Name: 器官型培养的神经元雪崩多电极阵列记录 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 1 s
Description: 学习利用多电极阵列记录皮层与中脑共培养体系的神经元雪崩活动，研究临界态动力学特征。该技术可在体外精确控制条件下研究神经网络水平的自发活动自组织行为及其时空特性。

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本研究由美国国家心理健康研究所（国家卫生研究院）院内研究计划（DIRP）资助。

1. 用于长期记录的带MEA的无菌、可密封玻璃腔室
<ol>
<li>使用带聚四氟乙烯（Teflon）塑料盖的螺纹玻璃圆筒（Ace Glass），该部件用于确保培养室的牢固密封，需在螺纹底部约 2 mm 处切割（Aceglass）（图 1A、B）。通过用水冲洗（3 次）并用 200 证明乙醇煮沸 5 分钟来清洁玻璃环，然后晾干。</li>
<li>分装用于将玻璃环固定在 MEA 表面的硅溶液。将 Sylgard 184 硅胶弹性体试剂盒的 A 和 B 组分各 15 ml 充分混合，静置 15 分钟以去除气泡，并以 1 ml 分装量储存于 -20 °C。</li>
<li>将玻璃环粘接到 MEA 上（8×8 网格，内置接地电极，电极直径为 30 μm，大鼠/小鼠用的电极间距为 200/100 μm）（图 1A、B）。用带细针头的注射器吸取 1 ml 硅胶（23 °C），将硅胶涂于玻璃环未抛光的切割面，将玻璃环居中放置在 MEA 上，并在环外周再涂一层硅胶以增强密封性，然后在加热板上约 60 °C 条件下固化 1–2 小时。</li>
<li>在超净工作台中对 MEA 培养室及盖子进行灭菌：先用去离子水冲洗 3 次，再用 70% 乙醇冲洗 3 次（最后一次冲洗后让乙醇在内部停留 10 分钟），随后将培养室和盖子的内表面暴露于紫外光下照射 10 分钟。然后将 MEA 培养室进行高压蒸汽灭菌（120 °C，湿热，45 分钟），并晾干。</li>
<li>用聚-D-赖氨酸包被 MEA 培养室内的表面。对于新的 MEA（通常较具疏水性），通过反复吸取电极网格上的溶液液滴进行包被；对于已使用过的 MEA，则将溶液覆盖整个培养室底部，吸除多余液体，并在超净工作台内无菌条件下使其自然蒸发。将盖子装上以密封 MEA 培养室，用于储存和后续使用。</li>
</ol>

2. 器官型培养物制备与培养所需试剂
<ol>
<li>将无菌琼脂溶解于0.9% NaCl中，倒入无菌培养皿（Falcon，100 × 15；厚度约5 mm），冷却后用Parafilm封口膜无菌包裹保存。使用时从固体琼脂中切取20 × 10 × 5 mm的琼脂块。</li>
<li>将超级胶水（例如Devcon Super Glue II）在开启前用70%乙醇擦拭包装表面，然后置于超净工作台内存放，以维持无菌状态。</li>
<li>通过将40 g葡萄糖加入40 ml去离子培养用水（Sigma）中配制50% D-葡萄糖溶液（SIGMA ultra, G7528）。分装为2 ml等份，于-20°C保存。</li>
<li>将4 ml 50% D-葡萄糖溶液加入500 ml Gey's平衡盐溶液中，使用前在冰箱中冷冻至冰沙状（液体与冰晶混合物）。</li>
<li>用5 ml去离子培养用水溶解鸡血浆（轻柔振荡，避免产生气泡），静置5–10分钟，轻轻旋转混匀，将澄清液体倾入无菌培养皿中。用0.22 μm孔径滤膜（适用于蛋白）对血浆溶液进行无菌过滤，分装为350 μl每管至冻存管（NuncTM），于-20°C保存。</li>
<li>按相同方法重悬牛血浆来源的凝血酶，经0.22 μm孔径滤膜无菌过滤后，分装为40 μl每管至冻存管（NuncTM），于-20°C保存。工作液配制：将40 μl凝血酶溶液加入375 μl含D-葡萄糖的Gey's平衡盐溶液中稀释。</li>
<li>通过混合100 ml马血清、200 ml Eagle基础培养基和100 ml Hank's缓冲盐溶液，并向其中加入4 ml 50%葡萄糖和2 ml 200 mM L-谷氨酰胺，配制400 ml培养基。可分装至100 ml PYREX瓶中，于4°C保存4–8周。</li>
<li>通过混合0.3 mM尿苷、0.3 mM阿糖胞苷（cytosine-β-D-arabinofuranoside）和0.3 mM 5-氟-2'-脱氧尿苷配制有丝分裂抑制剂，经无菌过滤后分装为200 μl每管，于-20°C保存，可稳定保存6–12个月。</li>
</ol>

