。寿命对食物水平变化的响应性由特定基因决定，这些基因通过调控神经回路内的信息处理发挥作用。我们的研究框架结合了遗传学分析、高通量定量成像和信息论方法。本文描述了如何利用这些技术来表征任何在广谱饮食限制中具有生理相关性的基因。具体而言，该工作流程旨在揭示目标基因如何在广谱饮食限制条件下调控寿命；继而确定该基因的表达如何随食物水平变化；最后，对基因表达所传递的关于环境中食物丰度的信息量进行无偏量化。当在神经回路背景下同时检测多个基因时，该工作流程可揭示该回路所采用的信息编码策略。

通过将目标基因的突变体与野生型 N2 品系进行寿命实验对比，可以确定这些基因是否在宽范围饮食限制（DR）的食物响应中发挥作用。野生型的响应应与图1A中所示的响应相似。若突变体对该响应产生改变，且在不同食物条件下表现出非均一效应，则表明这些基因影响了线虫正确响应食物丰度变化的能力，此时有必要进一步研究这些基因在宽范围饮食限制下的表达响应。然而，如果突变体的寿命响应与野生型相比无显著差异，则说明这些基因在平均寿命水平上不参与介导宽范围饮食限制的作用。若突变导致整个寿命响应发生均匀偏移，则表明这些基因对寿命具有食物非依赖性的影响。这并不排除目标基因的表达本身可能受食物调控的可能性；在此情况下，这些基因所携带的信息并未传递至寿命表型。
该实验方案的下一步是确定在宽范围饮食限制（DR）条件下，目的基因的表达水平如何发生变化。在图1B中，我们通过daf-7转录报告基因在ASI感觉神经元中对食物水平变化的响应来说明这一点。daf-7(-)突变体中，该转录报告基因的表达响应发生改变。如果目的基因确实在寿命层面上对食物有响应，则可以预期其表达水平也会随食物变化而改变。相应地，在突变体背景下，转录报告基因应对宽范围饮食限制表现出改变的表达模式。然而，也有可能在野生型背景下，目的基因的转录报告基因在表达上未显示出任何食物响应性变化。在这种情况下，这可能提示存在转录后调控效应，超出了本实验方案的范围。
在 Diana 等人（2017）的研究中13，我们提取了表达值以 daf-7 在 ASI 和 tph-1 在 ADF 和 NSM 中。 图2A我们展示了在给定食物水平下 ASI 和 ADF 中表达分布的估计方法。通过对单个线虫图像获取多个读数，我们不仅能够分析每个神经元独立编码的信息量，还能分析整个神经回路的组合信息图2B-2C）。结合这两种信息论度量方法，可从神经元传递食物相关信息所采用的编码策略角度对系统进行表征。通过计算每个神经元的互信息之和，并减去考虑回路组合读数时获得的联合互信息（即信道容量），即可得到该回路中的冗余量。若该差值为正值，则表明编码策略具有冗余性，因为各部分的累积信息大于整个回路实际编码的信息；反之，若差值为负值，则反映编码策略具有协同性，因为整体编码的真实信息大于其各组成部分之和。图2B）。可通过比较不同基因型之间的信息与冗余，探究基因调控可能存在的高阶作用，例如在 Diana 等 (2017)13 其影响 daf-7 突变将编码策略从冗余转变为协同（图2C-2D).
<img alt="寿命和 ASI 表达随食物水平变化的曲线图；野生型与 daf-7 突变体的比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56292/56292fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1：在宽范围饮食限制下寿命和基因表达的响应。（A）野生型 N2 品系的平均寿命（黑线）对宽范围饮食限制表现出复杂的响应模式。daf-7 基因缺失突变体（红线）中的这种响应幅度显著减弱。误差条表示均值的标准误，数据来自 Entchev et al.（2015）12 的合并结果。（B）在野生型背景下，daf-7 基因转录报告系统的平均表达水平（黑线）也对宽范围饮食限制表现出复杂的非单调响应。而在 daf-7(-) 遗传背景下，该转录报告系统的表达显著降低，且对食物水平变化的响应极小。误差条表示均值的标准误，数据来自 Entchev et al.（2015）12 的单次实验结果。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56292/56292fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="多模态信息整合分析，图表突出显示神经数据中的冗余性和协同性。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56292/56292fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2： 计算方法。（A）使用 R 软件包“ks”在 30 × 30 网格维度下获得的 ADF 中 tph-1 表达和 ASI 中 daf-7 表达的二维密度估计示意图。（B）ADF、ASI 和 NSM 神经元中 tph-1 与 daf-7 联合表达（整体）以及各自单独表达（部分之和）所编码信息的可视化。冗余性和协同性编码特征通过右侧堆叠柱状图高度与完整回路所编码信息之间的差异表示。（C）野生型动物与 daf-7(-) 突变体所编码的食物信息比较。（D）突变体中观察到的互信息减少伴随着向协同编码模式的转变。图 B–D 改编自 Diana et al.（2017）13。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56292/56292fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>细菌浓度（细胞/毫升）</td>
			<td>光密度（600纳米）</td>
			<td>稀释倍数（相对于前一次）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.12E+10</td>
			<td>56.000</td>
			<td>0.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.00E+09</td>
			<td>10.000</td>
			<td>5.60</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6.32E+08</td>
			<td>3.160</td>
			<td>3.16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6.32E+07</td>
			<td>0.316</td>
			<td>10.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.00E+07</td>
			<td>0.100</td>
			<td>3.16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0 (S 基础培养基)</td>
			<td>0.000</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：宽范围剂量反应试验中使用的食物浓度及稀释倍数。 宽范围剂量反应（DR）实验方案中使用的大肠杆菌浓度（细胞数/mL），及其对应的OD600测定值，以及从上一浓度稀释至该浓度所需的稀释倍数。
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="7">寿命实验温度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>天数</td>
			<td>12.5°C</td>
			<td>15°C</td>
			<td>17.5°C</td>
			<td>20°C</td>
			<td>22.5°C</td>
			<td>25°C</td>
			<td>27.5°C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-12</td>
			<td colspan="7">将所有菌株转移至新鲜的NGM平板，并在20°C下培养</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-11</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-10</td>
			<td colspan="7">设置daf-7(-)菌株的P0代，并在20°C下培养（每板1只L4幼虫，共5板）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-9</td>
