一种用于外泌体定量与粒径测量的创新方法

本实验的目的是通过外泌体的大小对其进行分析，并采用纳米颗粒追踪分析（NTA）仪器通过半自动化方法对其进行定量。该过程通过差速离心步骤从人血中获取外泌体沉淀物来实现。将外泌体重悬于预先确定的浓度中，该浓度基于起始血浆量以获得适当的散射强度。

在纳米颗粒追踪分析（NTA）过程中，首先将悬液过滤以分离外泌体与较大的颗粒。随后，使用含有200纳米聚苯乙烯微粒的对照悬液对NTA仪器进行校准。接着将外泌体溶液注入NTA仪器中，并在正式检测前通过预实验选择NTA的最佳设置参数。

最终可以获得对所有测量颗粒的定量结果，并按颗粒大小进行列表。该方法的演示至关重要，因为每种制备的外泌体溶液都需要根据其溶液条件和设置单独优化，以获得最佳结果。所测量的外泌体应处于适宜浓度，使得实时观察模式下每屏幕显示约600个颗粒。

此外，应进行预实验以确定测量的最佳灵敏度范围。过高的灵敏度设置虽然能够显示更多小颗粒，但也会增加背景噪声相关的问题。本操作流程将由本实验室的研究生 Anto May 演示。开始外泌体制备时，通过静脉穿刺采集全血至三根柠檬酸盐试管中，总体积为九毫升。

然后将血液倒入一个 15 毫升 Falcon 管中，在 4 摄氏度下以 1,500 ×g 离心 20 分钟，使细胞与血浆初步分离。将上清液转移至一个新的 15 毫升 Falcon 管中。然后再次在 4 摄氏度下以 2,800 ×g 离心 20 分钟，以彻底去除血浆中的所有细胞。

将无细胞血浆或CFP转移至超速离心管中，每管1毫升。随后在4摄氏度下以100,000 G离心90分钟，以去除外泌体。弃去900微升上清液，并将沉淀重悬于超速离心管中剩余的100微升液体中。

加入 900 微升 PBS 后，以 100,000 ×g 离心 30 分钟，温度为 4°C。同前，弃去 900 微升上清液，用剩余的 100 微升液体重悬沉淀。取 5 至 20 微升重悬液，加入到 40 毫升蒸馏水中。

通过450纳米滤膜过滤该悬液，以分离外泌体与较大的颗粒。使用此最终悬液进行颗粒计数，并用于颗粒追踪仪器检测。首先，通过双击软件图标启动程序。

在实验方案过程中，点击各个软件标签以在它们之间切换。按照屏幕上的说明进行操作。如需自动执行启动程序，请同时选中细胞质量检查和自动校准的复选框。

如有需要，可分别按细胞检测选项卡上的 A 或 B 按钮重复上述任一步骤。在排液口下方放置一个烧杯以收集废液，切勿向系统中注入气泡。打开纳米颗粒示踪分析仪（NTA 仪器）的进样口和排液口，通过进样口用注射器向细胞通道注入 10 毫升蒸馏水。

在最后一点水注入后，立即关闭进水口和出水口。确保测量池中无气泡。单击“Okay”执行细胞质量检查。

几秒钟后，软件将显示细胞质量结果。如果在软件的实时画面中仍可见任何颗粒，或质量检测结果仅为“良好”或“较差”，请重复远端注水操作，直至测量池L中的残留颗粒被完全清除。每次测量后也需重复此步骤，以避免颗粒积聚。接下来，制备含有均一的、粒径为200纳米的聚苯乙烯颗粒的对照悬浮液。为校准激光与显微镜的焦点，取仪器制造商提供的悬浮液浓缩液一滴，加入500毫升蒸馏水中，调整至所需浓度，使实时画面中每屏显示的颗粒数为600±100个。

将校准悬浮液注入NTA仪器中，操作方式与注入蒸馏水相同。可以开始进行校准，这是一个自动化程序，系统将自动找到两个焦点的最佳位置。当出现提示表明系统现已准备好进行实验时，点击“确定”以开始测量。

每次实验之间，偶尔通过用 30% 乙醇溶液冲洗样品池来手动清洁样品通道。当软件显示自动错误报告时，应清洁通道。以执行系统的测量。

首先，在每次样品测量前，用蒸馏水冲洗通道。然后将外泌体悬浮液注入通道中。下一步是在软件中调节主要参数，以调整灵敏度。

通过点击“颗粒数与灵敏度”关系图，显示在不同灵敏度水平下每屏幕检测到的颗粒数曲线，从而确定最佳灵敏度范围。应选择位于曲线最大斜率之前的灵敏度水平。较高的灵敏度水平可使更多微小颗粒被可视化，但也会增加背景噪声相关的问题。

为调整最低亮度，选择20作为外泌体测量的起始亮度。若将此功能用作过滤器，可调高该参数以消除强光散射颗粒的信号，或调低该参数以放大微弱散射伪影，根据实验过程中需要的亮度进行调节。

接下来，设置数字滤波器以消除像素噪声以及尺寸过大的散射颗粒。通过调节最小和最大尺寸，使用10至500像素的范围来测量外泌体。通过设置快门值为300（相当于3.3毫秒）来调整相机开启的时间，从而调节快门。

在实验过程中，可通过点击实时图像按钮，在数字和模拟视图模式之间随时切换，以调整实时读数参数。请持续监测散射强度条，该条形图以颜色编码的形式显示样品的饱和状态。

如果散射条为红色，则不要分析外泌体。要开始测量，请点击测量选项卡。在运行选项数组中选择设置。

每次采集前，选择“检查运动”，重复进行颗粒漂移检测，设置实验次数及实验间的时间间隔。如有必要，执行样本检查。最后，点击“运行视频采集”按钮。

在新窗口中，定义循环次数和测量位置的数量。确认最短持续时间。每个被追踪的颗粒将被计为一个独立颗粒。

通过设置视频分辨率，较低的分辨率会缩短跟踪持续时间。最后，选择文件名并单击“确定”以开始测量。粒子数量与灵敏度曲线显示的是某一时刻单个位置处的粒子数量。

在自动灵敏度扫描过程中，灵敏度值应选择在曲线最大斜率出现之前。本测试实验中伪影未被消除，可能会影响曲线结果。实时画面中颗粒的可视化有助于设定合适的灵敏度值。

过低的数值会导致检测到的颗粒数量较少，而过高的数值则会导致图像质量较差。在最佳灵敏度水平下，质量良好的颗粒会呈现为彼此分离良好的单个点状。测量后的结果选项卡可显示各项参数，包括被追踪颗粒的总数、每个位置的平均颗粒数、颗粒浓度，以及颗粒大小与颗粒数量百分比之间的数值关系。

测量后计算出的图表显示了颗粒按尺寸的分布情况。在显示模式下，可使用图标来更改图表的设置。此外，外泌体的分析方法也有多种。

本方法展示了一种非常简单且优雅的方法，可快速进行类似的方法学分析，并在短时间内获得结果。为了比较多个样本，我们建议所有样本保持相同的稀释程度。除灵敏度和视频分辨率外，所有设置均可在后续通过少量分析软件进行调整。

通过这种方式，可对不同实验中获得的外泌体数量和大小数据进行半自动化的比较分析。