使用单纳米粒子暗场显微镜可视化细胞膜上金纳米棒的扩散动力学
March 5th, 2021
在这里，我们展示了使用传统的暗场显微镜来监测金纳米棒（AuNR）在细胞膜上的动态。使用 ImageJ 和 MATLAB 检测单个 AuNR 的位置和方向，AuNR 的扩散状态以单个粒子跟踪分析为特征。
我们的协议使用单个粒子检查分析来监测位置和方向的动态，并描述金纳米棒在细胞膜上的扩散。利用这种方法，可以获取金纳米棒的转化和旋转动力学，并综合分析和呈现金纳米棒的动态。该协议有可能用于研究其他类型的复杂生物系统。
首先在火焰上燃烧乙醇浸玻璃盖片，将盖片放入一个35至10毫米的细胞培养皿中，其中含有两毫升细胞培养介质，不含苯酚红色。在盖片上加入50微升的细胞悬浮液，轻轻摇动盘来回，左右均匀分布细胞。将菜放入细胞培养孵化器约12小时，直到细胞达到20%至40%的结合度，然后再在培养皿中加入20微升CTAB涂层金纳米棒。
轻轻摇晃后，将纳米棒均匀地分散在盘子上，将菜放在潮湿的氛围中五分钟。在孵化结束时，缓慢地将100微升的超纳坦从盘子中转移到玻璃滑梯的凹槽中，并小心地将盖片细胞侧向下放置到滑动槽上，然后用指甲油密封盖片的边缘，让指甲油干燥，然后将滑梯放到暗场显微镜阶段。对于通过暗地显微镜跟踪的单个粒子，将一滴油放在油浸入暗场冷凝器上，然后转动旋钮，直到冷凝器接触玻璃滑动。
将一滴油放在盖玻璃顶部，转动对焦旋钮，直到 60 倍的油浸入目标接触油。打开光源，稍微打开对焦旋钮以聚焦成像平面。然后单击显微镜软件中的相机图标，使用彩色 CMOS 相机记录样品散射光图像时间系列，并以 TIFF 格式保存图像。
要提取单个长期轨迹，请打开 ImageJ 中的图像，然后单击图像、类型和 8 位，将图像从 RGB 模式转换为 8 位模式。要调整对比度，请单击图像、调整亮度对比度并设置参数。选择目标粒子并使用控制 X 切断时间串背景。
单击插件、粒子跟踪器经典和粒子跟踪器以打开粒子检测和粒子链接窗口，并将半径设置为 6，截止到零，百分位数设置为 0.01%， 将链接范围设置为 10，位移为 10，然后单击 OK 打开粒子跟踪器结果窗口以查看结果。单击可视化所有轨迹以检查生成的轨迹。如果软件生成的轨迹与金纳米棒的移动轨迹匹配，单击"保存完整报告"以保存结果。
如果软件生成的轨迹与金纳米棒的移动轨迹不匹配，请单击重新链接粒子，将检测到的粒子与不同的链接范围和百分位数参数重新链接。要根据 XY 坐标在每帧中查找金纳米棒的中心像素坐标，请使用 xy 协调。m函数。
要划定三乘三像素矩阵，请提取红色或绿色通道的九个散射强度值并计算平均值，使用 rgextraction。m函数。然后使用极地角。
m 函数使用双通道差分法计算极角。要使用表中的公式计算动态参数，运行两个分析脚本。要对轨迹进行视觉分析，请将 X 坐标设置为 X，Y 坐标为 Y，时间设置为 Y，然后单击绘图、散射和颜色图，设置图形参数，并添加颜色条。
要生成均值方位移时间间隔图，请将时间间隔设置为 X，将平均方位移设置为 Y.Click 绘图、散射、分析、拟合、非线性曲线拟合和打开对话，并设置图形参数。对于多粒子统计分析，将感兴趣的动态参数设置为 Y，然后单击绘图和直方图。双击直方图以设置除法大小或分区数，然后单击应用。
然后添加一个列并设置图形参数。对于时间系列分析，将时间设置为 X，将时间系列参数设置为 Y.Click 绘图、多窗格和堆叠。在弹出窗口中，选择行和确定。然后设置图形的参数。
纵向质离子最大40乘85纳米CTAB涂层金纳米棒约为650纳米，横向共振为520纳米。CTAB 涂层金纳米棒在 U87 细胞膜上的散射强度显示了典型的高斯分布，其宽度与玻璃上的 CTAB 涂层金纳米棒的宽度一致，表明本实验中跟踪的 CTAB 涂层金纳米棒分布良好。如图所示，500多个CTAB涂层的金纳米棒轨迹可以通过暗场显微镜进行跟踪，并可分为远距离扩散轨迹和密闭扩散轨迹。
在此代表性分析中，所有 500 个轨迹的回旋半径显示小值分布，平均回旋半径为 0.5 微米，最大位移在小值下分布得更多。正如在此合奏时间平均方位移分析中所示，CTAB 涂层的金纳米棒通常以大约一个字母的字母扩散。然而，扩散系数和从所有轨迹中获得的α的密度分布表明，金纳米棒的动态呈现出具有超扩散、布朗尼和亚扩散运动的异质分布。
此外，单粒子统计分析和时间系列参数分析可用于描述两个具有代表性的长期限制和移动轨迹。有必要从单个粒子跟踪分析读出的数据中总结和提取单一的新解释，因为通常有一些难以做出的权衡。
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
概述
本研究展示了使用传统暗场显微镜观察细胞膜上金纳米棒（AuNRs）的动力学。该协议采用单粒子跟踪分析来表征AuNRs的平移和旋转动力学。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物物理学
- 细胞生物学
- 纳米技术
背景
- 金纳米棒（AuNRs）是研究细胞过程的有前景的工具。
- 了解它们在细胞膜上的动力学可以提供对细胞相互作用的洞察。
- 传统显微镜技术可以有效监测这些动力学。
- 单粒子跟踪分析允许对粒子行为进行详细的表征。
研究目的
- 监测细胞膜上AuNRs的动力学。
- 表征AuNRs的扩散和取向。
- 提供可适用于其他生物系统的协议。
使用的方法
- 为细胞培养准备玻璃盖片。
- 将细胞悬液涂抹在盖片上。
- 孵育细胞以达到所需的融合度。
- 添加CTAB包覆的金纳米棒以便观察。
主要结果
- 成功监测AuNR动力学使用暗场显微镜。
- 表征平移和旋转动力学。
- 展示了研究复杂生物系统的潜力。
- 使用ImageJ和MATLAB进行数据分析。
结论
- 该协议提供了研究AuNR动力学的可靠方法。
- 研究结果可应用于其他纳米材料和生物系统。
- 增强了对纳米材料与细胞相互作用的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Understanding nanoparticle diffusional dynamics on cell membranes informs rational design of nanomedicine delivery systems by revealing translational and rotational behaviors that impact cellular uptake. Single particle tracking of gold nanorods enables de-risking of nanocarrier hypotheses through quantitative assessment of surface diffusion states, supporting predictive confidence in early-stage target validation. This approach provides a reusable biophysical assay platform for mechanistic interrogation of nanoparticle-membrane interactions across discovery workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogate therapeutic hypotheses by characterizing gold nanorod translational and rotational dynamics on live cell membranes.
- Operational Value: Enable biological de-risking through quantitative extraction of location and orientation data using ImageJ and MATLAB.
- Predictive Value: Support portfolio triage by identifying distinct motion states such as long-range transport and limited-area confinement that correlate with functional outcomes.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepare validated biological systems for downstream workflows by tracking over 500 single nanorod trajectories with monodisperse scattering intensity.
