Name: 使用泛病毒基因芯片检测（Virochip）屏幕病毒病原体的临床标本 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 45 s
Description: 学习使用泛病毒基因芯片技术检测临床样本中的已知和未知病毒病原体。该方法通过核酸提取、逆转录、扩增和杂交步骤，帮助研究人员同时筛查多种病毒，提高诊断微生物学的检测效率。

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感谢 David Wang、Anatoly Urisman、Amy Kistler、Kael Fischer、Patrick Tang 和 Alexander Greninger 在 Virochip 实验方案的初步开发与优化中所做的贡献。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）K08 项目基金和雅培发现奖（授予 CC）以及霍华德·休斯医学研究所（授予 JLD）提供资助。

Virochip 检测的步骤包括：（1）从临床样本中提取核酸，（2）对提取的 RNA 进行逆转录以及 2nd-链cDNA合成，(3) 随机引物cDNA的PCR扩增，(3) 掺入Cy3荧光染料，(4) 将标记后的样本杂交至Virochip微阵列，以及(5) 扫描与分析（图1）。下述方案将演示在一名患有流感样疾病的儿童鼻拭子样本中使用Virochip检测的方法。
引物序列
引物A 5'-GTTTCCCAGTCACGATA-(N9)-3'
引物 B 5'-GTTTCCCAGTCACGATA-3'
1. 核酸提取
<ol>
	<li>临床样本的核酸提取应在生物安全二级（BSL-2）或更高级别的条件下进行，因为这些样本可能具有传染性。</li>
	<li>鼻拭子样本需保存于病毒转运液中。取200 μL样本加入1.5 mL Eppendorf离心管中。</li>
	<li>可选：将样本通过0.22 μm滤膜过滤（以纯化病毒颗粒）</li>
	<li>可选：使用Turbo DNAse试剂盒（Ambion），按照制造商说明书对样本进行DNA酶预处理（以降解宿主基因组DNA，纯化被保护的、衣壳化的病毒核酸）</li>
	<li>按照制造商说明书，使用Zymo ZR病毒RNA提取试剂盒或Qiagen Ultrasens病毒试剂盒提取样本。</li>
</ol>
2. 逆转录与2nd-链 cDNA 合成（“第一轮 A”）
<ol>
	<li>加入1 μL 40 pmol/ μL 引物A加入4 μL提取的RNA中。加热至 65°C 在热循环仪（例如 GeneAmp PCR System 9700）中孵育 5 分钟，然后于室温冷却 5 分钟。</li>
	<li>添加 5 μL 由一种主混合液组成，该混合液包含 2 μL 5X RT缓冲液， 1 μL 12.5 mM dNTP， 1 μL 水 0.5 μL 0.1 M DTT，以及 0.5 μL SSIII RT（Invitrogen）。37 °C孵育 42°C × 60 分钟。</li>
	<li>在可编程热循环仪中加热至 94°C x 2 分钟（以终止逆转录反应），冷却至 10°C，脉冲离心，然后加入 5 μL 由Sequenase混合液组成 1 μL 5X Sequenase缓冲液， 3.8 μL 水，和 0.15 μL Sequenase（USB Corporation）。对于2nd 链合成，从...开始升温 10°C 到 37°C 超过 8 分钟，保持 8 分钟，然后加热至 94°C x 2 分钟（以灭活 Sequenase）并冷却至 10°C （保持）</li>
	<li>可选 ：此时可将样品 cDNA 储存于 -20°C.</li>
</ol>
3. 随机引物cDNA的PCR扩增（“B轮”）
<ol>
	<li>将5 μL Rd A样品加入45 μL的预混液中，预混液包含5 μL 10× PCR缓冲液、1 μL 12.5 mM dNTP、1 μL 100 pmol/μL的引物B、1 μL KlenTaq LA（Sigma）以及37 μL水。</li>
	<li>运行PCR程序如下：94°C 2分钟 →（25个循环：94°C 30秒 / 50°C 45秒 / 72°C 1分钟）→ 72°C 5分钟 → 10°C（保存）</li>
	<li>在1.5%琼脂糖凝胶电泳上检测Rd B样品，应观察到约200–1000 bp的弥散条带（图2A）。</li>
</ol>
4. Cy3 荧光染料的掺入
<ol>
	<li>可选：另一个样本可用Cy5荧光染料标记，并与同一张微阵列进行杂交。</li>
	<li>为掺入aa-dNTP，将5 μL Rd B样本加入45 μL的主混合液中，主混合液组成为：5 μL 10X PCR缓冲液、1 μL 12.5 mM aa-dNTP（Invitrogen）、1 μL 100 pmol/μL的引物B、1 μL KlenTaq LA（Sigma）以及37 μL水。PCR程序如下：94°C，2分钟→（15个循环：94°C，30秒 / 50°C，45秒 / 72°C，1分钟）→72°C，5分钟→10°C（保持）</li>
	<li>使用DNA Clean and Concentrator-5试剂盒（Zymo Research）按照生产商说明书纯化Rd C样本，用10 μL洗脱。</li>
	<li>向Rd C样本中加入1 μL 1M碳酸氢盐（Sigma）和1 μL Cy5（GE Healthcare）。</li>
	<li>避光孵育1小时。</li>
	<li>使用DNA Clean and Concentrator-5试剂盒（Zymo Research）按照生产商说明书纯化Cy3标记的样本，用12 μL洗脱。</li>
</ol>
5. 病毒芯片微阵列杂交
<ol>
	<li>可选：使用 1.5 μL 样品在 Nanodrop 分光光度计上检测 cDNA 浓度及掺入的染料量（用于样品归一化）</li>
	<li>在 PCR 条状管中加入 1 μL 25X 断裂缓冲液、5 μL 5X 封闭缓冲液、9.5 μL（或用于归一化的相应体积）Cy3 标记样品，并加水至总体积为 25 μL（Agilent）</li>
	<li>加入 25 μL 2X GEx 杂交缓冲液（Agilent）。短暂离心以去除气泡。</li>
	<li>将 40 μL 样品加载至垫圈玻片上。</li>
	<li>将 Agilent 印制的 Virochip 芯片（加州大学旧金山分校 / Agilent）（标记“Agilent”的一面朝下）放置在垫圈玻片上方，并拧紧螺丝固定。</li>
	<li>在 65°C、转速 10 rpm 条件下过夜杂交。</li>
	<li>洗涤芯片时，先将缓冲液 2（Agilent）预热至 37°C。在缓冲液 1（Agilent）水下拆开垫圈玻片与芯片的夹心结构。用缓冲液 1 洗涤 1 分钟。用预热的缓冲液 2 洗涤 1 分钟。缓慢从缓冲液 2 中取出玻片，注意避免产生气泡（使用无尘纸吸去多余水分，注意避免直接接触芯片的活性面）</li>
	<li>将玻片放入玻片架中，并插入芯片扫描仪。</li>
</ol>
6. Virochip 扫描与分析
<ol>
	<li>根据仪器的标准扫描程序，以 5 μm 或 2 μm 对 Cy3 标记的芯片进行扫描（图 2B）。</li>
	<li>通过目视检查、聚类分析或自动化的 Virochip 分析程序 E-Predict11 分析 Virochip 微阵列。这三种方法均可在鼻拭子样本（来自一名患有流感样疾病的儿童）中明确检测到流感病毒（图 2C）。</li>
</ol>
7. 代表性结果：
当实验步骤正确执行时，在Rd B步骤后，琼脂糖凝胶电泳应可见涂抹状条带（图2A）。在Agilent平台上进行的Virochip微阵列难以通过肉眼直接分析（图2B），但如果存在病毒，则应可通过目视检查、聚类分析和/或E-Predict方法轻松鉴定（图1C）。可向样本中加入已知病毒的定量核酸（例如烟草花叶病毒；MS2噬菌体）作为检测的阳性对照。
<img src="/files/ftp_upload/2536/2536fig1.jpg" alt="核酸提取、PCR扩增、微阵列扫描及检测分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
 图1. Virochip微阵列处理与分析示意图。 从临床样本中提取的核酸经过随机扩增，用荧光染料标记后与Virochip微阵列进行杂交。微阵列以2 μm分辨率扫描，并利用多种计算工具（包括E-Predict）进行分析。
<img src="/files/ftp_upload/2536/2536fig2.jpg" alt="DNA电泳结果、微阵列分析、病毒基因表达比较图。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
 图2. Virochip检测的步骤。 经随机PCR扩增后，可通过凝胶电泳观察到大小为200 - 1000 bp的弥散条带 (A)。 (B) 显示了每张玻片上8个微阵列中的3个Virochip微阵列，右下角插图为其中一个微阵列的局部放大图。 (C) 使用E-Predict进行自动化的微阵列病毒分析，结果显示临床样本中存在甲型流感病毒。较高的相似性评分（s=0.55）对应接近于零的p值，表明该预测具有极高的显著性。

