使用泛病毒基因芯片检测（Virochip）屏幕病毒病原体的临床标本

该程序使用 Viro 芯片，这是一种泛病毒微阵列检测法，用于分析临床样本中已知和未知病毒。首先从临床样本中提取核酸。接下来，使用随机引物对提取的 RNA 进行反向转录。

进行第二链 CD NA 合成，并用随机 PCR 扩增 CD NA 文库。然后用荧光染料标记扩增的 cd NA 并与病毒芯片微阵列杂交。最后一步是扫描和分析微阵列。

最终，通过芯片微阵列分析，可以获得显示存在或不存在一种或多种病毒的结果。诊断微生物学需要广谱检测方法，例如病毒芯片微阵列，因为肺炎等常见的临床综合征对任何单个病原体都不具有特异性，并且由于 SARS 冠状病毒和 2009 年新型 H 一对一流感病毒等新型病毒病原体的威胁不断出现，这种方法可以帮助回答诊断微生物学领域的关键问题， 例如，临床环境中未确诊感染的百分比可能是由尚未确定的新型病毒引起的。这项技术的影响延伸到更好地诊断医院的急性临床疾病，因为我们同时检测数百到数千种潜在病原体。

2002 年，我们第一次想到了这种方法，当时我们决定将加州大学旧金山分校 Joseph DeRisi 博士实验室开创的新开发的微阵列技术应用于病毒检测。我们的第一个真实世界测试案例是在 2003 年使用病毒芯片识别导致 SARS 的新型冠状病毒，从头到尾演示该程序将由我实验室的技术人员演示对儿童鼻拭子样本使用病毒芯片检测来诊断其急性呼吸系统疾病的原因。鼻咽拭子样本收集在含有病毒运输、液体培养基的无菌容器中，并冷冻储存在零下 80 摄氏度的冰箱中。

在生物安全罩中，让装有样品的试管解冻并在介质中短暂搅拌拭子，然后将拭子丢弃在生物危害性腰部垃圾箱中。然后将 200 微升样品分装到 1.5 毫升试管中。将样品通过 0.22 微米离心过滤器以纯化病毒颗粒，然后放入新鲜的 1.5 mL 试管中。

接下来，按照制造商的说明使用 Ambien 的 Turbo DNA 试剂盒降解宿主基因组 DNA 并纯化受保护的包膜病毒核酸。然后根据制造商的说明，使用 XMO ZR 病毒 RNA 提取试剂盒或 Qiagen 超声的病毒试剂盒进行 RNA 提取。使用 NanoDrop 核酸分光光度计测量提取的 RNA 的浓度。

RNA 浓度最好至少为 10 ng/μL，但使用 200 μL 薄壁试管时，每个样品的浓度会有所不同。将 1 微升浓度为 40 PICA 摩尔/微升的引物 A 添加到 4 微升提取的 RNA 中。在热循环仪中将样品加热至 65 摄氏度 5 分钟，然后让试管冷却至室温 5 分钟。

接下来，在热循环仪中加入 5 微升预混液，其中包含 2 微升 5 倍 RT 缓冲液、1 微升 12.5 毫摩尔、1 微升 DNTP 水、0.5 微升水、0.1 摩尔 DTT 和 0.5 微升上标 3，逆转录酶。将试管在 42 摄氏度下孵育 60 分钟。然后将样品加热至 94 摄氏度 2 分钟。

要中止逆转录酶反应，请调至 10 摄氏度 2 分钟，然后脉冲离心 5 秒。接下来，加入 5 微升 quease 混合物，由 1 微升 5 倍 quease 缓冲液、3.8 微升水和 0.15 微升 quease 组成，用于第二链合成。在 8 分钟内将热循环仪从 10 摄氏度升至 37 摄氏度。

在 37 摄氏度下保持 8 分钟。然后加热到 94 摄氏度两分钟以灭活 quease，此时调用到 10 摄氏度。如果需要，将含有 15 μL CDNA 的样品储存在零下 20 摄氏度。

首先，将 5 微升 CD NA 样品添加到 45 微升预混液中，该预混液由 5 微升 10 倍 PCR 缓冲液、1 微升 12.5 毫摩尔、DNTP 1 微升 100 pomo /微升引物、B 1 微升 cleantech LA 和 37 微升水组成。然后按如下方式运行 PCR 方案，94 摄氏度 2 分钟，然后 94 摄氏度 25 个循环 30 秒。50 摄氏度 45 秒，72 摄氏度 1 分钟。

然后是 72 摄氏度的跪步 5 分钟，然后在 PCR 后保持在 10 摄氏度。检查 PCR 产物和 1.5% AOSE 电泳凝胶。应显示大约 200 至 1000 个碱基对的弥散带。