3. 大脑皮层和腹侧被盖区（VTA）组织解剖（时间：&lt; 1小时）
<ol>
<li>该操作可从大鼠或小鼠获得约 12 套共培养用的皮层和腹侧被盖区（VTA）组织切片，需在超净工作台内无菌条件下进行。组织采集总时间应少于 1 小时。</li>
<li>选取健康、营养状况良好的新生幼鼠（每窝约 10 只；腹部可见“乳斑”），日龄为出生后 1–2 天（PND）。轻轻握住幼鼠鼻部，使其自然悬垂，用锋利剪刀在颈部基部迅速断头。</li>
<li>为取出脑组织，先用剪刀做两条侧向切口以去除头皮，再用精细眼科剪在颅骨上进行一次矢状中线切开和一次在皮层与小脑交界处的冠状切开，翻起四片颅骨瓣。用 sharpened 刮匙在嗅球处做额状切割，并将刮匙向后下方插入脑组织下方，轻柔地将脑组织从颅腔中抬起，使其滑入无菌、预冷的 Gey’s 溶液中以快速降温并临时保存。重复步骤 3.2 至 3.3，共处理另外 2 个脑组织（总时间：<20 分钟）。</li>
<li>为获取 VTA 组织，使用小刮匙将脑组织转移至无菌干燥的培养皿中。通过将每个脑组织轻轻侧向滑动约 1 cm 去除多余液体。使用刀片在小脑水平处做冠状垂直切口，去除脑干。</li>
<li>将琼脂块粘附于切片机载物盘上，以在切片过程中实现脑组织的机械稳定。在载物盘上琼脂块前方几毫米处涂上一条微量超级胶水（注意避免胶水接触琼脂）。</li>
<li>使用小刮匙将每个脑组织转移并固定在载物盘上，前端（额极）朝下。确保额极牢固粘附于载物盘，腹侧面紧贴琼脂，且无胶水残留，以保证切片过程中良好的机械稳定性，并便于切片后顺利剥离。</li>
<li>小心将带有脑组织的载物盘浸入充满无菌预冷 Gey’s 溶液的振动切片机托盘中（例如 Leica VT1000），并固定稳妥。使用经仔细清洁的刀片（用 90% EtOH 处理），在最高振动频率和相对较低前进速度下，以 400–500 μm 厚度切取中脑冠状切片。使用带吸球的倒置巴斯德移液管，将含有 VTA 的切片转移并收集至盛有无菌预冷 Gey’s 溶液的 35 × 10 mm 培养皿中（图 1C；另见参考文献15中 E22 胚胎期冠状切片图谱第 18–20 片）。</li>
<li>为获取皮层切片，重复步骤 3.2–3.6，但在皮层与小脑之间做垂直切口，并将前脑以额极朝上的方向固定。从纹状体水平开始，收集约 3 张冠状切片（厚度 350 μm），用于后续皮层分离。</li>
<li>在体视显微镜下，使用由断裂刀片制成的微型刀具，分离出包含 VTA 的腹侧被盖区及额叶皮层的约 2 mm 宽冠状组织块（图 1C）。将分离的组织切片分别收集于盛有预冷 Gey’s 溶液的小型培养皿（例如腔室载玻片）中。</li>
</ol>
4. 在MEA上安装皮层和VTA组织切片（时间：<1小时）
<ol>
<li>将MEA置于室温下的体视显微镜下，使电极阵列处于焦点中心。居中放置一个 25 μl 将一滴血浆置于洁净、无尘且无菌的电极阵列基质上。使用小型刮铲，小心地将皮层和腹侧被盖区（VTA）切片移入血浆液滴中。</li> 
<li>将MEA置于冷却板上，重新对焦视野，静置冷却约15秒，然后加入 25 μl 将凝血酶加入血浆液滴中。使用凝血酶移液枪头，以轻微的环形动作小心地将血浆/凝血酶混合物均匀铺展在MEA表面。切勿直接接触脆弱的电极阵列。将皮层组织轻柔地放置在阵列上，使其背侧边缘与阵列的第二排电极对齐。这样，发育中的表层结构最终将覆盖阵列的其余部分。VTA置于皮层切片腹侧边缘的邻近位置（图1D）。</li>
<li>盖上MEA腔室盖并轻轻合拢，以保持高湿度，将MEA/培养物组件在室温下的生物安全柜内静置约5分钟，使血浆/凝血酶充分凝固。同时，重复步骤4.1–4.3，再完成另外3组培养物的处理。</li> 
<li>小心地加入 600 μl 使用1 cc注射器配25 × 5/8针头，将培养基以小滴形式加入培养室。</li> 
<li>紧密关闭MEA腔室，并将MEA/培养组件放置于培养箱内的摇床储存托盘上（图1B）。为加快操作流程，可依次重叠组装3–4个MEA。组装12个MEA所需时间应为 &lt;1小时</li>
<li>2 天后 体外 （体外培养天数），加入 10 μl 加入有丝分裂抑制剂。在4 DIV时更换60%的培养基，之后每4天更换一次。</li>
</ol>
5. 电生理记录与刺激生成
<ol>
<li>为了建立局部场电位（LFP）显著偏转与神经元产生动作电位倾向之间的关系，在培养约 ˜1 周后5,6，使用微电极阵列（MEA）的每个电极以 24 kHz 采样率记录约 10 分钟的自发活动（硬件：MEA1060，带消隐电路，放大倍数 x1200，12 位 A/D，范围 0–4096 mV，MultiChannel Systems；软件：MC_Rack）。接地可通过内部接地电极实现，也可通过外接 Ag/AgCl 半电池提供。</li>
<li>使用 1 – 200 Hz 带通滤波器将 LFP 与细胞外锋电位活动（300 – 3,000 Hz 带通）分离。锋电位活动可进一步通过离线锋电位分类器（如 Plexon Inc.）分为单单位和多单位活动。计算每个电极的锋电位触发平均值。对于皮层培养物，大多数平均结果会显示负向 LFP 偏转（nLFP）为神经元放电的偏好时间点。</li>
<li>对每个电极，计算 LFP 轨迹噪声的标准差（SD）的 -3 倍作为阈值（图 2），确定跨越该阈值的 nLFP 的峰值时间和幅度（图 2B, C）。选择一个时间窗 Δt（例如 2 – 8 ms），通过连接所有电极中处于相同或连续时间窗 Δt 内的 nLFP，识别阵列上的时空 nLFP 簇（图 2D；详见2,4,5）。</li>
<li>为了识别神经元雪崩现象，计算每个 nLFP 簇的大小，例如活跃电极数量或 nLFP 幅度之和，构建大小分布直方图，并在双对数坐标系中绘制。对于神经元雪崩，其大小分布遵循幂律，表现为双对数坐标系中近似一条直线2（图 2E,F）。关于幂律的统计检验，参见16。</li>
<li>通过选择一个电极施加电流控制的刺激（强度为 S），在组织中诱发反应（刺激发生器 STG 1008，Multichannel Systems）。为减少电极损伤，采用范围受限、电荷中性的单脉冲双相方波刺激：先以幅度 -S 持续 50 μs，随后以幅度 +S/2 持续 100 μs，S 的范围为 10 – 200 μA。更多细节请参阅设备使用手册。</li>
