器官型培养的神经元雪崩多电极阵列记录

本实验的目的是研究健康大脑活动自组织成神经元雪崩，这是皮层临界状态动力学的标志。这是通过将冠状分层皮层切片与中脑切片相结合来实现的，中脑切片为皮层提供发育中重要的多巴胺能输入。作为第二步，Cortex 中脑共培养物在多电极阵列上生长，这允许多位点刺激和记录培养物中的神经元活动。

接下来，我们在定制设计的培养箱中让共培养物在最初的一到两周内变平、膨胀并附着在 MEA 表面，该培养箱通过暴露于正常空气和培养物来循环培养物。获得的流体结果表明，时空局部场电位爆发为神经元雪崩的自发自组织。基于 MEA 记录和离线雪崩分析，确定雪崩大小的幂律。

与现有方法（例如 dis associated cultures）相比，该技术的主要优点是其系统、神经科学方面。我们可以将许多大脑区域共培养在一起，这些多区域培养建立了一个在大尺度上正确的大脑组织，例如皮层和投射系统。这项技术的应用不仅限于神经元雪崩的研究。

例如，我们可以在精确控制的体外条件下研究网络水平的响应刺激。这种方法的视觉演示至关重要，因为很难学习正确应用血浆凝血酶混合物和将组织定位在 MEA 上。这些步骤需要适当的时间、正确的温度梯度，并避免直接接触精致的 MEA 表面。

为了准备用于记录的无菌可密封玻璃腔室，首先用特氟龙塑料帽切割螺纹玻璃圆柱体，距离螺纹底部约 2 毫米。这些是安全、紧密地封闭培养室所必需的。然后用水冲洗 3 次，然后在 200 度乙醇中煮沸 5 分钟，以清洁玻璃环。

将这些放在一边干燥，需要硅溶液将玻璃环连接到 MEA 表面。使用 Cell Guard 180 4 硅弹性体套件，充分混合 15 毫升 A 组分和 B 组分。然后让我们静置 15 分钟以去除气泡。

将溶液分成 1 毫升 Eloqua，并在零下 20 摄氏度下储存以备将来使用。现在，用小规格针头在 23 摄氏度的注射器中吸取 1 毫升硅，然后将其涂抹在玻璃环的未抛光切割面上，将玻璃环粘合到 MEA 上。然后将玻璃环置于 MEA 的中心，并在环的外部应用额外的硅层，以实现更强的密封。

让它在大约 60 摄氏度的热板上固化 1 到 2 小时。接下来，在层流罩下对 MEA 腔室和腔室盖进行消毒，在去离子水中冲洗 3 次，最后一次用 70% 酒精冲洗 3 次。让腔室在酒精中静置 10 分钟。

然后将腔室和瓶盖内部暴露在紫外线下 10 分钟。在 120 摄氏度下高压灭菌 45 分钟。消毒后，让它们干燥。

现在用聚 D 赖氨酸包被培养室内的 MEA 表面。本实验中使用的新 meas 具有相当亲脂性，因此被重复的液滴包覆。从电极网格中吸出溶液。

盖上盖子以密封 MEA 腔室，以便储存和将来使用。该程序产生大约 12 次共培养的皮质和 VTA 切片，并且应该在无菌条件下使用出生后一到两天健康的动物在层流罩内进行，组织收集的总时间应少于一小时。斩首后，首先进行两次横向剪刀式切割，以去除头皮上的皮肤，从而开始去除大脑。

取出，然后用细眼剪刀将颅骨切开，在小脑皮质交界处的一个冠状切口上切开一个矢状中线。将这四个颅骨皮瓣向后翻转，露出大脑。接下来用锋利的抹刀，正面切开嗅球。

然后将刮刀每季度推进到大脑下方。轻轻地将大脑从头骨中抬起，让它滑入冰冷的凝视中。快速冷却和临时存储的解决方案。

对另外两个大脑重复上述过程。为了获得 VTA 组织，将大脑转移到无菌干燥培养皿上。使用小刮刀轻轻地将每个大脑向侧面滑动约 1 厘米，以去除多余的液体。

然后使用剃须刀片在小脑水平进行冠状垂直切割，去除脑干。现在将琼脂块粘在安装盘上，以便在切片过程中对大脑进行机械稳定。然后在圆盘上琼脂块前几毫米处放置一条细线强力胶，但避免使用小刮刀让胶水接触琼脂。

将每个大脑额杆向下转移并安装。确保前杆粘在安装盘上，并且腹侧接触琼脂且没有任何胶水残留。这确保了在切割过程中适当的机械稳定性和轻松抬起切割的切片。

接下来，小心地将装有大脑的安装盘浸入并固定在装满冰镇凝视溶液的振动盘中。然后，使用带吸球的倒置意大利面移液器，以最高振动频率和相对较低的前进速度，用仔细清洁的剃须刀刀片切割 400 微米厚的中脑冠状切片，收集并转移含有 VTA 的切片，并将其转移到 35 x 10 毫米的培养皿中，培养皿中装满了用于皮质切片的无菌冷冻凝视溶液。重复前面的切片步骤，但在皮层和小脑之间应用垂直切口，并在额杆向上的情况下安装四个大脑。