			<td colspan="7">设置野生型菌株的P0代，并在20°C下培养（每板1只L4幼虫，共5板）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-7</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-6</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-5</td>
			<td colspan="7">设置daf-7(-)菌株的F1代，并在20°C下培养（每板1只L4幼虫，共90板）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-4</td>
			<td colspan="7">设置野生型菌株的F1代，并在20°C下培养（每板1只L4幼虫，共30板）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0</td>
			<td colspan="7">挑选F2代L4幼虫至&gt;egg-5 RNAi平板，并在20°C下培养（每板15只L4幼虫，共24板）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td colspan="7">将1日龄成虫转移至接种了2.0E+9 cells/ml食物浓度的NSC平板，并在20°C下培养</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td colspan="7">将2日龄成虫转移至接种了实验食物条件的NSC平板，并置于实验温度下培养</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>转移</td>
			<td>转移</td>
			<td>转移</td>
			<td>转移</td>
			<td>转移</td>
			<td>转移</td>
			<td>转移</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>转移</td>
			<td>转移</td>
			<td>转移</td>
			<td>转移</td>
			<td>转移</td>
			<td>转移</td>
			<td>转移</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>转移</td>
			<td>转移</td>
			<td>转移</td>
			<td>转移</td>
			<td>转移</td>
			<td>转移</td>
			<td>转移</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9</td>
			<td>转移</td>
			<td>转移</td>
			<td>转移</td>
			<td>转移</td>
			<td>转移</td>
			<td>转移</td>
			<td>转移</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11</td>
			<td>转移</td>
			<td>转移</td>
			<td>转移</td>
			<td>转移</td>
			<td>转移</td>
			<td>转移</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14</td>
			<td>转移</td>
			<td>转移</td>
			<td>转移</td>
			<td>转移</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>17</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18</td>
			<td>转移</td>
			<td>转移</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>19</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22</td>
			<td>转移</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：在不同温度下进行寿命实验的时间安排。 以 daf-7(-) 和野生型菌株为例，概述在不同温度下建立宽范围饮食限制（DR）寿命实验所需的步骤。随着温度升高，每个实验食物水平转移到新鲜培养板的次数减少。这是为了考虑到较高温度下的线虫衰老速度更快，因此每次转移时更易受到物理损伤。
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>天数</td>
			<td>成像流程</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-14</td>
			<td>将报告基因品系在 daf(-) 背景下进行划线培养。在 20 °C 下维持培养。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-13</td>
			<td>将报告基因品系在野生型背景下进行划线培养。在 20 °C 下维持培养。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-12</td>
			<td>建立 daf-7(-) 报告基因品系的 P0 代。每块 10 cm NGM 培养基平板接种 3 只 L4 期幼虫。使用 2 块平板，并在 20 °C 下维持培养。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-10</td>
			<td>建立野生型报告基因品系的 P0 代。每块 10 cm NGM 培养基平板接种 3 只 L4 期幼虫。使用 2 块平板，并在 20 °C 下维持培养。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-8</td>
			<td>建立 daf-7(-) 报告基因品系的 F1 代。每块 10 cm NGM 培养基平板接种 3 只 L4 期幼虫。使用 12 块平板，并在 20 °C 下维持培养。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-6</td>
			<td>建立野生型报告基因品系的 F1 代。每块 10 cm NGM 培养基平板接种 3 只 L4 期幼虫。使用 4 块平板，并在 20 °C 下维持培养。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-3</td>
			<td>下午（约 17:00）对 daf-7(-) 报告基因品系进行漂白处理，并将卵接种至 3 块 10 cm NGM 培养基平板上，在 20 °C 下维持培养。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-2</td>
			<td>上午（约 10:00）对野生型报告基因品系进行漂白处理，并将卵接种至 3 块 10 cm NGM 培养基平板上，在 20 °C 下维持培养。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0</td>
			<td>将 L4 期幼虫转移至 10 cm egg-5 RNAi 培养基平板。每种品系使用 3 块平板，并在 20 °C 下维持培养。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>将培养 1 天的成虫转移至接种了浓度为 2.0E+9 cells/ml 食物的 NSC 平板。每种品系使用 3 块平板，并在 20 °C 下维持培养。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>将培养 2 天的成虫转移至接种了实验浓度食物的 NSC 平板。每种品系使用 3 块平板，并转移至实验温度条件下培养。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>转移至新鲜的 NSC 平板。每种品系使用 3 块平板，并在实验温度下维持培养。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>转移至新鲜的 NSC 平板。每种品系使用 3 块平板，并在实验温度下维持培养。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>从平板上挑取动物个体，准备进行成像。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3：成像流程时间安排。 以在不同温度下使用 daf-7(-) 和野生型背景的荧光转录报告菌株建立广谱DR成像实验为例，概述所需步骤的示意图。