<li>为记录动态范围9，刺激后以 4 kHz 采样率在所有电极上记录刺激诱发的 LFP 响应，持续至刺激后 500 ms。使用消隐电路（Multi-channel systems），在刺激期间断开头级放大器连接，以减少刺激伪迹并防止前置放大器饱和。</li>
</ol>
6. 代表性结果：
使用新的MEA，大约每10个培养物中可有8至9个存活数周。我们的大多数长期记录均在培养箱内的培养基中进行，从而能够连续数周追踪单个培养物的发育过程5根据我们的实验结果，使用超过100天培养时间的微电极阵列（MEAs）仍可稳定获取局部场电位（LFP）记录。相比之下，细胞外锋电位活动更可靠地通过较新的微电极阵列（MEAs）进行测量&lt;40 天培养）。在典型实验中，我们将MEA从储存托盘（图1B，右）转移至连接有探头的托盘（图1B，左），同时保持培养腔密封。对于皮层5，皮层-腹侧被盖区共培养6，以及在麻醉大鼠中6 以及清醒的猴子 体内 7，浅层神经元在神经元雪崩期间的放电主要发生在局部场电位（LFP）负向偏转峰值附近（nLFP）。因此，可通过测量阵列上空间和时间中nLFP的发生情况，来估计局部同步神经元群的时空组织特性 17. 
MEA 上的活动往往以时间簇的形式出现，即一个电极上的活动伴随着其他位点的活动。在活动期间，局部场电位（LFP）的典型波形如图 2A 所示，通过叠加几个相隔数秒的簇来呈现。对于每个簇，在 1 秒时间窗内可在多个电极上观察到负向场电位偏转。当提取超过多个负标准差阈值的 nLFP 峰时，以 nLFP 峰时间为形式的活动可方便地以点阵图（raster）形式可视化，其中“列”状的点代表在不同电极上几乎同时发生的 nLFP 事件（图 2B）。这种活动在时空上的组织结构相当复杂；在较低时间分辨率下看似较为均一的“列”，在更高时间分辨率下则由多个独立的簇组成，依此类推（图 2C）。事实上，皮层网络中 nLFP 时空簇的出现具有高度组织性。更具体地说，神经元雪崩（neuronal avalanches）的组织具有尺度不变性。这一点可通过计算在给定时间分辨率 Δt 下簇大小的概率来验证。此处，簇由在同一或连续时间 bin 内发生的 nLFP 组成（图 2D）。当簇的大小以每个簇中 nLFP 的总数或每个簇中 nLFP 振幅的积分值表示时，簇大小的分布呈现出幂律关系，其斜率已被证实为 -1.5 2,4,5,7（图 2E,F）。需注意，该分布揭示了一种簇大小的尺度不变性排序，即大小 s 与 k x s 之间的比例关系，其中 k 为常数因子，其比值为 k-1.5，且与 s 无关。这种幂律组织特性与电极阵列的大小 2、时间分辨率 Δt 2 以及用于识别显著 nLFP 偏转的阈值 7 无关。由于 nLFP 振幅与神经元群体大小成正比 7，nLFP 的尺度不变性组织反映了局部同步神经元群体的尺度不变性（即分形）排序，涵盖所有尺度。
<img src="/files/ftp_upload/2949/2949fig1.jpg" alt="静态平衡实验装置示意图 A) 微型培养室组件 B) 密封培养室 C) 脑区示意图 D) 随时间变化的神经网络成像。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 图1. （A）安装了带螺纹玻璃环及对应盖帽的多电极阵列（MEA）的侧视图和顶视图。（B）培养箱内部视图。左侧：头部支架，可在培养箱条件下对单个培养物进行记录；右侧：用于培养多个MEA的托盘。侧面滚轮：由步进电机控制的摇摆装置，用于在培养过程中交替实现浸没与暴露于空气中的阶段。（C）用于皮层-腹侧被盖区（VTA）共培养的大鼠冠状切片示意图。沿虚线切割可获得皮层切片（左）和包含VTA腹侧被盖区（vta；灰色区域）的中脑切片（中、右）。Ctx：皮层；wm：白质；cpu：纹状体；vta：腹侧被盖区；pons：脑桥区域。另见参考文献15对应的冠状切片图谱第8、18和20板。（D）单个皮层-VTA共培养物在MEA上的放置、生长情况及其在培养前9天内（DIV）的发育过程。注意培养物逐渐展平并在阵列表面逐步扩展。反光的组织部分提示细胞退化及组织碎片。健康组织在可见光透射照明下呈不透明灰白色。
<img src="/files/ftp_upload/2949/2949fig2.jpg" alt="雪崩动力学：A) 电极信号。B) 时间序列图。C) 详细输出。D) 大小-时间图。E) 概率分布。F) 大小分析图。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 图 2. 皮层类器官培养物中的神经元雪崩。（A）阵列上三个自发活动时期的叠加图，各时期之间相隔数秒。注意每个活动时期均由阵列上多个电极记录到的负向局部场电位偏转组成（每种颜色代表一个活动时期）。（B）从每个电极提取的负向局部场电位（nLFP）负峰时间点被整合为活动的点阵图。“柱状”结构表示接近同步的活动时期。（C）注意在某一时间尺度下看似高度同步的柱状结构，在更高时间分辨率下实际上由多个柱状结构组成（图中显示了三个时间尺度）。（D）神经元雪崩算法的示意图。在 2 × 2 电极阵列上，识别出超过噪声阈值 –x SD 的负向局部场电位偏转（nLFP）的峰值时间和振幅。nLFP 的时空活动被聚类为连续活跃的时间窗口，窗口宽度为 Δt。簇的大小可通过活跃位点数量（即出现 nLFP 的电极数，s = 4）或 nLFP 振幅的积分总和（s = 130 μV）来确定。寿命以 Δt 的倍数表示。（E, F）簇大小分布中的幂律关系表明这些簇为神经元雪崩。注意，阵列中特定的电极间距 Δd（此处为 200 μm）决定了应观察动力学行为的特定 Δt。更具体地说，当 Δd/Δt 接近网络中平均传播速度时，神经元雪崩的幂律斜率 α 约为 -1.52,4,5。请<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2949/2949largefig2.jpg">点击此处</a>查看图 2 的放大版本。