<ol><li>Wang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray-based+detection+and+genotyping+of+viral+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Microarray-based detection and genotyping of viral pathogens.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 15687-15692 (2002).</li>
<li>Chiu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+a+critical+respiratory+illness+caused+by+human+metapneumovirus+by+use+of+a+pan-virus+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of a critical respiratory illness caused by human metapneumovirus by use of a pan-virus microarray.</a> J Clin Microbiol. 45, 2340-2343 (2007).</li>
<li>Chiu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+detection+of+human+parainfluenzavirus+4+infection+associated+with+respiratory+failure+in+an+immunocompetent+adult%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Microarray detection of human parainfluenzavirus 4 infection associated with respiratory failure in an immunocompetent adult.</a> Clin Infect Dis. 43, e71-e76 (2006).</li>
<li>Chiu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+DNA+microarrays+for+detection+of+viruses+in+acute+respiratory+tract+infections+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pediatr%22%5BJournal%5D)">Utility of DNA microarrays for detection of viruses in acute respiratory tract infections in children.</a> J Pediatr. 153, 76-83 (2008).</li>
<li>Kistler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pan-viral+screening+of+respiratory+tract+infections+in+adults+with+and+without+asthma+reveals+unexpected+human+coronavirus+and+human+rhinovirus+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Pan-viral screening of respiratory tract infections in adults with and without asthma reveals unexpected human coronavirus and human rhinovirus diversity.</a> J Infect Dis. 196, 817-825 (2007).</li>
<li>Rota, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+novel+coronavirus+associated+with+severe+acute+respiratory+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Characterization of a novel coronavirus associated with severe acute respiratory syndrome.</a> Science. 300, 1394-1399 (2003).</li>
<li>Wang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+discovery+and+sequence+recovery+using+DNA+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Viral discovery and sequence recovery using DNA microarrays.</a> PLoS Biol. 1, e2-e2 (2003).</li>
<li>Urisman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+Gammaretrovirus+in+prostate+tumors+of+patients+homozygous+for+R462Q+RNASEL+variant%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel Gammaretrovirus in prostate tumors of patients homozygous for R462Q RNASEL variant.</a> PLoS Pathog. 2, 25-25 (2006).</li>
<li>Kistler, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+divergent+avian+bornaviruses+from+cases+of+proventricular+dilatation+disease%3A+identification+of+a+candidate+etiologic+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Virol+J%22%5BJournal%5D)">Recovery of divergent avian bornaviruses from cases of proventricular dilatation disease: identification of a candidate etiologic agent.</a> Virol J. 5, e25-e25 (2008).</li>
<li>Chiu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+cardioviruses+related+to+Theiler%27s+murine+encephalomyelitis+virus+in+human+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Identification of cardioviruses related to Theiler's murine encephalomyelitis virus in human infections.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 14124-14129 (2008).</li>
<li>Urisman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-Predict%3A+a+computational+strategy+for+species+identification+based+on+observed+DNA+microarray+hybridization+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">E-Predict: a computational strategy for species identification based on observed DNA microarray hybridization patterns.</a> Genome Biol. 6, R78-R78 (2005).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

本文所述的Virochip实验方案较为复杂，需要由细致且技术娴熟的研究技术人员操作。PCR、标记和杂交过程中试剂的正确浓度和反应条件至关重要。可通过使用TRIzol（Invitrogen）等组织提取方法提取核酸，从而对Virochip实验方案进行简单修改，以适用于病变组织的分析。可根据需要随时增删探针，以获得理想的检测范围和覆盖广度；例如，可设计并快速添加用于检测细菌和真菌等非病毒目标的探针。目前正处于开发阶段的Virochip检测应用包括临床实验室中的广谱病毒诊断、疫情暴发调查、药物与疫苗的纯度筛查，以及新发病毒病原体的发现。

