头颈部鳞状细胞癌中具有干细胞特性的亚群的分离与鉴定

本实验的总体目标是从头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）细胞系中分离出肿瘤干细胞。该方法有助于解答肿瘤治疗领域中的关键问题，即如何利用化疗手段克服肿瘤的放射抗性。该技术的主要优势在于，它采用多种标志物联合标记，从而实现从HNSCC细胞系中高特异性地分离肿瘤干细胞。

演示该实验步骤的是本实验室的技术员普雷斯西莉亚·巴蒂斯通-蒙塔涅（Prescillia Battiston-Montagne）以及博士生玛丽昂·吉洛尔米尼（Marion Gilormini）。通过Hoechst染料外排法筛选侧群中的肿瘤干细胞样细胞时，首先标记一个锥形管为Hoechst，另一个标记为Hoechst和维拉帕米（Verapamil）。接着，用无菌PBS洗涤头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）细胞培养物，然后加入一毫升的胰蛋白酶-EDTA（Tripsyn EDTA）。

在37摄氏度孵育3分钟后，加入新鲜的细胞培养基终止反应，并对细胞进行计数。将细胞培养物稀释至每毫升1×10⁷个细胞，并补充完全的亲本细胞系培养基。然后向Hoechst和维拉帕米管中加入100微升，向Hoechst管中加入4毫升细胞悬液。

接下来，将10微升5毫摩尔的盐酸维拉帕米溶液轻轻混入Hoechst与维拉帕米样品中，随后每1×10⁶个细胞加入5微升Hoechst至两个离心管中。然后用铝箔包裹样品，并置于37°C条件下。每15分钟轻柔混匀一次，90分钟后离心各管，并将沉淀重悬于2毫升PBS中。

经过一次离心后，将Hoechst和维拉帕米的沉淀重悬于500微升含碘化丙啶的PBS溶液中，将Hoechst沉淀重悬于4毫升相同的溶液中。接着将样品通过70微米细胞滤网过滤至FACS管中，以去除任何聚集体，并将样品置于冰上避光保存。然后，将Hoechst样品上样至流式细胞仪，并在流式细胞仪软件中打开全局工作表窗口。

单击“点图”以在全局工作表上创建图表，然后右键单击以选择前向散射和侧向散射参数。以相同方式创建一幅侧向散射宽度对侧向散射高度的点图，然后单击多边形门控，在第二幅图中创建 P1 区域，以选择单细胞并区分双联体。接下来，创建一幅红色 Hoechst 面积对蓝色 Hoechst 面积的点图，然后右键单击细胞以高亮显示 P1 群体。

然后创建一个P2区域，用于选择位于主细胞群左侧、呈侧臂状分布的Hoechst染料阴性侧群细胞，并收集10,000个Hoechst样本事件。为了确认代表侧群的P2门控位置正确，同时收集10,000个Hoechst和维拉帕米样本事件。此时侧群应消失。

然后将Hoechst染料阴性细胞的侧群分选至含有1毫升完全培养的肿瘤干细胞样细胞培养基的15毫升锥形管中。分选结束后，离心收集细胞，并将侧群细胞沉淀重悬于1毫升新鲜的完全培养的肿瘤干细胞样细胞培养基中。随后对细胞进行计数，并以适当数量接种至新的细胞培养瓶中。

为了从分选后的侧群细胞中选出 CD44 高表达/ALDH 高表达的细胞亚群，首先按指示标记七个无菌的 15 毫升锥形管。接着，将分选后的细胞用干细胞培养基稀释至每毫升含 1 × 10⁷ 个细胞，并将 100 微升细胞悬液分装至未染色的 CD44-APC 管和 IGG1-APC 管中，将 4 毫升细胞悬液分装至 ALDH 和 CD44-APC 管中，所有操作均置于冰上进行。离心沉淀细胞后，将未染色的 CD44-APC 管和 IGG1-APC 管中的细胞沉淀用 ALDEFLUOR 试剂盒中的缓冲液一重悬于 100 微升中。