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</ol>

未声明利益冲突。

1. 技术问题：
<ol>
<li>无菌技术 MEA 的制备及细胞培养的准备工作均在超净工作台内无菌条件下进行。在制备及培养过程中，始终不使用任何会影响神经元活性的抗生素。</li>
<li>MEA上的血浆/凝血酶凝固及组织黏附 在MEA上维持组织存活需要精确平衡血浆/凝血酶凝固所需时间与组织暴露于大气的时间。凝固时间过短可能导致组织切片过早从MEA脱落，而长时间暴露于大气则会引发组织退化。由于凝血酶溶液的浓度决定了凝固过程的速度，因此它是实现组织成功贴附并维持MEA表面健康培养的关键参数。我们使用1000单位（1KU；1 NIH单位 = 0.324 &plusmn; 0.073 mg）。重要的是，血浆/凝血酶溶液混合不充分会导致在培养过程中出现空间上不均一的凝固，从而引发血浆破裂。这些血浆“空洞”会严重损害培养物的健康状态，并使培养物从微电极上脱落，进而影响电生理记录的质量。在MEA/组织组装过程中使用冷却板可减缓凝固速度，有助于血浆/凝血酶溶液的均匀混合，并确保组织切片的准确定位。 
类似地，在凝固仅5分钟后，向培养室中以单滴形式加入培养基以浸没组织，可大幅降低因表面张力导致的组织脱落风险。成功的培养表现为组织在MEA上逐渐变平并轻微扩展，持续数周呈现健康生长状态，且无明显的组织与MEA接触不全或组织退化迹象（例如图1D）。</li> 
<li>组织解剖。 微型刀具极大地改进了我们的解剖流程。我们使用双刃剃须刀片（Fine Science Tools – 可折分手术刀片 – 100050-00），并将其劈开 &tilde;使用镊子制备2 mm宽的“刀片”，并用手术刀柄夹持。利用刀片对冠状切片中的组织样本进行解剖，采用平稳、垂直且有力的移动方式，从而显著减少因牵拉组织而产生的机械应力，整体上改善培养组织的健康状况。</li>
<li>组织冷却。在制备过程中，对切片和组织切片进行适当的冷却对于培养成功至关重要。我们使用定制的冷盘，其由贴附在金属圆盘下方的帕尔帖元件构成。帕尔帖元件产生的热量通过冷水灌注去除。这显著缩短了制备时间，并在制备的各个阶段实现了冷却过程的标准化（Dold Labs） &amp; 工程部。131 Plantation Dr.，美国德克萨斯州塞金，邮编 78155；(830) 560-1471</li> 
<li>培养箱条件 一种定制的培养箱，其内部具有精确的摇动条件，对我们成功在多电极阵列（MEA）上培养脑片至关重要。该培养箱基于Multichannelsystems公司早期自主研发的设计（目前未商业化），其内部摇动装置由连接在两个大型侧轮上的托盘组成。通过步进电机和计算机控制，可实现精确的摇动轨迹（包括摇动角度、摇动速度以及间歇性暂停）。最终，脑片培养物需要在空气与培养基之间进行缓慢交替暴露。传统方法是将脑片培养物置于细长管中，沿其最长轴缓慢旋转。在此方法中，缓慢旋转本身不会产生机械应力，且旋转速度足以实现约5–10分钟一次的最优“供食/呼吸”循环。相比之下，MEA培养室内部结构更为紧凑，其总体积为 &tilde;2 cc，以及组织自身进行培养基预处理所需的少量培养基体积，构成了重大挑战。通过在MEA之间轻轻摇动 &plusmn;&tilde;70&deg; 角度（循环时间： &tilde;200 秒），并在培养物在液相与大气之间转换时减慢摇动速度，且在极端角度暂停摇动以延长对大气的暴露时间，这对培养物的存活至关重要。</li>
</ol>
2. 用于研究神经元雪崩的皮层培养物的发育年龄
大鼠皮层的急性脑片通常取自出生后0至1天（PND 0–1），并在微电极阵列（MEA）上培养数周。早期研究已明确表明，单个皮层脑片培养物在培养数周后 体外，保持具有可识别细胞类型的分层结构，可轻松与之进行比较 体内 细胞类型 18,18-21. 这种分层结构组织 体外 该系统已被方便地用于研究发育过程中丘脑对大脑皮层的神经支配 22-24以及驱动纹状体等皮层下结构 25,26事实上，神经元连接在脑区内部及不同脑区之间的特异性形成，使得复杂神经网络的构建成为可能 体外 能够重建多个精细投射系统的成像技术，例如皮层-基底神经节环路的投射系统 27-30.
体外培养4–6周后，单个皮层切片 31 与纹状体共培养的皮层切片 26 或丘脑 32 表现出典型的自发性上状态和下状态 体内 在乌拉坦麻醉的大鼠中 33这些上状态的精细时间组织具有嵌套特征 &theta;- 和 &gamma;-振荡，提示存在电生理学上成熟的锥体神经元和快速放电的GABA能中间神经元网络 31重要的是，在缺乏多巴胺D2受体刺激的情况下，皮层切片培养中表达小清蛋白的皮层中间神经元的成熟会延迟约2周 34与这些发现一致，嵌套的发育时间进程 &theta;-, &beta;- 和 &gamma;-振荡在与含有投射至皮层的多巴胺能神经元的腹侧被盖区（VTA）共培养时，其活动模式与体内情况相匹配 6.
这些研究表明，在研究神经元雪崩活动时，必须特别注意确保皮层组织的充分成熟，因为神经元雪崩活动高度依赖于成熟的快速GABA能抑制，并且主要位于皮层的浅层2,4。虽然在单层皮层培养中，神经元雪崩可在2至5周的时间内自发出现4，但在需要与体内发育时间进程相匹配的情况下，皮层切片需要适当的多巴胺受体刺激，例如通过将皮层切片与腹侧被盖区（VTA）共培养来实现6。

