间皮清除实验：一种体外定量评估卵巢癌球体侵袭间皮细胞单层能力的技术

在卵巢癌转移过程中，恶性细胞从原发肿瘤部位脱落，并开始在腹腔内循环。这些细胞可形成簇状或球状结构，附着于腹腔内壁的间皮细胞单层。随着肿瘤的生长，其会清除下方的间皮细胞，从而促进侵袭。

为了模拟间皮细胞的清除过程，首先将表达绿色荧光蛋白（GFP）的间皮细胞接种至经纤连蛋白包被的玻璃底培养皿中。纤连蛋白包被可提供促进细胞贴附的基质。将培养皿置于培养箱中孵育，使间皮细胞充分铺展并形成单层细胞。

接下来，将表达红色荧光蛋白的卵巢癌细胞球状体悬液转移至间皮单层细胞上。使用延时荧光显微镜对培养物进行长时间成像。红色荧光的球状体会沉降并附着于绿色荧光的间皮单层细胞上。

癌细胞对间皮细胞施加力，破坏细胞连接并改变间皮层的完整性。该作用力还会使下方的间皮细胞发生移位，形成一个孔洞。选择合适的GFP滤光片设置，以在图像中将形成的孔洞显示为黑色区域。测量该区域以量化间皮清除的程度。

开始此操作时，先用纤维连接蛋白预包被6孔玻璃底MatTek培养皿的各孔。向培养皿的每个孔中加入2毫升纤维连接蛋白/PBS溶液，在室温下孵育30分钟。用于形成间皮细胞单层的表达绿色荧光蛋白的间皮细胞在10%基础培养基中培养。用胰蛋白酶消化一板间皮细胞，然后在台式离心机中以900 RPM离心3分钟。

吸去上清液，并用10%基础培养基重悬细胞。用10%基础培养基调整至所需浓度。当MatTek培养皿中纤连蛋白孵育30分钟结束后，用2毫升PBS洗涤各孔。吸去PBS，每孔接种6 × 10⁵个间皮细胞至6孔MatTek培养皿的每个孔中。将MatTek培养皿置于37°C细胞培养箱中过夜孵育，以使间皮细胞贴壁并形成单层。

使用移液器从96孔聚羟基乙酸（poly-HEMA）包被的培养板中收集卵巢癌球状体。吸取6孔MatTek培养皿中一个孔内的间皮细胞单层培养基。用2毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤一次。将96孔板中的所有球状体加入MatTek培养皿的一个孔中。此数量约为成像所需球状体数量的三倍，以弥补部分球状体可能落在无法成像区域的情况。

由于我们希望每个视野中仅成像一个球状体，因此必须避免球状体发生聚集。在球状体贴附之前，轻轻左右摇动培养皿，使其在单层细胞上均匀分布。

将 MatTek 培养皿置于倒置宽场荧光显微镜的载物台上，该显微镜需能够连续进行至少八小时的时间序列成像。使用电动载物台，在单次实验中对培养皿内的多个位置进行成像，以捕获多个类球体嵌入事件。卵巢癌细胞类球体将沉降至培养皿底部，并附着于间皮细胞单层上。每十分钟采集一次 GFP、RFP 和相差图像，持续八小时，记录 20 个及以上类球体与单层细胞相互作用的过程。