间皮清除率测定:一种定量卵巢癌球体侵袭间皮细胞单层能力的体外技术

卵巢癌转移过程中，恶性细胞从原发肿瘤部位分离并开始在腹膜腔内循环。然后，这些细胞可以形成簇或球体，粘附在腹膜腔内衬的间皮细胞单层上。随着肿瘤的生长，它会清除下面的间皮细胞以促进侵袭。

要模拟间皮清除率，首先将表达绿色荧光蛋白或GFP的间皮细胞接种到纤连蛋白涂层的玻璃底培养皿中。纤连蛋白涂层提供了促进细胞附着的基质。孵育培养皿，让间皮细胞扩散并形成单层。

接下来，将表达红色荧光蛋白的卵巢癌细胞球体悬浮液转移到间皮单层上。使用延时荧光显微镜对培养物进行长时间成像。红色荧光球体将沉降并附着在绿色荧光间皮单层上。

癌细胞对间皮细胞施加力，破坏细胞连接并改变间皮层的完整性。该力还会移位下面的间皮细胞，从而产生一个孔。选择适当的 GFP 滤波器设置，将生成的孔可视化为图像中的黑色空间。测量空间以量化间皮清除范围。

要开始此过程，请用纤连蛋白预涂 6 孔玻璃底 MatTek 培养皿的孔。将 2 毫升纤连蛋白/PBS 溶液加入培养皿的每个孔中，并在室温下孵育 30 分钟。在10%基础培养基中培养表达绿色荧光蛋白的间皮细胞，以形成间皮细胞单层。胰蛋白酶消化一盘间皮细胞，并在台式离心机中以 900 RPM 旋转三分钟。

吸出上清液并将细胞重悬于 10% 基础培养基中。用 10% 基础培养基调节至所需浓度。当MatTek培养皿的30分钟纤连蛋白孵育完成后，用2毫升PBS洗涤孔。在6孔MatTek培养皿的每个孔中，吸出PBS并接种6次10到每孔的第五个间皮细胞。将 MatTek 培养皿在 37 摄氏度的细胞培养箱中孵育过夜，使间皮细胞附着在培养皿上并形成单层。

使用移液器从 96 孔聚 HEMA 涂层板中收集卵巢癌球体。从含有间皮细胞单层的 6 孔 MatTek 培养皿的一个孔中吸出培养基。用 2 毫升 PBS 洗涤一次。将 96 孔板中的所有球体添加到 MatTek 培养皿的一个孔中。这大约是将要成像的球体数量的三倍，以解释球体落在碟形盘上无法成像的部分。

由于我们只想在每个视场对一个球体进行成像，因此必须避免球体的聚集。轻轻地左右摇晃盘子，使球体在附着之前均匀分布在单层上。

MatTek 培养皿放在能够进行延时成像至少 8 小时的倒置宽视场荧光显微镜的载物台上。在单个实验中使用电动载物台对培养皿中的多个位置进行成像，并具有多个球体插层事件。卵巢癌细胞球体将沉降到培养皿底部并附着在间皮细胞单层上。每十分钟收集一次 20 多种球体/单层相互作用的 GFP、RFP 和相位图像，持续 8 小时。