<table><tbody><tr><td>集成平面多电极阵列</td><td><a href="http://www.multichannelsystems.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Multi Channel System MCS GmbH</a></td><td>&lt;http://www.multichannelsystems.com/products-mea/product-details/products/158/20030ir-ito-wo.html&gt;200/30iR-ITO-w/o&lt;/a&gt;</td><td>硝酸钛（TiN）电极（直径 30 mm）具有较大的表面积，从而产生低阻抗（~1.5 kΩ）。&amp;#937; 在1 kHz时）以及出色的宽带记录（无 -&amp;#8211; 无环状结构</td></tr><tr><td>玻璃培养皿</td><td>www.aceglass.com</td><td>7620-32</td><td>带螺纹的玻璃圆筒</td></tr><tr><td>腔室盖</td><td>www.aceglass.com</td><td>7622-114</td><td>带聚四氟乙烯衬垫的塑料盖</td></tr><tr><td>Sylgard 184 </td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>SYLG184</td><td>双组分硅胶弹性体</td></tr><tr><td>聚-D-赖氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407-5mg</td><td>&amp;#947;- 经辐照、冻干粉末，经细胞培养检测。使用前用 5 ml 去离子水重悬。</td></tr><tr><td>Gey&amp;rsquo;s 平衡盐溶液 </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9779-500mL</td><td>无菌过滤且经培养检测</td></tr><tr><td>鸡血浆 </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3266-5mL</td><td>冻干粉，使用前用 5 ml 去离子水重悬。</td></tr><tr><td>thrombin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6634-1KU</td><td>来自牛血浆，冻干粉形式。</td></tr><tr><td>马血清 </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1138-100mL</td><td>供体畜群，热灭活，经细胞培养检测</td></tr><tr><td>巴斯尔培养基Eagle</td><td>Invitrogen</td><td>21010-046</td><td>1x，500 ml - (+) Earle&amp;rsquo;s 盐，(-) L-谷氨酰胺），</td></tr><tr><td>汉克&amp;rsquo;s 缓冲盐溶液 </td><td>Invitrogen</td><td>24020-117</td><td>500 ml - 含镁，含钙，含酚红</td></tr><tr><td>载玻片培养皿</td><td>Lab-Tek</td><td>177429</td><td></td></tr><tr><td>尿苷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3003</td><td></td></tr><tr><td>阿糖胞苷（cytosine-β-D-阿拉伯呋喃糖苷）&amp;#946;-D-阿拉伯呋喃糖苷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6645</td><td></td></tr><tr><td>5-氟-2&amp;rsquo;-脱氧尿苷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503</td><td></td></tr></tbody></table>

