分离和表征头颈部鳞状细胞癌亚群具有干细胞特性

该程序的总体目标是从头颈部鳞状细胞癌或 HNSCC 细胞系中分离癌症干细胞。这种方法可以帮助回答癌症治疗领域中关于如何使用化疗来克服肿瘤放射抵抗的关键问题。该技术的主要优点是它使用标记物的组合在来自 HNSCC 细胞系的癌症干细胞中实现高特异性。

演示该程序将由我们的技术人员 Prescillia Battiston-Montagne 和我实验室的博士 Marion Gilormini 负责。要通过 Hoechst 染料外排测定选择癌症干细胞样细胞的侧群，首先标记一个锥形管 Hoechst 和一个 Hoechst 和维拉帕米。接下来，用无菌 PBS 洗涤 HNSCC 细胞培养物，然后加入 1 毫升 Tripsyn EDTA。

在 37 摄氏度下 3 分钟后，用新鲜的细胞培养基终止反应并对细胞进行计数。将培养物稀释至每毫升 10 至第 7 个细胞的 1 倍，并完成亲本细胞系培养基。然后向 Hoechst 和 Verapamil 管中加入 100 微升，向 Hoechst 管中加入 4 毫升细胞。

接下来，将 10 微升 5 毫摩尔盐酸维拉帕米溶液轻轻混合到 Hoechst 和 Verapamil 样品中，然后每 1 乘以 10 将 5 微升 Hoechst 混合到两个管中的第六个细胞中。然后用铝箔覆盖样品并将它们置于 37 摄氏度。90 分钟后，每 15 分钟轻轻混合，离心试管，并将沉淀重悬于 2 mL PBS 中。

中心离心后，将 Hoechst 和 Verapamil 沉淀重悬于 PBS 中的 500 微升碘化丙啶中，将 Hoechst 沉淀重悬于 4 毫升相同的碘化丙啶中。现在通过 70 微米细胞过滤器将样品过滤到 FACS 管中，以去除任何聚集体并将样品放在避光的冰上。接下来，将 Hoechst 样品加载到流式细胞仪上，并在流式细胞仪软件中打开 Global Worksheet 窗口。

单击 点图 在 Global Worksheet 上创建一个图形，然后右键单击以选择前向和侧向散射参数。以相同的方式通过侧向散射高度点图创建一个宽的侧向散射，然后单击多边形门在第二个图形中创建 P1 区域，以选择单个单元格并区分双峰。接下来，通过蓝色的 Hoechst 面积点图创建一个红色的 Hoechst 面积，然后右键单击单元格以突出显示 P1 种群。

然后创建一个 P2 区域以选择阴性 Hoechst 染料侧细胞群，该细胞群显示为主要细胞群左侧的侧臂，并收集 10， 000 个 Hoechst 样品事件。要确认代表侧群体的 P2 门位置正确，请同时收集 10， 000 个 Hoechst 和 Verapamil 样本事件。Side 种群应该消失。

然后将 Hoechst 染料阴性细胞的侧群分选到含有 1 毫升完整癌症干细胞样细胞培养基的 15 毫升锥形管中。在分选结束时，旋转细胞并将副群沉淀重悬于一毫升新鲜的完全癌症干细胞样细胞培养基中。然后对细胞进行计数，并以适当数量将它们接种到新的细胞培养瓶中。

要从分选的侧群细胞中选择 CD44-high/ALDH-high 亚群，首先如图所示标记 7 个无菌 15 毫升锥形管。接下来，在干细胞培养基中将分选的细胞稀释至每毫升 7 个细胞的 1 倍，并将 100 微升细胞分装到未染色的 CD44-APC 和 IGG1-APC 管中，将 4 毫升细胞分装到 ALDH 和 CD44-APC 管中，全部在冰上。离心细胞，将未染色的 CD44-APC 和 IGG1-APC 沉淀重悬于 ALDEFLUOR 试剂盒中的 100 微升缓冲液 1 中。

