利用单纳米颗粒暗场显微技术可视化金纳米棒在细胞膜上的扩散动力学

本方案采用单颗粒追踪分析方法，监测金纳米棒在细胞膜上的位置和取向动态，并表征其扩散行为。利用该方法，可同时获取金纳米棒的平动和转动动力学信息，并对动态过程进行全面分析与呈现。本方案有望被应用于其他类型复杂生物系统的研究。

首先，将浸有乙醇的玻璃盖玻片在火焰上灼烧，然后将其放入含有2 mL不含酚红的细胞培养基的35 mm × 10 mm细胞培养皿中。向盖玻片上加入50 µL目标细胞悬液，并轻轻前后、左右摇动培养皿，使细胞均匀分布。将培养皿置于细胞培养箱中培养约12小时，待细胞融合度达到20%至40%后，向培养皿中加入20 µL CTAB包被的金纳米棒。

轻轻振荡以使纳米棒均匀分散在培养皿中后，将培养皿置于湿润环境中孵育五分钟。孵育结束后，缓慢将100微升上清液从培养皿转移至载玻片的凹槽中，小心地将盖玻片细胞面朝下放置在载玻片凹槽上，然后用指甲油密封盖玻片边缘，在将载玻片置于暗场显微镜载物台前让指甲油完全干燥。进行暗场显微镜单颗粒追踪时，将一滴油滴加至油浸暗场聚光镜上，并转动旋钮直至聚光镜与载玻片接触。

在盖玻片顶部滴加一滴油，转动聚焦旋钮，直至60X油镜接触到油滴。打开光源，轻微调节聚焦旋钮以聚焦成像平面。然后在显微镜软件中点击相机图标，使用彩色CMOS相机记录样品的散射光图像时间序列，并将图像保存为TIFF格式。

为了提取单条长期轨迹，使用 ImageJ 打开图像，依次点击图像、类型、8 位，将图像从 RGB 模式转换为 8 位模式。为调整对比度，依次点击图像、调整、亮度/对比度并设置参数。选择目标粒子，使用 Control X 剪切时间序列背景。

单击插件、粒子追踪经典版（particle tracker classic）和粒子追踪（particle tracker），打开粒子检测与粒子连接窗口，将半径设置为6，截断值设为0，百分位设为0.01%。将连接范围设为10，位移设为10，然后单击“确定”以打开粒子追踪结果窗口查看结果。单击“可视化所有轨迹”以检查生成的轨迹。如果软件生成的轨迹与金纳米棒的运动轨迹相符，则单击“保存完整报告”以保存结果。

如果软件生成的轨迹与金纳米棒的运动轨迹不匹配，请点击“重新链接粒子”，使用不同的链接范围和百分位数参数重新链接检测到的粒子。要根据 XY 坐标确定每帧中金纳米棒的中心像素坐标，请使用 xycoordination.m 函数。

为了界定一个 3×3 像素的矩阵，提取红色或绿色通道的九个散射强度值并计算其平均值，请使用 rgextraction.m 函数。然后使用 polarangle。

使用双通道微分法计算极角的函数。要利用表格中的公式计算动态参数，请运行两个分析脚本。对于轨迹的可视化分析，将X坐标设为X，Y坐标设为Y，时间设为Y，然后点击绘图、散点图和色谱图，设置图形参数，并添加颜色标尺。

为生成均方位移-时间间隔图，将时间间隔设为 X 轴，均方位移设为 Y 轴。点击绘图、散点图、分析、拟合、非线性曲线拟合并打开对话框，设置图形参数。对于多粒子统计分析，将感兴趣的动态参数设为 Y 轴，然后点击绘图和直方图。双击直方图以设置区间大小或区间数量，然后点击应用。

然后添加一列并设置图表参数。对于时间序列分析，将时间为 X 轴，时间序列参数为 Y 轴。点击绘图、多面板和堆叠。在弹出窗口中，选择线条并点击确定。然后设置图表的参数。

40乘85纳米的CTAB包覆金纳米棒的纵向等离激元吸收峰约为650纳米，横向共振峰位于520纳米。CTAB包覆金纳米棒在U87细胞膜上的散射强度呈现出典型的窄峰高斯分布，与玻璃基底上CTAB包覆金纳米棒的分布一致，表明本实验中追踪的CTAB包覆金纳米棒具有良好的单分散性。如图所示，通过暗场显微镜可同时追踪超过500条CTAB包覆金纳米棒的运动轨迹，这些轨迹可分为长程扩散轨迹和受限扩散轨迹。

本代表性分析中所有500条轨迹的回转半径呈现出较小值的分布，平均回转半径为0.5微米，最大位移在较小值范围内分布更广。如本组时间平均均方位移分析所示，CTAB包覆的金纳米棒通常以α值约为1进行扩散。然而，从所有轨迹获得的扩散系数和α值的密度分布表明，金纳米棒的动力学行为呈现出异质性分布，包含超扩散、布朗运动和亚扩散运动。

此外，可采用单颗粒统计分析和时间序列参数分析来表征两种典型的长期受限运动和移动轨迹。由于通常需要在若干困难的权衡之间进行取舍，因此有必要从单颗粒追踪分析的读数中总结并提取出一种新颖的单一数据解读。