使用泛病毒微阵列检测技术（Virochip）对临床样本进行病毒病原体筛查

本实验采用Viro芯片（一种广谱病毒微阵列检测方法）对临床样本中的已知和未知病毒进行分析。首先从临床样本中提取核酸，然后利用随机引物对提取的RNA进行逆转录。

进行第二链cDNA合成，并通过随机PCR扩增cDNA文库。然后用荧光染料标记扩增后的cDNA，杂交至病毒芯片微阵列。最后一步是扫描并分析微阵列。

最终，通过分析芯片微阵列，可以获得显示一种或多种病毒存在与否的结果。在诊断微生物学中，需要病毒芯片微阵列等广谱检测方法，因为肺炎等常见临床综合征并非由特定单一病原体引起，同时由于新发病毒病原体（如SARS冠状病毒和2009年新型H1N1流感病毒）持续出现。该方法有助于回答诊断微生物学领域中的关键问题，例如在临床环境中，有多少比例的未确诊感染可能由尚未识别的新型病毒引起。该技术的意义在于能够同时检测数百至数千种潜在病原体，从而有助于提高医院内急性临床疾病的诊断水平。

我们最初在2002年提出了这一方法的想法，当时我们决定将加州大学旧金山分校（UCSF）Joseph DeRisi博士实验室首创的新兴微阵列技术应用于病毒检测。我们首个真实世界的应用案例是在2003年利用病毒芯片鉴定出导致SARS的新型冠状病毒。本文将完整展示该方法的全部流程，由我实验室的一名技术人员示范如何使用病毒芯片检测法，对一名儿童的鼻拭子样本进行分析，以诊断其急性呼吸道疾病的病因。鼻咽拭子样本采集后置于含有病毒转运液的无菌容器中，并储存在–80°C的冷冻冰箱中。

在生物安全柜中，将含有样本的试管放置至解冻，轻轻搅拌拭子以混匀液体，随后将拭子丢弃至生物危害废弃物垃圾桶中。然后取 200 微升样本分装至一个 1.5 毫升离心管中。使用 0.22 微米离心滤器将样本过滤，以纯化病毒颗粒，并收集滤液至新的 1.5 毫升离心管中。

接下来，按照Ambien公司Turbo DNA试剂盒的说明书降解宿主基因组DNA，并纯化被保护的包封病毒核酸。随后，使用XMO ZR病毒RNA提取试剂盒或Qiagen超声波病毒试剂盒，根据制造商说明书进行RNA提取。使用NanoDrop核酸分光光度计测定所提取RNA的浓度。

RNA 浓度最好至少为 10 纳克/微升，但不同样品间可能存在差异，使用薄壁 200 微升管进行操作。向 4 微升提取的 RNA 中加入 1 微升浓度为 40 皮摩尔/微升的引物 A。将样品在热循环仪中 65 摄氏度加热 5 分钟，然后让离心管在室温下冷却 5 分钟。

接下来，在热循环仪中加入5 µL预混液，其中包含2 µL 5倍逆转录缓冲液、1 µL 12.5 mmol/L dNTP、1 µL水、0.5 µL 0.1 mol/L DTT以及0.5 µL Superscript III逆转录酶。将反应管在42 °C孵育60分钟，随后在94 °C加热2分钟。

为终止逆转录反应，将反应体系降温至10摄氏度并保持两分钟，随后瞬时离心5秒。接下来，加入5微升quease混合液，其中包含1微升5倍浓度quease缓冲液、3.8微升水和0.15微升quease第二链合成酶。在8分钟内将PCR仪温度从10摄氏度逐步升至37摄氏度。

在 37 摄氏度下保持 8 分钟。然后加热至 94 摄氏度持续 2 分钟以灭活酶活性，并在此时将温度降至 10 摄氏度。如需要，可将含有 15 µL cDNA 的样品于 -20 摄氏度保存。

首先，将5 µL cDNA样品加入45 µL的预混液中，该预混液包含5 µL 10倍PCR缓冲液、1 µL 12.5 mmol/L dNTP、1 µL 100 pmol/µL引物B、1 µL Clontech LA以及37 µL水。然后按照以下程序运行PCR：94 °C预变性2分钟，随后进行25个循环，每个循环包括94 °C变性30秒、50 °C退火45秒和72 °C延伸1分钟。

然后在72摄氏度下进行5分钟的延伸步骤，PCR结束后在10摄氏度下保存。通过1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，应观察到大小约为200至1000个碱基对的弥散条带。