然后将 5 微升 ALDH 抑制剂 DEAB 添加到 ALDH 和 DEAB 以及 ALDH DEAB 和 CD44-APC 管中。将 ALDH 和 CD44-APC 管中的细胞重悬于 4 毫升试剂 C 中，其中含有 4 毫升缓冲液、试剂盒中的 1 和 20 微升试剂，并立即将这些细胞转移到 ALDH、ALDH 和 DEAB 以及 ALDH DEAB 和 CD44-APC 管中。然后将所有试管置于 37 摄氏度的水浴中 30 分钟，避光，15 分钟后通过轻轻涡旋混合样品。

在孵育结束时，离心所有样品并弃去上清液。然后将所有试管置于冰上，将 ALDH 和 CD44-APC 沉淀重悬于 4 毫升缓冲液 A 中，CD44-APC 和 ALDH DEAB 和 CD44-APC 沉淀在 100 微升相同中。将 IGG1-APC 沉淀重悬于 100 微升缓冲液 B 中，将未染色的 ALDH 和 ALDH 和 DEAB 管重悬于 100 微升缓冲液 1 中。

10 分钟后，再次离心所有样品，然后在 1 mL 缓冲液 1 中洗涤除 ALDH 和 CD44-APC 样品外的所有样品，ALDH 和 CD44-APC 样品在 4 mL 缓冲液 1 中洗涤。第二次离心后，将所有沉淀重悬于 1 毫升新鲜缓冲液 1 中，但 ALDH 和 CD44-APC 样品除外，它们重悬于 4 毫升缓冲液 1 中。现在将 ALDH 和 CD44-APC 管加载到流式细胞仪上，并通过拟合点图创建 APC 以可视化双染色群体。

接下来，加载 ALDH 管，为 ALDH 高细胞创建一个门。当 ALDH 和 DEAB 管加载时，阳性细胞应消失。在同一张图中，使用 CD44-APC 和 IGG1-APC 管创建第二个门以选择 CD44 高细胞。

当加载 IGG1-APC 管时，阳性细胞将消失。然后加载 ALDH 和 CD44-APC 以及 ALDH DEAB 和 CD44-APC 管，以创建包含 CD44 高/ALDH 高细胞的第三个门。使用双染色 ALDH-CD44 管将最后一个门定位在双阳性细胞上。

然后将 CD44 高/ALDH 高细胞分选到含有 1 毫升完全癌症干细胞样细胞培养基的 15 毫升锥形管中，根据需要将 CD44 低/ALDH 低细胞收集在一毫升完全细胞培养基中。第二次排序后，将 CD44 高/ALDH 高细胞接种到合适的细胞培养瓶中，在细胞培养箱中加入完整的癌症干细胞样细胞培养基 18 至 24 小时。当细胞附着在培养瓶底部时，更换培养基并将培养瓶放回培养箱中。

为了确认 CD44 高/ALDH 高细胞的肿瘤潜力，如图所示，胰蛋白酶消化癌症干细胞样单层以获得单细胞悬液，并将 10 乘以 6 个细胞转移到 15 毫升锥形管中。离心细胞后，将沉淀重悬于补充有重组人表皮生长因子肝素和 B27 的低血清培养基中，并将细胞在细胞培养箱中的低锚定培养皿中孵育，直到通过光学显微镜观察到肿瘤球。当首次对新细胞系进行分选时，有必要确认细胞系的肿瘤潜力，其体外在无血清培养基中形成肿瘤球的能力证明了这一点。

此外，QPCR 应显示 CD44-high/ALDH-high 细胞高表达 β-catenin 和其他干细胞样细胞标志物。与 CD44-low/ALDH-low 细胞相比，CD44-high/ALDH-high 细胞在少量注射时也应该能够在原位形成肿瘤。一旦掌握，如果作得当，每个细胞分选应该能够在 5 小时内完成。

在尝试此过程时，请务必记住保护荧光染料标记的样品免受阳光直射。在此程序之后，可以执行其他方法，如侵袭迁移测定，以回答有关癌症干细胞参与转移过程的其他问题。该技术开发后，为癌症领域的研究人员探索 HNSCC 癌症中肿瘤逃逸的机制铺平了道路。

观看此视频后，您应该对如何使用多参数、流式细胞术分析和细胞分选从 HNSCC 细胞系中分离癌症干细胞有很好的了解。不要忘记，与肿瘤细胞和嵌入 DNA 试剂一起工作可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如穿着实验服和手套。