相关轻型和电子显微镜使用量子点纳米粒子

该方法的总体目标是通过将荧光免疫细胞化学信息与透射电子显微镜的超微结构形态相结合，在单个图像中获得相关的光学和电子显微镜或 CLEM 数据。这种方法可以帮助回答免疫细胞化学和病理学领域的关键问题，例如感兴趣的特定蛋白质与什么亚细胞结构相关。该技术的主要优点是它使用相同的量子点纳米粒子探针来获得来自目标蛋白质的实时显微镜信号和电子显微镜结构定位。

根据文本方案固定、包埋和切片人生长抑素瘤肿瘤组织后，将 20 厘米的透明胶带放入含有 2.0 毫升丙酮的 5 毫升瓶中，静置 10 分钟，制备切片胶粘剂溶液。撕下胶带，将镍网格浸入溶液中，然后取下网格并风干。干燥后，使用网格的暗淡面拾取超薄部分。

为所选树脂配方确定正确的蚀刻时间至关重要。30 分钟适用于此配方，但对于较硬或较软的配方，可能需要重新计算。在蒸馏水中制备一毫升新鲜的饱和偏高碘酸钠蚀刻溶液，并将溶液滴滴放在干净的实验室胶片表面上。

将完全干燥的网格和切片放在液滴上，并在室温下孵育 30 分钟。然后，将网格转移到蒸馏水滴中 60 秒以洗掉。为了在干净的实验室胶片表面进行抗体和量子点或 QD 标记，移液滴 0.05 摩尔甘油和 PBS。

将网格放在液滴上并孵育 10 分钟，以阻挡切片上残留的醛。要去除醛块，请短暂吸干网格的边缘。然后将网格放在 1% 正常山羊血清 （NGS） 和 1% BSAC 的 PBS 溶液液滴上 10 分钟。

通过在 890 μL PBS 中加入 10 μL NGS 和 100 μL BSAC 来制备 1 mL 封闭溶液。然后，将切片放在抗体稀释剂滴上 10 分钟，以调节切片。接下来，使用抗体稀释剂稀释抗生长抑素多克隆抗体 1 比 10，并将网格放在溶液的液滴上。

在潮湿的室温下孵育 1 小时。孵育后，通过吸干网格边缘来去除抗体试剂。然后使用抗体稀释剂洗涤切片 2 次，每次 5 分钟。

稀释二抗 1 至 10 并制备液滴后，在室温下将液滴上的网格孵育 1 小时。然后，去除抗体溶液并洗涤切片两次。稀释链霉亲和素偶联的 QD 1 至 10，并在室温下避光将样品滴在溶液滴上孵育 1 小时。

然后使用抗体稀释剂洗涤网格两次，每次 5 分钟，并吸干网格边缘。接下来，用蒸馏水清洗网格两分钟，然后吸干边缘。将免疫染色的网格切片放在载玻片上的水滴中，并使用玻璃盖玻片覆盖它。

要进行荧光显微镜检查，请插入具有以下特性的滤光片立方体，并使用 365 纳米 LED 照明。将免疫染色切片放在免疫荧光显微镜载物台上。使用光学显微镜评估标记模式、任何非特异性标记的水平，并确定阴性对照是否明确。

接下来，确定与网格条相关的 ROI。然后将全彩数码相机设置为 FL 自动颜色，并将白平衡设置为 3， 200 K.将相机设置为自动曝光模式，伽玛设置在 0.45 和 1.00 之间以优化图像的外观，模拟增益设置为 1 X.单击 ZEN Two Light 软件图形界面中的相机图标以实时。然后专注于图像并单击 ZEN Two Light 软件图形界面中的 Snap 将图像捕获到帧存储。

将图像另存为 tf 文件以避免压缩和像素化。准备一张打印件，显示 ROI 相对于网格条或其他重要组织地标的位置。然后从载玻片上取下网格，用蒸馏水洗涤，轻轻吸干边缘。

要进行透射电子显微镜检查，请使用 100 KB 的加速电压将网格转移到显微镜进行检查。从大约 1， 400 倍的低放大倍率开始，在网格中导航并找到与光学显微镜发现的 ROI。在 70， 000 倍或更高的放大倍率下观察单个 QD。

它们将表现为具有中等电子密度的不规则晶体结构。然后，使用成像软件图形界面中带有 1， 392 x 1， 040 像素单色传感器的数码相机，单击相机图标以打开并获取图像。将相机图标移动到 off 位置，以将图像存储在帧存储中。

要进行 CLEM 成像，请使用光学显微镜成像的打印件通过 TEM 定位相应的 ROI。组织结构特征对于在该部分周围导航非常有用。通过 TEM 捕获相应 ROI 的图像。

接下来，要准备 CLEM 图像，请确保 TEM 图像的方向正确，并放大到与光学显微镜图像相同的尺寸和分辨率，在本例中为每英寸 300 像素。将光学显微镜图像画布的大小扩展到其大小的两倍。然后将 TEM 图像复制并粘贴到荧光图像旁边。

要在 Photoshop CS2 中创建荧光叠加，请单击矩形选框工具，选择荧光图像，然后从中创建一个复制图层。将图层样式混合选项调整为 30% 到 40% 透明度。然后单击移动工具，将荧光叠加层拖动到相应的 TEM 图像上，并对齐图像。

对齐图像后，拼合图像以生成最终叠加。然后使用矩形选框工具选择新的叠加图像并将其复制到新画布。最后，将图像另存为 tf 文件。

在该荧光显微镜图像中，单个生长抑素瘤肿瘤细胞含有丰富的分泌颗粒，并针对生长抑素激素进行了阳性标记。细胞核显示为黑孔，在低放大倍率下，在细胞质中可以看到可变的强烈颗粒橙色 QD 荧光。通过参考 20X 光学显微镜图像，使用 TEM 识别并成像光学显微镜选择的 ROI，如下所示。

在更高的放大倍率下，细胞在细胞质颗粒中表现出明亮的荧光和强烈的 QD 标记。如本例所示，荧光数据叠加在 TEM 图像上表明强阳性标记对应于囊泡限制膜内含有中等电子密度物质的颗粒。最后，如图所示，在更高的放大倍率下，中等电子密度的颗粒显示出强烈的 QD 纳米晶体免疫标记。

一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在 8 小时内完成。在尝试该过程时，请务必记住小心处理网格，仅处理边缘。在拾取网格时触摸该部分可能会使该部分与网格分离。

按照此程序，可以执行其他方法（如多重免疫标记）来回答其他问题，例如您的目标蛋白质是否与另一种蛋白质共定位。开发后，这项技术为病理学领域的研究人员为探索电子显微镜档案人体组织过程中的蛋白质定位铺平了道路。观看本视频后，您应该对如何将荧光光显微镜的免疫细胞化学信息与透射电子显微镜的超微结构相结合有了很好的了解。

不要忘记，使用四氧化锇可能非常危险，因此在执行此程序时应采取预防措施，例如佩戴防护设备、在通风橱中工作和适当的废物处理。