对于外来体定量和尺寸测量新方法研究

该程序的目标是按其大小分析外泌体，并通过半自动方法使用纳米颗粒跟踪分析或 NTA 仪器对其进行定量。这是通过使用差异离心步骤从人血中获得外泌体沉淀来实现的。将外泌体重悬于为起始血浆量预定的浓度，以获得适当的散射强度。

在 NTA 期间，然后过滤悬浮液以将外泌体与较大的颗粒分离。接下来，使用含有 200 纳米尺寸聚苯乙烯颗粒的对照悬浮液对 NTA 仪器进行校准。然后将外泌体溶液注入 NTA 仪器中，并在进行最终测试之前通过执行预测试来选择 NTA 的理想设置。

最终，可以获得显示所有测量颗粒的定量并按大小列出颗粒的结果。该方法的演示至关重要，因为必须单独执行每种制备的外泌体溶液的溶液和设置才能获得最佳结果。测得的外泌体应为 I 浓度，以便实时取景模式每屏显示约 600 个颗粒。

此外，还应进行预测试以找到测量的最佳灵敏度范围。高灵敏度设置会导致更多小颗粒的可视化，也会增加与背景噪声相关的问题。该程序将由我们实验室的研究生 Anto May 演示要开始外泌体制备，通过静脉穿刺将全血收集到三个柠檬酸盐管中，总共 9 毫升。

然后将血液倒入 15 毫升 Falcon 管中，将样品以 1， 500 G 离心 4 摄氏度 20 分钟，以开始从血浆中分离细胞。将 S 新生液转移到新的 15 ml Falcon 管中。然后在 4 摄氏度下以 2， 800 G 的离心力再次离心样品 20 分钟，以去除血浆中的所有细胞。

将游离血浆或 CFP 以每管 1 mL 的浓度转移到超速离心管中。接下来，在 4 摄氏度下以 100， 000 G 离心 CFP 90 分钟以耗尽外泌体。去除 900 微升上清液，并将沉淀重悬于超速离心管中剩余的 100 微升中。

加入 900 微升 PBS 离心机后，在 4 摄氏度下获得 100， 000 G 的离心力，持续 30 分钟。和以前一样，去除 900 微升仰卧剂，然后用剩余的 100 微升重悬沉淀。将 5 至 20 微升 Resus 混悬液转移到 40 毫升蒸馏水中。

通过 450 纳米过滤器过滤悬浮液，以将外泌体与较大的颗粒分离。使用这个最终的悬浮液进行粒子测量，以使用粒子跟踪仪器。首先，双击软件图标启动程序。

单击各种软件选项卡，在整个实验方案中在它们之间切换。按照屏幕上的说明进行作。要自动实施启动过程，请选中单元格质量检查和自动对齐的框。

如有必要，可以通过按下单元检查选项卡上的按钮 A 或 B 单独重复这些步骤中的任何一个。将烧杯放在 outlook 端口下方以收集废液，不要将气泡注入系统。打开纳米粒子示踪分析或 NTA 仪器的入口和展望端口，通过注射器通过入口将 10 毫升蒸馏水注入细胞通道。

立即关闭入口和出口，因为正在注入最后一定量的水。确保测量池没有气泡。单击执行细胞质量检查。好。

软件将在几秒钟后显示细胞质量结果，如果任何颗粒仍然在软件的实时取景屏幕中可见，或者如果质量检查的结果只有好或差，请重复远端注水，直到从测量池 L 中去除剩余的颗粒。 每次测量后重复此步骤，以避免颗粒积聚。接下来，制备含有均匀的 200 纳米聚苯乙烯颗粒的对照悬浮液。为了对齐激光器和显微镜的焦点，将仪器制造商提供的一滴悬浮液浓缩液加入 500 毫升蒸馏水中，得到所需的浓度，以便在实时取景中每个屏幕显示 600 个正负 100 个颗粒。

对齐悬浮液注入 NTA 仪器中，就像蒸馏水压榨机所做的那样。好的，也可以开始对齐，这是一个自动化例程，系统将自动找到两个焦点的最佳位置。当出现提示说明系统现在已准备好进行实验时，单击 Ok 开始测量。

偶尔在实验之间手动清洁细胞通道，用 30% 乙醇溶液冲洗细胞。每当软件显示自动错误报告时，清理通道。执行系统测量。

首先，在每次样品测量之前，用蒸馏水冲洗通道。然后将外泌体悬浮液注入通道中。下一步是调整软件中的主要参数来调整灵敏度。

通过单击颗粒数量与灵敏度的关系，显示不同灵敏度级别下每个屏幕测得的颗粒的曲线，找到最佳灵敏度范围。选择曲线最大斜率之前的敏感度级别。更高的灵敏度级别允许显示更多小颗粒，但也会增加与背景噪声相关的问题。

要调整最小亮度，请选择起始亮度 20 进行外泌体测量。要将此功能用作滤波器，请调高此参数以消隐强光散射粒子。将其调低以放大每周的散射伪影，在整个实验过程中根据需要非常明亮。

接下来，设置数字滤镜以消除像素杂色和不需要的散射超大粒子。通过调节最小和最大尺寸，使用 10 到 500 像素的范围来测量外泌体。通过将快门设置为 300（等于 3.3 毫秒）来更改相机打开的时间段，从而调整快门。

要调整实时读数参数，请单击实时图像按钮，随时在数字和模拟视图模式之间切换。在整个实验过程中。监控散射强度条，该条将样品的饱和度状态显示为颜色编码指示器。

如果散射条为红色，则不要分析外泌体。要开始测量，请单击 measurement 选项卡。在 run options 数组中选择 settings。

在每次采集之前，选择 check movement，重复检查粒子漂移测试，选择实验次数和实验之间的时间延迟。如有必要，请执行样本检查。最后，点击 Run video acquisition 按钮。

在新窗口中，定义循环次数和测量位置数。确认最短持续时间。跟踪一个粒子以将其计为一个单独的粒子。

通过设置视频分辨率，较低的分辨率会导致较短的跟踪持续时间。最后，选择一个文件名，然后单击 确定 开始测量。Number of Particles versus sensitivity （粒子数与灵敏度） 曲线显示某一时刻处于一个位置的粒子。

在自动敏感度扫描期间，在图表的最大斜率之前选择一个敏感度值。在此测试实验中，伪影并未消除，并且可能会影响图形。实时取景屏幕上的粒子可视化有助于设置正确的灵敏度值。

值太低会导致检测到少量颗粒。虽然值太高表示图像质量较差，但质量粒子在最佳灵敏度级别下显示为彼此很好地隔离的单个点。测量后的结果选项卡允许读取参数，包括跟踪的颗粒总数、每个位置的颗粒数和颗粒浓度，以及颗粒大小与颗粒数量百分比的数值比。

测量后计算的图表显示了按大小划分的颗粒分布。显示模式下的图标可用于更改图形的设置。此外，还有其他方法可以分析外泌体。

该方法展示了一种非常简单而优雅的方法，可以在快速过程中执行类似的方法分析，从而在短时间内生成结果。为了比较多个样品，我们建议所有样品保持相同的稀释水平。所有设置都接受灵敏度，之后可以使用少数分析软件更改视频分辨率。

这样，以半自动方式对在不同实验中获得的外泌体数量和大小数据的比较分析成为可能。