器官型培养中神经元雪崩的多电极阵列记录

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

大脑皮层即使在没有任何特定输入或运动输出的情况下也会自发活动。在发育过程中，这种活动对于皮层细胞类型的迁移和分化以及神经元连接的形成具有重要作用1。在成年动物中，持续的自发活动反映了动物过去和当前的状态，感觉刺激会无缝整合到这一状态中，以计算未来的行动。因此，要理解皮层功能，必须首先清楚地认识持续存在的即自发活动的组织方式。
多种记录技术表明，大脑皮层的持续活动由大量神经元组成，这些神经元的个体活动短暂叠加，形成可在局部场电位（LFP）中通过细胞外微电极检测到的较大事件，也可在脑电图（EEG）、脑磁图（MEG）以及功能磁共振成像（fMRI）的BOLD信号中被观测到。目前，LFP是在介观尺度（数千个神经元）上以高时间和空间分辨率研究神经元群体活动的首选方法。在细胞外微电极处，空间上邻近的神经元局部同步活动会导致LFP出现快速偏转，幅度可达数百微伏。当使用微电极阵列时，可方便地在时间和空间上监测这些偏转的组织模式。
神经元雪崩描述了大脑中持续神经元活动在时空组织上的尺度不变性2,3。它们特异性地分布于皮层的浅层，这一点已得到证实。 体外4,5, 体内 在麻醉大鼠中 6，以及清醒猴7重要的是，理论研究和实证研究2,8-10 表明神经元雪崩现象指示了大脑皮层处于一种精妙平衡的临界状态动力学，该状态可优化信息传递与信息处理。
为了研究神经元雪崩活动的发展、维持和调控机制，体外（in vitro）实验体系具有显著优势，因其可在精确控制的条件下实现对雪崩活动的稳定记录。本实验方案描述了如何利用生长在平面集成微电极阵列（MEA；另见11-14）上的皮层组织切片培养（即切片培养物）中表浅层的发育特性，在体外研究神经元雪崩活动。

研究神经元雪崩（即具有时空尺度不变性的活动爆发）的一种可靠方法，可反映大脑皮层中临界状态动力学特征。在培养的皮层浅层发育过程中，雪崩会自发出现，从而可在精确控制的条件下，利用平面集成多电极阵列（MEA）对神经活动进行长期测量。