本文介绍了一个将大范围饮食限制与基因表达及寿命关联起来的研究框架。我们描述了实施大范围饮食限制的实验方案，以及在此条件下对基因表达进行定量成像的技术流程。此外，我们还概述了用于揭示参与食物感知的遗传回路中潜在信息处理特征的计算分析方法。

在 C. elegans 中通过基因表达水平编码的信息量化：广泛范围饮食限制下寿命调控过程中的研究

感觉系统使动物能够探测、处理并响应其环境。食物丰度是一种环境线索，对……产生深远影响。

本框架的总体目标是鉴定参与广谱饮食限制的相关基因，量化其表达水平所编码的环境信息，并理解将环境与寿命关联起来的潜在编码机制。该方法有助于回答衰老神经生物学领域中的关键问题，例如，哪些基因传递环境信息以调节寿命。尽管该框架可为秀丽隐杆线虫（C. elegans）感觉系统提供深入见解，但也可更广泛地应用于任何通过组分协作来处理环境信息的生物系统。该技术的主要优势在于，它能够量化神经元群体所编码的环境信息，并确定神经元微回路用于向下游靶点传递该信息的编码策略。根据文本方案在MGM平板上培养OP50后，分别在两个2升的锥形瓶中各配制500毫升LB培养基，并进行高压灭菌。每个锥形瓶接种一个OP50单菌落，在37°C、200 RPM条件下培养约14小时。接着，向培养物中添加每毫升50微克的链霉素。然后在37摄氏度下额外振荡锥形瓶30分钟，之后将锥形瓶置于冰上15分钟。将每种培养物各450毫升转移至 separate 500毫升无菌离心瓶中，剩余的培养物保留在冰上，用于测定细菌浓度。在4500 × g、4°C条件下离心瓶体25分钟，随后弃去上清液，将瓶体置于冰上保存。取每个锥形瓶中剩余培养物100 µL，用900 µL无菌LB培养基进行稀释。使用1 mL无菌LB培养基调零分光光度计，然后测定各培养物10倍稀释液的OD600值。例如，若过夜培养物10倍稀释后的OD600为0.28，则该培养物的实际OD600为2.8。根据此例，若要制备每毫升含1.12 × 10¹⁰个OP50细胞的工作液（相当于OD600为56），需将450毫升培养物离心后的菌体沉淀重悬于原体积的1/20，即22.5毫升无菌S基础溶液（SB），并添加50微克/毫升链霉素。实验中后续使用的所有浓度均应以该工作液为起始，用SB加链霉素溶液进行系列稀释制备，并参照本表所列的稀释倍数进行计算。根据文本方案培养并同步秀丽隐杆线虫报告基因品系后，使用15毫升SB缓冲液依次冲洗三个培养板上的线虫，并将液体收集至无菌的15毫升离心管中。让L4期幼虫自然沉降，然后吸除除约0.5毫升以外的全部液体。在野生型报告基因品系中，该步骤可去除所有小于L4期的幼虫。在突变背景下，此步骤有助于去除任何停滞发育的幼虫，例如，在OK3125品系死亡的情况下。接下来，使用 9 毫升 SB 重悬线虫。再次观察 L4 幼虫的沉降速率，当大部分 L4 幼虫已沉淀后，吸除上清液，仅保留约 0.5 毫升，然后重复该步骤。向含有 L4 幼虫的液体中加入 10 微升无菌 S 基础培养基，并添加 0.1% pluronic F127。这可以起到表面活性剂的作用，防止幼虫粘附在塑料移液枪头的内表面。使用P200低吸附移液枪头，轻轻重悬幼虫，然后将150 µL分装到三个接种了5 × 225 µL卵五RNAi细菌的10厘米RNAi平板上。