使用泛病毒微阵列检测技术（virochip）对临床样本进行病毒病原体筛查

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

由于病毒本身具有内在的序列多样性，以及不断出现传统方法无法检测到的新型病毒病原体（如SARS冠状病毒和2009年大流行的H1N1流感病毒），许多传染性疾病的病毒病因诊断十分困难。为应对这些挑战，我们此前已开发并验证了一种名为Virochip的广谱病毒微阵列平台，该平台基于保守序列同源性，能够检测所有已知病毒以及新型变异病毒1。利用Virochip，我们已鉴定出与呼吸道感染相关的全部病毒谱系，包括住院患者中病因不明的重症病例，其检测灵敏度相当于甚至优于常规临床检测方法2-5。Virochip还被用于发现多种新型病毒，包括SARS冠状病毒6,7、一种新型鼻病毒进化枝5、XMRV（一种与前列腺癌相关的逆转录病毒）8、禽类博尔纳病毒（导致鹦鹉消耗性疾病的原因）9，以及在患有呼吸道和腹泻疾病的儿童中发现的一种新型心病毒10。截至2009年12月，当前版本的Virochip已迁移至Agilent微阵列平台，包含约36,000个探针，来源于GenBank中超过1,500种病毒。本文将演示从头到尾完成一次Virochip检测的全部步骤（约24小时周转时间），包括样本核酸提取、使用随机引物进行PCR扩增、荧光染料标记、微阵列杂交、扫描及数据分析。

Virochip 是一种泛病毒微阵列，旨在基于保守序列同源性，同时检测所有已知病毒以及新病毒。本文演示如何运行 Virochip 检测，以分析临床样本中是否存在已知和未知病毒。

