基于抗体偶联纳米颗粒与暗场显微镜的定量方法：一种从体液中捕获并定量特定外泌体的实验流程

外泌体是由细胞分泌到细胞外空间的小型膜包被结构。外泌体在生物体液中大量存在。

为了从体液中识别并捕获特定的外泌体，首先取一个多孔免疫测定载玻片。该载玻片经过功能化处理，表面修饰有作为抗原的蛋白质，可与特异性抗体结合。 

加入所需的初级抗体溶液并进行孵育。这些抗体将结合到载玻片表面预先包被的抗原上。

吸去剩余溶液，以去除未结合的抗体。然后加入封闭缓冲液，封闭游离抗原位点，从而防止外泌体的非特异性结合。

然后，移除封闭缓冲液，将含有外泌体的血清悬液加到载玻片上，并进行孵育。这可使特异性靶向外泌体与捕获的初级抗体发生专一性结合。

接下来，将金纳米颗粒偶联的二抗悬液加样至载玻片表面。这些二抗会结合已预先固定的外泌体，形成检测复合物。

最后，使用移液器弃去未结合的二抗。在暗场显微镜下观察载玻片。存在于外泌体表面的金纳米颗粒会散射光线，在暗背景下呈现为明亮的光点。

开始制备载玻片时，将所需的外泌体捕获抗体用 PBS 稀释至 0.025 毫克/毫升。将 1 微升该溶液加入经蛋白 A/G 处理并带有光学级玻璃背衬的载玻片的每个孔中。然后，将载玻片转移至湿化盒中，以确保孵育过程中孔内液体不会干燥。

将载玻片在 37 摄氏度孵育 1 小时，以固定捕获抗体。然后吸除残留溶液，去除未结合的抗体。用 PBS 洗涤各孔，每次加入并吸除 1 微升 PBS，重复三次。接着，迅速向每个孔中加入 1 微升基于 PBS 的封闭缓冲液，并将载玻片在 37 摄氏度孵育 2 小时。

当处理约15个样品时，我们必须使用单通道移液器在5分钟内将工作缓冲液加入120个孔中，以避免封闭剂蒸发。

在载玻片封闭的同时开始制备抗体偶联的金纳米棒溶液。封闭结束前约30分钟，将血浆或血清样本在室温水浴中快速解冻。解冻后的样本涡旋振荡30秒，以确保悬浮液均匀。随后，以500 × g 离心15分钟，沉淀蛋白质聚集体及其他碎片。

取10 µL上清液等分试样转移至新的离心管中，并用PBS进行1:1稀释。根据需要，通过轻柔涡旋或颠倒混匀稀释后的样品。当载玻片封闭步骤完成后，吸除封闭缓冲液，并用PBS分三次洗涤各孔，每次1 µL。立即向各孔中加入样品，每孔1 µL，每个样品设8个重复孔。

以相同方式将外泌体标准品加入相应的孔中。将芯片置于4摄氏度冰箱中孵育12至18小时。随后吸除各孔中的液体，并用1微升PBS缓冲液洗涤每个孔一次。向每个孔中加入1微升抗体偶联的金纳米棒悬浮液，于37摄氏度孵育2小时。

随后，吸除纳米棒悬浮液，并在含有0.01%吐温-20的磷酸盐缓冲液中用混匀器清洗载玻片10分钟。然后，吸去孔内液体，再将载玻片置于去离子水中，在旋转混匀器上清洗10分钟。去除水分后，将载玻片置于洁净的培养皿中自然晾干，随后将载玻片转移至暗场显微镜下观察。