从纹状体水平开始收集大约三个 350 微米厚的冠状切片。现在使用由破损的剃须刀片制成的微型刀，在立体显微镜下解剖包含VTA的额叶皮层和中脑区域的约两毫米宽的冠状切片。将组织切片分别收集在装满冷冻凝视溶液的小盘中。

为了开始将组织安装在 MEA 腔室的第一个位置，在室温下在立体显微镜下将 MEA 聚焦电极阵列。然后将 25 微升血浆液滴集中在干净、无尘和无菌的电极阵列矩阵上。使用小刮刀小心地将皮质和 VTA 切片滑入血浆液滴中。

现在，将 MEA 放在冷却板上并重新聚焦视图。让它冷却约 15 秒，然后将 25 μL 凝血酶加入血浆液滴中。然后使用凝血酶移液器吸头，小心地将血浆凝血酶混合物以小圆周运动涂抹在 MEA 上。

小心不要直接触摸脆性电极阵列。接下来，轻轻地将皮层放在阵列上，其背缘沿着阵列的第二电极行。这样，显影的表层最终将覆盖阵列的其余部分。

然后将 VTA 放置在皮层截面的腹侧边界附近。现在盖上并松散地关闭 MEA 腔室以保持高湿度。让 MEA 培养组件在室温下在通风橱内静置约 6 分钟，以允许血浆凝血酶、凝固、兴高

同时，重复该过程以准备另外三种培养物。接下来，使用带有 25 x 5 八分之一号针头的 1 cc 注射器，小心地将 600 微升培养基以小液滴添加到培养室中。然后紧紧关闭 MEA 室，将 MEA 培养组件放在培养箱内的摇动储存托盘上。

两天后，在体外加入 10 μL 有丝分裂抑制剂。然后在体外 4 天将培养基刷新 60%，此后每 4 天刷新一次。在正常生长过程中，培养物将大幅变平并向背侧略微扩张。

由于浅表皮质层的发育，健康的培养物通过其明场中不透明的灰色组织来识别。相反，明亮的反射囊泡是死亡退行性细胞的特征，在制备培养物后约 10 到 12 天，它们已准备好进行记录和刺激。要开始录制会话，MEA 将从存储托盘传输到录制头载物台。

要记录局部场电位或 LFP，请使用 1 到 200 赫兹的带通滤波器。也可以使用 300 至 3000 赫兹的带通滤波器来研究多单位活性。健康的自发活动往往以不同大小和持续时间的爆发形式发生。

为了研究 LFP 和单位活性之间的关系，我们可以计算 LFP 的尖峰触发平均值。对于这些皮层培养物，负 LFP 偏转与神经元尖峰相关，以记录刺激诱发的活动。首先，使用控制刺激发生器的软件指定刺激的时间波形和振幅。

一个有用的刺激范例是具有双极方波的电流控制电荷中性单电击。接下来，选择一个电极，该电极将用于传递刺激。典型的刺激诱发的 LFP 反应似乎类似于自发活动爆发。

消隐电路在刺激期间断开放大器，以减少刺激伪影并防止放大器饱和。刺激电极需要几秒钟才能从刺激中恢复，因此不能用于记录反应活动。在 MEA 上，它往往以时空簇的形式出现，在一个电极上有活动，通常伴随着其他位点的活动。

同时，通过叠加绘制每个簇相隔几秒钟出现的三个簇，这里显示了 LFP 在此类活动期间的典型波形。当提取超过多个负 SD 阈值的 NLFP 峰时，可以在一秒的窗口内在几个电极上看到负 LFP 偏转，NLFP 峰时间形式的活动可以在 Rasta 中方便地可视化，其中点列表示各种电极上几乎重合的 NPS。这种活动的时空组织相当复杂。

在低时间分辨率下看起来或多或少齐齐的列由较高时间分辨率的单独集群组成，依此类推。空间、GEOTEMPORAL 和 LFP 集群的出现在皮层网络中是高度组织的。更具体地说，该组织是神经元雪崩的规模变体。

这可以通过计算给定时间分辨率下集群大小的概率来证明。Delta T.Here 集群由出现在相同或连续时间区间中的 NL FPS 组成，当此类集群的大小表示为每个集群的 NFPS 总数或每个集群的集成 NLFP 振幅时，集群大小分布揭示了指数接近负 1.5 的幂律。观看本视频后，您应该对如何仔细解剖脑组织和在多电极阵列上培养培养物以研究神经元活动的自组织有很好的了解。

这些方法也被用于研究皮层网络中自发活动和刺激诱发活动之间的关系。