Name: 细胞外囊泡的量化和尺寸测定纳米粒子跟踪分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: 了解使用纳米粒子跟踪分析技术对细胞外囊泡进行定量化和尺寸测定的标准化实验方案。该方法通过优化仪器参数设置，有效减少操作者偏差，提高数据的可重复性和准确性，适用于小鼠脂肪组织和人类血浆等多种生物样本来源的细胞外囊泡表征分析。

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本工作得到了美国国立卫生研究院（ES030973-01A1、R01ES025225、R01DK066525、P30DK026687、P30DK063608）的支持。我们感谢HORIBA Instruments Incorporated公司的Jeffrey Bodycomb博士在仪器校准方面的帮助。

所有涉及这些样本的操作均遵循机构动物护理和使用委员会以及机构审查委员会的指南。NTA 方法的示意图见图2。
<img alt="纳米颗粒示踪分析示意图；包括装置设置、测量、数据处理和结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62447/62447fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：使用颗粒示踪仪器的纳米颗粒示踪分析（NTA）方法概述。 样品制备完成后插入仪器中。打开NTA软件，调整记录参数，并对样品进行聚焦。随后，记录、处理并显示数据。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62447/62447fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
1. 细胞外囊泡的分离
注意：小鼠性腺周围脂肪组织的细胞外囊泡（EV）的分离方法如前所述23。血浆EV从1 mL人血浆中分离，采用以下方案：
<ol>
	<li>收集血浆并在 3,000 x g 条件下离心 15 分钟，以去除细胞碎片。将上清液转移至新管中。 
	注意：如果仍可检测到额外碎片，请将上清液在 12,000 x g 条件下再离心 10 分钟，并将上清液转移至新管中。</li>
	<li>每 250 µL 血浆中加入 67 µL 外泌体分离试剂。通过倒置或轻弹管壁充分混匀。</li>
	<li>将样品直立置于冰上孵育 30 分钟。</li>
	<li>将外泌体分离试剂与血浆的混合物在 4 °C 条件下以 3,000 x g 离心 10 分钟。 
	注意：离心可在室温或 4 °C 进行，结果相似，但推荐使用 4 °C。离心后，EVs 可能在管底形成浅黄色或白色沉淀。</li>
	<li>小心吸除上清液。短暂离心以收集残留的外泌体分离溶液，并彻底吸除所有液体，注意不要扰动沉淀中的 EVs。</li>
	<li>将沉淀重悬于 200 µL 缓冲液 B（由生产商提供）中。使用分光光度计、荧光计、Bradford 法或其他常用方法测定并记录样品的蛋白浓度（用于步骤 2.8）。</li>
</ol>
2. 分离的细胞外囊泡的纯化
<ol>
	<li>向重悬的EVs中加入200 µL缓冲液A（由制造商提供）。</li>
	<li>取出纯化柱（已提供），松开螺口盖，并折断底部封盖。将纯化柱放入收集管中。 
	注意：请保留底部封盖，用于步骤2.7–2.9。</li>
	<li>在1,000 × g 条件下离心30秒，以去除保存缓冲液。</li>
	<li>弃去穿流液，并将纯化柱重新放回收集管中。</li>
	<li>为洗涤纯化柱，取下顶部盖子，在树脂上方加入500 µL缓冲液B，并在1,000 × g 条件下离心30秒。弃去穿流液。请保留顶部盖子，用于步骤2.7–2.9。</li>
	<li>重复步骤2.4–2.5一次，以进一步洗涤纯化柱。</li>
	<li>用步骤2.2中取下的底部封盖堵住纯化柱底部。在树脂上方加入100 µL缓冲液B，以准备上样。</li>
	<li>将步骤1.6中的全部内容（或相当于总蛋白量不超过4 mg的体积）加入树脂中。将螺口盖盖在纯化柱顶部。</li>
	<li>在室温下置于旋转摇床上混合，时间不超过5分钟。</li>
</ol>
3. 样品洗脱
<ol>
	<li>松开螺帽并取下底部封闭塞，立即转移至 2 mL 微量离心管中。 
	​注意：一旦取下底部封闭塞，样品将立即开始洗脱。请确保已准备好 2 mL 微量离心管以接收洗脱液，以尽量减少样品损失。</li>