然后向 ALDH 和 DEAB、以及 ALDH DEAB 和 CD44-APC 管中各加入 5 µL 的 ALDH 抑制剂 DEAB。将 ALDH 和 CD44-APC 管中的细胞重悬于 4 mL 试剂 C 中（试剂 C 包含 4 mL 缓冲液一和 20 µL 试剂盒中的试剂），并立即取 100 µL 该细胞悬液分别加入 ALDH 管、ALDH 和 DEAB 管、以及 ALDH DEAB 和 CD44-APC 管中。随后将所有管置于 37°C 水浴中避光孵育 30 分钟，并在 15 分钟后轻轻涡旋混匀样本。

孵育结束后，离心所有样品并弃去上清液。然后将所有离心管置于冰上，将 ALDH 和 CD44-APC 沉淀重悬于 4 毫升缓冲液 A 中，将 CD44-APC 和 ALDH DEAB 以及 CD44-APC 沉淀重悬于 100 微升相同缓冲液 A 中。将 IGG1-APC 沉淀重悬于 100 微升缓冲液 B 中，将未染色的 ALDH 以及 ALDH 和 DEAB 管中的沉淀重悬于 100 微升缓冲液 1 中。

10分钟后，再次离心所有样品，然后除ALDH和CD44-APC样品外，其余样品均用1毫升缓冲液一洗涤；ALDH和CD44-APC样品则用4毫升缓冲液一洗涤。第二次离心后，除ALDH和CD44-APC样品外，其余样品均重悬于1毫升新鲜缓冲液一中；ALDH和CD44-APC样品则重悬于4毫升缓冲液一中。现在将ALDH和CD44-APC样品管上机流式细胞仪，创建APC与FITC点图，以观察双染阳性细胞群。

接下来，加载 ALDH 管以创建 ALDH 高表达细胞的门控。当加载 ALDH 和 DEAB 管时，阳性细胞应消失。在同一张图中，使用 CD44-APC 和 IGG1-APC 管创建第二个门控，以筛选 CD44 高表达细胞。

当加载 IGG1-APC 管时，阳性细胞将消失。随后加载 ALDH 和 CD44-APC 管以及 ALDH DEAB 和 CD44-APC 管，以创建第三个门，包含 CD44 高表达/ALDH 高表达的细胞。使用双染色 ALDH-CD44 管将最后一个门定位在双阳性细胞上。

然后将CD44高表达/ALDH高表达的细胞分选至含有1毫升完全培养基的15毫升锥形管中，该培养基为完全的肿瘤干细胞样细胞培养基；根据需要，将CD44低表达/ALDH低表达的细胞收集至1毫升完全细胞培养基中。第二次分选后，将CD44高表达/ALDH高表达的细胞接种至合适的细胞培养瓶中，加入完全的肿瘤干细胞样细胞培养基，并置于细胞培养孵育箱中培养18至24小时。待细胞贴壁至培养瓶底部后，更换培养基，并将培养瓶重新放回孵育箱中。

为了验证CD44高表达/ALDH高表达细胞的成瘤潜能，按照所示方法对类癌干细胞单层细胞进行胰蛋白酶消化，获得单细胞悬液，并将1×10⁶个细胞转移至15毫升锥形管中。离心后，将细胞沉淀重悬于添加了重组人表皮生长因子、肝素和B27的低血清培养基中，置于低黏附性培养皿内，在细胞培养孵育箱中孵育，直至在光学显微镜下观察到肿瘤球形成。当首次对新细胞系进行分选时，有必要通过该细胞系在无血清培养基中体外形成肿瘤球的能力，来确认其成瘤潜能。

此外，qPCR 应显示 CD44 高表达/ALDH 高表达细胞中 β-catenin 及其他类干细胞标志物的高表达水平。与 CD44 低表达/ALDH 低表达细胞相比，CD44 高表达/ALDH 高表达细胞在少量接种时也应能够在体内形成肿瘤。若操作得当，熟练掌握后每次细胞分选可在五小时内完成。

在进行该实验操作时，重要的是要始终注意保护荧光染料标记的样本，避免其暴露于直射光线下。完成该操作后，可进一步开展其他方法，如侵袭迁移实验，以探究癌症干细胞在转移过程中的作用。该技术建立后，为头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）领域的研究人员探索肿瘤逃逸机制开辟了新的途径。

观看本视频后，您应能够充分理解如何利用多参数流式细胞术分析和细胞分选技术从头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）细胞系中分离出肿瘤干细胞。请务必注意，操作肿瘤细胞以及插入性DNA试剂具有极高的危险性，在进行本实验操作时，必须采取相应防护措施，例如穿戴实验服和手套。