使用泛病毒微阵列检测技术（Virochip）对临床样本进行病毒病原体筛查

许多传染性疾病的病毒病因诊断较为困难，原因在于病毒固有的序列多样性以及不断出现的新病毒……

本实验采用Viro芯片（一种广谱病毒微阵列检测方法）对临床样本中的已知和未知病毒进行分析。首先从临床样本中提取核酸，然后利用随机引物对提取的RNA进行逆转录。进行第二链cDNA合成，并通过随机PCR扩增cDNA文库。然后用荧光染料标记扩增后的cDNA，杂交至病毒芯片微阵列。最后一步是扫描并分析微阵列。最终，通过分析芯片微阵列，可以获得显示一种或多种病毒存在与否的结果。在诊断微生物学中，需要病毒芯片微阵列等广谱检测方法，因为肺炎等常见临床综合征并非由特定单一病原体引起，同时由于新发病毒病原体（如SARS冠状病毒和2009年新型H1N1流感病毒）持续出现。该方法有助于回答诊断微生物学领域中的关键问题，例如在临床环境中，有多少比例的未确诊感染可能由尚未识别的新型病毒引起。该技术的意义在于能够同时检测数百至数千种潜在病原体，从而有助于提高医院内急性临床疾病的诊断水平。我们最初在2002年提出了这一方法的想法，当时我们决定将加州大学旧金山分校（UCSF）Joseph DeRisi博士实验室首创的新兴微阵列技术应用于病毒检测。我们首个真实世界的应用案例是在2003年利用病毒芯片鉴定出导致SARS的新型冠状病毒。本文将完整展示该方法的全部流程，由我实验室的一名技术人员示范如何使用病毒芯片检测法，对一名儿童的鼻拭子样本进行分析，以诊断其急性呼吸道疾病的病因。鼻咽拭子样本采集后置于含有病毒转运液的无菌容器中，并储存在–80°C的冷冻冰箱中。在生物安全柜中，将含有样本的试管放置至解冻，轻轻搅拌拭子以混匀液体，随后将拭子丢弃至生物危害废弃物垃圾桶中。然后取 200 微升样本分装至一个 1.5 毫升离心管中。使用 0.22 微米离心滤器将样本过滤，以纯化病毒颗粒，并收集滤液至新的 1.5 毫升离心管中。接下来，按照Ambien公司Turbo DNA试剂盒的说明书降解宿主基因组DNA，并纯化被保护的包封病毒核酸。随后，使用XMO ZR病毒RNA提取试剂盒或Qiagen超声波病毒试剂盒，根据制造商说明书进行RNA提取。使用NanoDrop核酸分光光度计测定所提取RNA的浓度。RNA 浓度最好至少为 10 纳克/微升，但不同样品间可能存在差异，使用薄壁 200 微升管进行操作。向 4 微升提取的 RNA 中加入 1 微升浓度为 40 皮摩尔/微升的引物 A。将样品在热循环仪中 65 摄氏度加热 5 分钟，然后让离心管在室温下冷却 5 分钟。接下来，在热循环仪中加入5 µL预混液，其中包含2 µL 5倍逆转录缓冲液、1 µL 12.5 mmol/L dNTP、1 µL水、0.5 µL 0.1 mol/L DTT以及0.5 µL Superscript III逆转录酶。将反应管在42 °C孵育60分钟，随后在94 °C加热2分钟。为终止逆转录反应，将反应体系降温至10摄氏度并保持两分钟，随后瞬时离心5秒。接下来，加入5微升quease混合液，其中包含1微升5倍浓度quease缓冲液、3.8微升水和0.15微升quease第二链合成酶。在8分钟内将PCR仪温度从10摄氏度逐步升至37摄氏度。在 37 摄氏度下保持 8 分钟。然后加热至 94 摄氏度持续 2 分钟以灭活酶活性，并在此时将温度降至 10 摄氏度。如需要，可将含有 15 µL cDNA 的样品于 -20 摄氏度保存。首先，将5 µL cDNA样品加入45 µL的预混液中，该预混液包含5 µL 10倍PCR缓冲液、1 µL 12.5 mmol/L dNTP、1 µL 100 pmol/µL引物B、1 µL Clontech LA以及37 µL水。然后按照以下程序运行PCR：94 °C预变性2分钟，随后进行25个循环，每个循环包括94 °C变性30秒、50 °C退火45秒和72 °C延伸1分钟。然后在72摄氏度下进行5分钟的延伸步骤，PCR结束后在10摄氏度下保存。通过1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，应观察到大小约为200至1000个碱基对的弥散条带。