大脑皮层即使在没有任何特定输入或运动输出的情况下也具有自发活动。在发育过程中，这种活动对于……

本实验的目的是研究健康脑活动自组织形成神经元雪崩的现象，这是大脑皮层临界状态动力学的标志性特征。通过将冠状切面的分层皮层切片与中脑切片结合，实现这一目标，其中中脑切片为皮层提供发育过程中至关重要的多巴胺能输入。第二步是将皮层-中脑共培养物培养在多电极阵列上，从而可在培养物中对多个位点进行神经元活动的刺激与记录。接下来，在定制设计的培养箱中，我们将共培养体系静置1至2周，使其逐渐铺展、扩展并贴附于MEA表面，培养箱会周期性地使培养物暴露于正常空气和培养环境之间。在此过程中可获得液体培养结果，显示时空局部场电位簇发会自发地自组织形成神经元雪崩。该结论基于MEA记录数据以及离线雪崩分析，后者识别出雪崩规模符合幂律分布。与现有方法（如分离培养）相比，该技术的主要优势在于其系统神经科学的特性。我们可以将多个脑区共同培养，这些多区域培养物在大尺度上（如皮层分层和投射系统）建立了正确的脑组织结构。该技术的应用不仅限于神经元雪崩的研究。例如，我们可以在精确控制的体外条件下，在网络水平上研究刺激与响应的关系。该方法的可视化演示至关重要，因为正确应用血浆凝血酶混合物以及将组织放置在多电极阵列（MEA）上的操作难以掌握。这些步骤需要准确把握时机、合适的温度梯度，并避免直接接触精密的MEA表面。为记录准备无菌可密封玻璃室时，首先用带聚四氟乙烯（Teflon）塑料盖的螺纹玻璃圆筒，在螺纹底部上方约两毫米处切割。这些部件用于确保培养室能够牢固且紧密地封闭。然后通过用水冲洗玻璃环三次，再在纯度为200 proof的乙醇中煮沸五分钟，以清洁玻璃环。将这些部件放置一旁晾干。需要使用硅溶液将玻璃环固定在MEA表面。采用Cell Guard 180 4硅弹性体试剂盒，充分混合15毫升的A组分和B组分，然后静置15分钟以去除气泡。将溶液分装为每份1毫升，置于Eloqua中，并在-20摄氏度下保存以备后续使用。现在，用注射器吸取1毫升硅胶，注射器需装配细规格针头，并在23摄氏度条件下将其涂布于玻璃环的未抛光切割表面，从而将玻璃环粘附至MEA上。然后将玻璃环居中放置于MEA上，并在玻璃环外周再涂布一层硅胶，以增强密封性。将此物在约60摄氏度的加热板上静置固化1至2小时。接着，在超净工作台中对MEA腔室及腔室盖进行灭菌处理：先用去离子水冲洗三次，再用70%酒精冲洗三次，最后一次冲洗使用酒精。让腔室在酒精中静置10分钟。随后将培养室和盖子内部暴露于紫外光下照射10分钟。在120摄氏度下高压灭菌45分钟。灭菌完成后，让其自然干燥。现在用多聚赖氨酸（poly D lysine）包被培养室内的MEA表面。本实验所用的新MEA具有较强的疏水性，因此需通过反复滴加液滴的方式进行包被。从电极网格中吸出溶液。将盖子盖紧，以密封MEA培养皿，便于储存和后续使用。该操作可获得约12份共培养所需的皮层和腹侧被盖区（VTA）组织，应在超净台内无菌条件下进行，并使用出生后1至2天健康动物，整个组织采集过程总时长应少于1小时。断头后，首先用剪刀在两侧做横向剪切，去除头颅皮肤，开始脑组织的取出。使用精细的眼科剪去除颅骨并剪开，沿矢状中线做一纵切，并在大脑皮层与小脑交界处做一冠状切口。将这四片颅骨瓣翻折，以暴露脑组织。接着用锋利的解剖刀片经嗅球处行额状切开。然后将解剖刀从脑组织下方每隔四分之一周推进一次。轻柔地将脑组织从颅骨中取出，并使其滑入预冷的保存液中，以实现快速冷却和临时储存。对另外两个大脑重复上述步骤。为获取腹侧被盖区（VTA）组织，将大脑转移至无菌干燥的培养皿中。使用小刮勺，轻轻将每个大脑横向滑动约一厘米，以去除多余的液体。然后使用刀片在小脑水平处进行冠状垂直切割，以去除脑干。现在将琼脂块粘接到切片固定盘上，以便在切片过程中对脑组织进行机械固定。接着，在固定盘上的琼脂块前方几毫米处涂抹一条薄薄的超级胶水，使用小刮刀操作时应避免胶水接触到琼脂块。将每个脑组织的额极朝下转移并固定。确保额极被粘附在固定盘上，且腹侧接触琼脂，无任何胶水残留。这可保证切片过程中良好的机械稳定性，并便于切片后轻松拾取切片。接下来，将固定好脑组织的安装盘小心浸入盛有冷 gaze 溶液的振动切片机托盘中并固定。然后使用经过仔细清洁的刀片，在最高振动频率和相对较低前进速度的条件下，切出中脑400微米厚的冠状切片，并用带有吸球的倒置巴氏移液管收集包含腹侧被盖区（VTA）的切片，转移至盛有无菌冷 gaze 溶液的35 mm × 10 mm培养皿中，用于皮层切片。重复前述切片步骤，但在大脑皮层与小脑之间进行一次垂直切割，并将四个脑组织以额极朝上的方向安装。从纹状体水平开始，获取约三片厚度为350微米的冠状切片。现在使用由剃须刀片断裂制成的微型刀具，在体视显微镜下分离出宽度约为2毫米、包含腹侧被盖区（VTA）的额叶皮层和中脑区域的冠状切片。将组织切片分别收集于盛有冷置格氏溶液的小培养皿中。开始在MEA腔室中固定组织时，首先将MEA置于室温下的体视显微镜下，并调焦至电极阵列清晰可见的位置。随后，在洁净、无尘且无菌的电极阵列基质上，居中滴加25微升血浆。使用小刮铲小心地将皮层和腹侧被盖区（VTA）切片移入血浆液滴中。现在将MEA放置在冷却板上并重新对焦视野。静置约15秒使其冷却，然后向血浆液滴中加入25微升凝血酶。接着使用凝血酶移液枪头，以轻微的环形动作小心地将血浆与凝血酶混合物均匀涂布于MEA表面。注意不要直接触碰脆弱的电极阵列。接下来，将大脑皮层轻轻放置在阵列上，使背侧边缘对准阵列的第二电极行。这样，发育中的表层最终将覆盖阵列的其余部分。然后将VTA放置在皮层切片腹侧边缘附近。现在盖上MEA腔室盖，松散封闭以保持高湿度。将MEA培养装置置于室温下的超净台内静置约六分钟，以使血浆凝血酶发挥作用，完成凝固和凝集过程。同时，重复上述步骤以制备另外三个培养物。接下来，使用带有25号五分之八英寸针头的1毫升注射器，将600微升培养基以小液滴形式小心地加入到培养室中。然后紧密关闭MEA室，并将MEA培养组件放置于培养箱内摇动储存托盘上。体外培养两天后，加入10微升有丝分裂抑制剂。随后在体外培养第四天及此后每隔四天，更换60%的培养基。在正常生长过程中，培养物会明显变扁平，并略微向背侧扩展。由于表层皮质层的发育，健康的培养物在明场下表现为不透明的灰白色组织。相反，明亮且有反射性的囊泡是培养物制备后约10至12天时死亡退化细胞的特征，此时培养物已准备好进行记录和刺激。开始记录前，需将MEA从储存托盘转移至记录头阶段。记录局部场电位（LFP）时，使用1至200赫兹的带通滤波器。多单元活动也可通过300至3000赫兹的带通滤波器进行研究。健康的自发性活动通常以大小和持续时间各异的簇状放电形式出现。为了研究局部场电位（LFP）与单个神经元放电活动之间的关系，我们可以计算LFP的触发平均尖峰。对于这些皮层培养物，负向LFP偏转与神经元放电相关，可用于记录刺激诱发的活动。首先，通过控制刺激发生器的软件设定刺激的时间波形和幅度。一种有效的刺激范式是采用电流控制、电荷中性、单次冲击的双相方波。接下来，选择将用于传递刺激的电极。典型的刺激诱发的局部场电位（LFP）反应与自发性活动爆发相似。屏蔽电路在刺激期间断开放大器连接，以减少刺激伪迹并防止放大器饱和。刺激电极需要数秒时间从刺激中恢复，因此无法用于记录响应活动。在多电极阵列（MEA）上，神经活动往往以时空簇的形式出现，表现为某一电极处的活动常伴随其他位点的同步活动。与此同时，通过叠加显示相隔数秒出现的三个簇，展示了此类活动期间局部场电位（LFP）的典型波形。当提取超过多个负标准差阈值的负LFP（NLFP）峰时，可在一秒钟时间窗内观察到多个电极上的负LFP偏转；以NLFP峰时间为形式的活动可方便地用Rasta图进行可视化展示，其中点的列代表不同电极上近似同时发生的负峰事件（NPS）。该活动在时空上的组织模式相当复杂。在较低时间分辨率下看似均匀的柱状结构，在较高时间分辨率下则由多个独立的簇组成，依此类推。空间、地理时间（GEOTEMPORAL）和局部场电位（LFP）簇在皮层网络中的出现具有高度组织性。更具体而言，神经元雪崩的组织具有尺度不变性。通过计算在给定时间分辨率 Delta T 下的簇大小概率，可以证明这一点。此处的簇由发生在相同或连续时间区间内的 NLFP 构成。当簇的大小以每簇总 NFPS 数量或每簇整合的 NLFP 振幅表示时，簇大小分布呈现出接近 -1.5 指数的幂律关系。观看本视频后，您应能够充分理解如何精细地解剖脑组织，并在多电极阵列上培养神经元，以研究神经元活动的自组织特性。这些方法还被用于研究皮层网络中自发活动与刺激诱发活动之间的关系。