- Reproducibility: Standardize measurements via mean square displacement analysis showing Brownian motion (alpha ≈ 1) across ensemble averages.
- Screening Scalability: Highlight platform reuse for studying surface or intracellular particle diffusion in different biological cells using darkfield microscopy.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Address risk-adjusted advancement decisions by linking single particle statistical analysis to time series parameters that characterize confined and moving trajectories.
- Mechanistic De-risking: Focus on predictive value by revealing heterogeneous diffusion dynamics including superdiffusion, Brownian, and subdiffusion modes from density distributions of diffusion coefficients and alpha values.
- Disease-Relevant System: Apply method to U87 MG cell membrane as a model for glioma-related nanomedicine delivery investigations.
Pipeline & Workflow Integration
Position the method within early discovery to support hypothesis testing, pathway clarification, and biological de-risking before lead identification stages.
- Discovery Biology: Explain how the method supports hypothesis testing by probing position and orientation of individual nanoparticles to reveal translational and rotational states.
- Screening: Describe assay readiness through quantitative outputs like radius of gyration (mean 0.5 μm) and displacement distributions from hundreds of tracked particles.
- Analytics: Highlight measurements such as mean square displacement, diffusion coefficient, and alpha exponent that enable comparison of diffusive states across conditions.
- Translational Research: Connect the method to preclinical continuity by characterizing two distinct motion states that inform nanocarrier design for intracellular delivery.
- Enterprise Reuse: Frame the method as a reusable capability for studying complex biological systems beyond gold nanorods, including other nanomaterials and cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through mechanistic de-risking of nanoparticle-membrane interaction hypotheses.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via ImageJ and MATLAB-based extraction of location, orientation, and dynamic parameters.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by identifying long-range transport versus confined diffusion states that affect cellular uptake efficiency.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on quantitative diffusive state distributions that reduce late-stage biological risk in nanomedicine development.
Implementation Considerations
- Required expertise in single particle tracking, darkfield microscopy, and MATLAB/ImageJ for trajectory analysis.
- Instrumentation needs include oil immersion darkfield condenser, 60X oil immersion objective, and color CMOS camera for time-lapse imaging.
- Cross-team standardization requires consistent parameter settings for particle detection (radius 6, cutoff 0, percentile 0.01%, link range 10, displacement 10).
- Adaptation considerations across model systems involve adjusting incubation times and nanorod concentrations based on cell type and membrane properties.
- Practical limitations include tradeoffs in single particle trajectory interpretation due to heterogeneous diffusion states requiring novel data interpretation approaches.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:48
Microscope Slide Preparation
2:06
Single Particle Darkfield Microscopy (DFM) Tracking
2:53
Data Acquisition
4:21
Red/Green Values
4:59
Data Analysis
5:30
Mean Square Displacement (MSD), Multi-Particle, and Time Analyses
6:33
Results: Representative Single Nanoparticle DFM of AuNR Diffusion Dynamics
8:39
Conclusion