为了掺入 AAD dNTP，将 5 微升病毒 PCR 产物加入 45 微升的主混合液中，主混合液包含 5 微升 10 倍 PCR 缓冲液、1 微升 12.5 毫摩尔 A-A-D-N-T-P、1 微升 100 pmol/微升引物 B、1 微升 ClinTech LA 以及 37 微升水。按照以下程序运行 PCR：94 摄氏度 2 分钟，15 个循环（94 摄氏度 30 秒，50 摄氏度 45 秒）。72摄氏度下反应1分钟，随后在72摄氏度延伸5分钟，然后在10摄氏度保存。接着按照生产商说明书，使用DNA纯化浓缩试剂盒3对新生成的PCR产物进行纯化，并用10微升洗脱缓冲液溶解。向10微升PCR产物中加入1微升1摩尔碳酸氢盐溶液和1微升si three，在避光条件下孵育1小时。接下来，再次使用DNA纯化浓缩试剂盒5（DNA clean and concentrator five kit）对标记为S的样品进行纯化，并用12微升洗脱缓冲液洗脱。取1.5微升样品，使用NanoDrop分光光度计在PCR条形管中检测cDNA浓度及掺入的染料量。反应体系包含：1微升25倍片段化缓冲液、5微升5倍阻断缓冲液、9.5微升或为达到SI标记样品归一化终浓度10 peak或pmol/微升所需的样品量，以及加水至总体积25微升。然后加入25微升2倍GX杂交缓冲液，短暂离心以去除气泡。将新的垫圈玻片放入杂交室中。取40微升样品加入垫圈玻片上。随后将Agilent打印的病毒芯片有Agilent标记的一面朝下置于垫圈玻片上方，并拧紧螺丝固定。将杂交室置于65摄氏度的烘箱中，在10转/分钟的缓慢旋转条件下过夜杂交，以洗涤芯片。首先在加热过程中将缓冲液二预热至37摄氏度。取一个500毫升的塑料容器，加入约250毫升缓冲液一。从杂交室中取出芯片，将芯片浸入液体中并与垫圈玻片分离。将芯片转移至洁净的容器中，用缓冲液一洗涤一分钟。然后使用另一个500毫升的塑料容器。将芯片放入预热的缓冲液二中洗涤一分钟。洗涤后，缓慢将芯片从缓冲液二中取出，注意避免产生气泡。使用无尘纸轻轻吸去多余水分，注意避免直接接触芯片阵列的活性面。最后，将玻片有源面朝上放入安捷伦专用玻片架中，并插入阵列扫描仪。本实验采用安捷伦（Agilent）两微米 DNA 微阵列扫描仪。根据仪器的标准扫描程序，以五微米或两微米的分辨率扫描SI三个标记的阵列。通过聚类分析或自动化的RO chipp分析程序e unpredic分析病毒芯片微阵列。使用Viro Chipp微阵列，可轻松检测从患有流感样疾病的儿童鼻拭子样本中获得的2009年新型流感H1N1病毒。此外，我们已证实该病毒芯片不仅能够鉴定呼吸道病毒，还能识别来自多种不同组织和体液的广泛病毒。此处展示的是使用病毒芯片（vichi）在全血和血清中检测病毒的一些实例。这些是对应于从四位患者采集的全血或血清样本的病毒芯片微阵列（viro chip microray）的检测信号，每个样本均显示前两个病毒预测结果，其中排名第一的病毒预测具有最低的 P 值。例如，在浅蓝色高亮显示的样本中，该样本的最高预测结果为登革病毒1型。尽管排名第二的预测结果为登革病毒2型，但该全血样本中的实际病毒经确认确实为登革病毒1型，与dict结果一致。ViroChip的另一项应用在于新病原体的发现。一些实例包括发现SARS冠状病毒X-M-R-V-A、与人类前列腺癌和慢性疲劳综合征相关的OME逆转录病毒，以及一种新型人类心病毒HTCV，该病毒与儿童的呼吸道感染和腹泻有关。一旦掌握该技术，若操作得当，可在12小时内完成。在进行此操作时，重要的是要牢记，必须确保按照本方案备齐所有必需的仪器设备和试剂。其他方法，如特异性病毒 PCR 扩增和深度测序，可用于在病毒芯片杂交模式异常或病毒芯片结果提示存在新病毒的情况下，进行确认和后续分析。该技术的建立为肿瘤学领域的研究人员探索新病毒与癌症之间的关联、在生物防御和临床微生物学领域开发基于微阵列的快速病原体诊断浓缩检测方法，以及在病毒学领域对新病毒及其与疾病关联的特征分析铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分理解如何完成病毒芯片微阵列检测的全部步骤——一种用于在临床样本中检测病毒病原体的广谱监测方法，涵盖从临床样本中提取核酸，到微阵列杂交及数据分析的完整流程。请注意，处理临床样本被视为具有生物危害性，核酸提取应在生物安全二级或更高等级的实验室中进行。