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神经科学

器官型培养的神经元雪崩多电极阵列记录

多电极阵列（MEA）记录技术为研究大量神经元群体的电活动提供了一种方法。本文中，我们介绍了在同时刺激组织的条件下，从小鼠副嗅上皮进行记录的多电极阵列制备的详细步骤。...

犁鼻上皮的多电极阵列记录

植入有序排列的微丝阵列用于单细胞电生理记录面临诸多技术挑战。 本文描述了实施该技术的方法及所需设备。 此外，还讨论了利用有序微丝阵列以高空间选择性记录不同神经亚区活动的优势。...

一种用于在清醒行为动物中植入有序排列的微丝电极阵列以进行单细胞记录的操作流程

本文详细介绍了如何对人类癫痫皮层组织进行多电极阵列记录。具体演示了癫痫组织切除、脑片制备以及间歇期和发作期事件的多电极阵列记录过程。...

人脑癫痫术后皮层组织的多电极阵列记录

本文介绍了一种基于脊髓切片在多电极阵列上培养的方案，用于研究脊髓固有连接的功能性再生 体外.

在多电极阵列上培养的脊髓组织共培养物中研究功能再生

我们介绍一种在多电极阵列上培养原代小鼠螺旋神经节神经元外植体的方案，用于研究神经元的反应特性并优化刺激参数。此类研究旨在改善人工耳蜗植入体的神经元-电极界面，从而提高患者的听力效果，并降低设备的能量消耗。...

螺旋神经节神经元外植体培养及多电极阵列电生理记录

我们展示了如何利用微电极阵列在啮齿类动物脑片上记录并进行电调控由4-氨基吡啶诱导的癫痫样活动。定制的记录室可在长时间的实验过程中维持组织的活性。通过定制的图形用户界面实现电极的实时映射以及刺激电对的选择。...

使用微电极阵列记录和调控啮齿类动物脑片中的癫痫样活动

本方案描述了一种用于在小鼠（Mus musculus）和雪貂（Mustela putorius...

用于急性和慢性在体记录的碳纤维微电极阵列的构建与实施

本文概述了联合使用微电极阵列技术和4-氨基吡啶诱导的化学刺激方法，用于研究脊髓背角网络水平的伤害性感受活动。...

使用微电极阵列记录脊髓伤害性感觉回路中的网络活动

在此，我们采用高密度微电极阵列（HD-MEA）深入研究大规模神经元群集的计算动力学，特别是在海马体、嗅球环路以及人类神经元网络中的应用。通过捕捉时空电活动并结合计算工具，可深入了解神经元群集的复杂性。该方法有助于增进对脑功能的理解，并有望为神经系统疾病发现生物标志物和治疗方法。...

在CMOS集成高密度微电极阵列上记录与分析多模态大规模神经元集群动态

本文概述了一种使用互补金属氧化物半导体高密度微电极阵列系统（CMOS-HD-MEAs）的实验方案 记录类似癫痫发作的活动 离体...

使用互补金属氧化物半导体高密度微电极阵列系统从急性脑片中获取高质量的类癫痫样活动

本方案旨在将背腹侧融合类脑器官稳定接种于多电极阵列上，用于癫痫建模 体外.

一种用于癫痫建模的多电极阵列平台：基于人多能干细胞衍生脑类组装体

学习利用多电极阵列记录皮层与中脑共培养体系的神经元雪崩活动，研究临界态动力学特征。该技术可在体外精确控制条件下研究神经网络水平的自发活动自组织行为及其时空特性。

器官型培养中神经元雪崩的多电极阵列记录

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