确保线虫均匀分布在所有五个细菌菌苔上。待液体被琼脂吸收后，通过手动挑取的方式去除未被洗涤步骤清除的非L4期幼虫。随后将培养皿置于20 °C条件下保存24小时。为启动广谱饮食限制（DR），挑除之前手动去除步骤中遗漏的任何幼龄幼虫，仅保留培养皿中已生长一天的成虫。对于每个菌株，使用15毫升无菌SB链霉素培养基，将三个培养皿中的一日龄成虫洗脱至一个15毫升离心管中。让线虫自然沉降，然后吸除上清液，仅保留0.5毫升。加入9.5毫升SB链霉素培养基重悬线虫，并重复沉降和洗涤步骤。最后一次洗涤后，除保留0.5毫升上清液外，其余上清液均吸除，加入10微升SB Plu，使用P200移液器吸头轻轻重悬幼虫。取100微升幼虫悬液分装至NSC平板上，平板上已接种5份各225微升、浓度为每毫升2×10⁹个细胞的细菌，将100微升幼虫悬液均匀分布于全部5个细菌菌苔上。在显微镜下估算平板上存在的动物数量，每平板目标为 100 至 150 条线虫。确定达到此密度所需的液体体积，并将该体积的液体分装到另外两个平板上。调整第一个平板上的线虫数量，使其也处于此范围内。然后将培养皿置于 20 摄氏度下保存 24 小时。第二天，收集两天龄的成虫，并将线虫转移至新制备的 NSC 培养皿中，培养皿中已接种所需实验浓度的食物。待液体完全被琼脂吸收后，将培养皿转移至目标实验温度下继续培养 24 小时。第二天，收集培养三天的成虫，并将其转移至新鲜的NSC平板，平板中接种有相同实验浓度的食物。待液体被琼脂吸收后，将平板放回实验温度下继续培养48小时。最后，使用微流控装置对动物进行成像，然后按照文本方案中的步骤进行数据组装与定量分析。如图所示，野生型 n2 品系的平均寿命对宽范围的饮食限制（DR）表现出复杂的响应。在 daf-7 基因的全突变体中，这种响应的幅度显著减弱，表明该基因影响了线虫对食物丰度变化作出正确响应的能力。在野生型背景下，daf-7 基因转录报告基因的平均表达水平也对宽范围饮食限制表现出复杂的非单调响应。在 daf-7（遗传背景）中，该转录报告基因的表达显著降低，并且对食物水平的变化几乎无响应。该图展示了在特定食物水平下，ADF 神经元中 TPH-1 表达与 ASI 神经元中 daf-7 表达的联合分布估计。这些条形图展示了基于 TPH-1 和 daf-7 基因表达水平，ADF、ASI 和 NSM 神经元以组合方式或单独方式编码的食物信息。编码中的冗余性和协同性特征，通过右侧堆叠条形图的高度差异（表示神经元组合编码与单独编码之间的比较）以及完整神经回路所编码的信息得出。在进行该操作时，需注意：应用信息论来量化编码策略，依赖于对基因表达分布的准确估计。因此，样本量是该框架普遍适用性的关键因素。观看本视频后，您应能够充分理解如何开展大范围的饮食限制实验，以鉴定并表征将食物丰度与寿命关联起来的新基因。

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科研

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Genetics

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