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已开发、优化、验证并应用了三种检测方法，包括基于细胞病变效应（CPE）的检测、剂量-反应检测和加药时间（ToA）检测，用于筛选针对蓝舌病毒（BTV）的新型抗病毒药物，并确定新发现抗病毒药物可能的作用机制（MoA）。...

检测针对蓝舌病毒新型抗病毒药物的实验方法

体外检测病毒复制的实验方法已因表达荧光素酶或其他可产生生物发光的酶的重组RNA病毒的发展而得到显著改进。本文详细介绍了一种高通量筛选流程，该流程结合了麻疹病毒和基孔肯雅病毒的此类重组毒株，用于从化合物库中筛选广谱抗病毒药物。...

广谱RNA病毒化学抑制剂的高通量筛选

采用综合征性犬和马呼吸道PCR检测面板，描述了基于纳米级PCR技术对DNA和RNA病原体进行高通量检测的方法。...

基于纳米级PCR技术对动物样本中呼吸道病原体的高通量检测

本文介绍了一种利用高通量RNA干扰筛选来发现可被调控以增强溶瘤病毒治疗效果的宿主靶点的实验方案，特别是针对弹状病毒和痘苗病毒治疗，但该方法也可轻松适用于其他溶瘤病毒平台，或用于发现普遍调控病毒复制的宿主基因。...

全基因组RNA干扰筛选鉴定调控溶瘤病毒治疗的宿主因子

学习使用泛病毒基因芯片技术检测临床样本中的已知和未知病毒病原体。该方法通过核酸提取、逆转录、扩增和杂交步骤，帮助研究人员同时筛查多种病毒，提高诊断微生物学的检测效率。

使用泛病毒微阵列检测技术（Virochip）对临床样本进行病毒病原体筛查

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