为了掺入 AAD dNTP，将 5 微升病毒 PCR 产物加入 45 微升的主混合液中，主混合液包含 5 微升 10 倍 PCR 缓冲液、1 微升 12.5 毫摩尔 A-A-D-N-T-P、1 微升 100 pmol/微升引物 B、1 微升 ClinTech LA 以及 37 微升水。按照以下程序运行 PCR：94 摄氏度 2 分钟，15 个循环（94 摄氏度 30 秒，50 摄氏度 45 秒）。

72摄氏度下反应1分钟，随后在72摄氏度延伸5分钟，然后在10摄氏度保存。接着按照生产商说明书，使用DNA纯化浓缩试剂盒3对新生成的PCR产物进行纯化，并用10微升洗脱缓冲液溶解。向10微升PCR产物中加入1微升1摩尔碳酸氢盐溶液和1微升si three，在避光条件下孵育1小时。

接下来，再次使用DNA纯化浓缩试剂盒5（DNA clean and concentrator five kit）对标记为S的样品进行纯化，并用12微升洗脱缓冲液洗脱。取1.5微升样品，使用NanoDrop分光光度计在PCR条形管中检测cDNA浓度及掺入的染料量。反应体系包含：1微升25倍片段化缓冲液、5微升5倍阻断缓冲液、9.5微升或为达到SI标记样品归一化终浓度10 peak或pmol/微升所需的样品量，以及加水至总体积25微升。然后加入25微升2倍GX杂交缓冲液，短暂离心以去除气泡。

将新的垫圈玻片放入杂交室中。取40微升样品加入垫圈玻片上。随后将Agilent打印的病毒芯片有Agilent标记的一面朝下置于垫圈玻片上方，并拧紧螺丝固定。

将杂交室置于65摄氏度的烘箱中，在10转/分钟的缓慢旋转条件下过夜杂交，以洗涤芯片。首先在加热过程中将缓冲液二预热至37摄氏度。取一个500毫升的塑料容器，加入约250毫升缓冲液一。

从杂交室中取出芯片，将芯片浸入液体中并与垫圈玻片分离。将芯片转移至洁净的容器中，用缓冲液一洗涤一分钟。然后使用另一个500毫升的塑料容器。

将芯片放入预热的缓冲液二中洗涤一分钟。洗涤后，缓慢将芯片从缓冲液二中取出，注意避免产生气泡。

使用无尘纸轻轻吸去多余水分，注意避免直接接触芯片阵列的活性面。最后，将玻片有源面朝上放入安捷伦专用玻片架中，并插入阵列扫描仪。本实验采用安捷伦（Agilent）两微米 DNA 微阵列扫描仪。

根据仪器的标准扫描程序，以五微米或两微米的分辨率扫描SI三个标记的阵列。通过聚类分析或自动化的RO chipp分析程序e unpredic分析病毒芯片微阵列。使用Viro Chipp微阵列，可轻松检测从患有流感样疾病的儿童鼻拭子样本中获得的2009年新型流感H1N1病毒。

此外，我们已证实该病毒芯片不仅能够鉴定呼吸道病毒，还能识别来自多种不同组织和体液的广泛病毒。此处展示的是使用病毒芯片（vichi）在全血和血清中检测病毒的一些实例。这些是对应于从四位患者采集的全血或血清样本的病毒芯片微阵列（viro chip microray）的检测信号，每个样本均显示前两个病毒预测结果，其中排名第一的病毒预测具有最低的 P 值。

例如，在浅蓝色高亮显示的样本中，该样本的最高预测结果为登革病毒1型。尽管排名第二的预测结果为登革病毒2型，但该全血样本中的实际病毒经确认确实为登革病毒1型，与dict结果一致。ViroChip的另一项应用在于新病原体的发现。

一些实例包括发现SARS冠状病毒X-M-R-V-A、与人类前列腺癌和慢性疲劳综合征相关的OME逆转录病毒，以及一种新型人类心病毒HTCV，该病毒与儿童的呼吸道感染和腹泻有关。一旦掌握该技术，若操作得当，可在12小时内完成。在进行此操作时，重要的是要牢记，必须确保按照本方案备齐所有必需的仪器设备和试剂。

其他方法，如特异性病毒 PCR 扩增和深度测序，可用于在病毒芯片杂交模式异常或病毒芯片结果提示存在新病毒的情况下，进行确认和后续分析。该技术的建立为肿瘤学领域的研究人员探索新病毒与癌症之间的关联、在生物防御和临床微生物学领域开发基于微阵列的快速病原体诊断浓缩检测方法，以及在病毒学领域对新病毒及其与疾病关联的特征分析铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分理解如何完成病毒芯片微阵列检测的全部步骤——一种用于在临床样本中检测病毒病原体的广谱监测方法，涵盖从临床样本中提取核酸，到微阵列杂交及数据分析的完整流程。

请注意，处理临床样本被视为具有生物危害性，核酸提取应在生物安全二级或更高等级的实验室中进行。