为了掺入 AAD DNTP，将 5 微升病毒 PCR 产物添加到 45 微升预混液中，该预混液由 5 微升 10 倍 PCR 缓冲液、1 微升 12.5 毫摩尔、A-A-D-N-T-P 1 微升 100 p 多微升引物、B 1 微升 ClinTech LA 和 37 微升水组成。按如下方式运行 PCR 方案，94 摄氏度 2 分钟，94 摄氏度 15 个循环 30 秒。50 摄氏度 45 秒。

72 摄氏度 1 分钟，跪着 72 摄氏度 5 分钟，并保持 10 摄氏度。然后按照制造商的说明使用 DNA 清洁和浓缩器 3 试剂盒清洁新的 PCR 产物，并在 10 μL 洗脱缓冲液中孵育。在 10 微升 PCR 产物中加入 1 微升 1 微升 1 摩尔碳酸氢盐和 1 微升 si 3，并在黑暗中孵育 1 小时。

接下来，再次用 DNA clean 和 Concentrator 5 试剂盒清洁 S 标记的样品，并在 12 μL 洗脱缓冲液中洗脱。使用 1.5 微升样品检查 CDNA 浓度和在 NanoDrop 分光光度计上掺入 PCR 试管中的染料量，浓度为 1 微升、25 倍碎裂缓冲液、5 微升、5 倍封闭缓冲液、9.5 微升或标准化终浓度 10 峰或摩尔/微升 SI 3 标记样品和水所需的量，总体积为 25 微升。然后加入 25 微升 2 倍 GX 杂交缓冲液，并短暂离心以去除气泡。

在杂交室中放置新的垫片载玻片。将 40 μL 样品加载到垫圈载玻片上。接下来，将标有 Agilent 的一侧的 Agilent 打印病毒阵列放在垫圈滑块的顶部，并拧紧螺钉。

将杂交室置于 65 摄氏度的烘箱中，以每分钟 10 转的缓慢旋转方式杂交过夜，以清洗阵列。首先，在加热时将缓冲液预热 2 至 37 摄氏度。用大约 250 mL 的缓冲液填充 500 mL 塑料容器。一。

从杂交室中取出阵列，浸没阵列并将其与垫圈载玻片分离。将阵列转移到干净的容器中，在缓冲液 1 中洗涤 1 分钟。然后使用单独的 500 毫升塑料容器。

在预热的缓冲液 2 中洗涤阵列 1 分钟。洗涤后，从缓冲液中慢慢取出阵列。二、小心避免气泡。

使用 kim 湿巾吸走多余的水分，同时注意避免直接接触阵列的活动侧。最后，将玻片正面朝上放入载玻片架中，然后插入阵列扫描仪中。在此过程中，我们使用安捷伦 2 微米 DNA 微阵列扫描仪。

根据仪器标准扫描方案，以 5 微米或 2 微米的精度扫描 SI 三标记阵列。通过聚类分析或自动 RO chipp 分析程序 e unpredic 分析病毒 chipp 微阵列。使用 Viro Chipp 微阵列芯片 2009 新型流感 H 一 N 一病毒，很容易在流感样疾病儿童的鼻拭子样本中检测到病毒。

此外，我们已经证明，病毒芯片不仅能够识别呼吸道病毒，还能够识别来自各种不同组织和体液的广泛病毒。使用 vichi 检测全血和血清中病毒的一些示例，如下所示。这些是对应于血液样本中 viro 芯片微射线的 ere 调用，每个样本从四名患者采集的全血或血清，显示前两个病毒预测，其中前两个病毒预测具有最低的 P 值。

例如，在以浅蓝色突出显示的样本中，该样本的最高预测是 1 型登革热病毒。虽然排名第二的预测是 2 型登革热病毒，但该全血样本中的实际病毒确实被确认为 1 型登革热病毒，这与 dict 结果一致。viro 芯片的另一个应用是新型病原体的发现。

一些例子包括 SARS 冠状病毒 X-M-R-V-A、OME 逆转录病毒的发现，以及与人类前列腺癌和慢性疲劳综合征相关的 HTCV，一种与儿童呼吸道和腹泻感染相关的新型人类心脏病毒一旦掌握。如果执行得当，这项技术可以在 12 小时内完成。在尝试此程序时，请务必记住确保此程序后所有必要的设备和试剂的可用性。

可以进行其他方法，如特异性病毒 PCR、扩增和深度测序，以确认和跟踪不寻常的病毒芯片杂交模式或表明存在新型病毒的病毒芯片结果。这项技术为肿瘤学领域的研究人员在生物防御和临床微生物学领域探索新型病毒与癌症的关联铺平了道路，以开发用于快速病原体诊断的浓缩微分析，以及在病毒学领域用于表征新型病毒及其与疾病的关联。看完这个视频，你应该对如何执行病毒芯片微射线检测的所有步骤有一个很好的了解，这是一种广谱监测测试，用于检测临床样本中的病毒病原体，从核酸提取，从临床样本到微射线杂交和分析。

不要忘记，处理临床样本被认为是生物危害性的，核酸提取应在生物安全等级为 2 级或更高等级的实验室中进行。