	<li>在 1,000 x g 条件下离心 30 秒，以获得纯化的细胞外囊泡（EVs）。弃去层析柱。</li>
</ol>
4. 纳米颗粒跟踪分析的样品制备
<ol>
	<li>使用无绒材料（如超细纤维布）覆盖工作区域，防止纤维进入比色皿中。</li>
	<li>佩戴手套后，将比色皿放置于磁力比色皿夹具上，然后将搅拌子放入比色皿内。操作比色皿时务必始终佩戴手套，以避免在比色皿表面留下指纹或污渍。</li>
	<li>使用钩状工具将插入件放入比色皿中，如图3所示。请注意插入件的方向，以便后续步骤使用（步骤5.4）。</li>
</ol>
<img alt="使用比色皿装置进行激光光子学实验；A-B 视图显示用于相机捕获的激光对准情况。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62447/62447fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3"> 
图 3：插入件在石英比色皿中的正确取向。 插入件的“缺口”应从比色皿正面可见。将比色皿插入仪器时，应使缺口面向相机。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62447/62447fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<ol start="4">
	<li>使用移液器，缓慢加入400-500 µL 将稀释液或稀释后的样品在室温下通过插入件上的孔加入比色皿中。轻轻吹打混匀，避免引入气泡。
	<ol>
		<li>首先准备一个装有选定稀释液（空白）的比色皿，用于测量稀释液的颗粒浓度。此步骤应在测量样品前完成，以便校正样品的背景浓度。 
		注意：一个合适的空白对照（本例中为磷酸盐缓冲液 [PBS]）应具有一定的浓度 &lt;9 × 106 （取决于稀释液），在实时视野中将显示每视野1-10个颗粒图4建议实际样品的颗粒浓度至少为背景浓度的3倍。</li>
		<li>可选步骤：在记录样品前，用 400-500 µL 稀释液或稀释后样品在测量前的处理。为此，加载 400-500 µL 将稀释后的样品加入比色皿中，弃去溶液，然后加入 400-500 µL 可使用更多样品进行测量，这有助于洗去比色皿内的残留物。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="光学激发图像，星场捕捉，天文学研究，天体观测，光子分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62447/62447fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 4"> 
图4：空白样品在合适浓度范围内稀释液的代表性实时流图像。 将细胞外囊泡（EV）样品用过滤后的（推荐0.02 µm或3 kDa）PBS稀释。良好的空白样品在实时观察中每视野应显示约1-10个颗粒，对应的浓度范围为105-106。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62447/62447fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="5">
	<li>盖上比色皿盖，检查是否有气泡。如有必要，轻敲去除气泡。使用无绒布擦拭比色皿外表面。</li>
</ol>
5. 粒子示踪仪的启动程序
<ol>
	<li>打开计算机工作站和仪器，等待几分钟后再运行第一个样品，然后单击软件图标启动程序。当屏幕提示时，单击 NTA 以进行纳米颗粒追踪分析。从 Recording 选项卡开始，在整个实验流程中通过单击不同的软件选项卡（Record, Process, Plot）在各功能间切换。首先记录样品（稀释液或EV制备物），然后处理记录数据，最后绘制结果。</li>
	<li>按照屏幕上的指示填写有关样品的所有必要信息。检查所有必填字段是否已完整且准确填写，例如：样品名称、描述、样品制备方法、稀释倍数 [1000]、目标温度（设定为 22 °C），以及稀释液：从下拉菜单中选择稀释液，并使用 PBS 作为 EV 的稀释液。从下拉菜单中选择 PBS 将自动填充盐度为 9%。该信息对于确定液体的动态黏度至关重要。 
	注意：即使温度探针已显示达到目标温度（即绿色圆点稳定），样品池内的温度平衡仍可能需要长达 3 分钟。若未正确设定目标温度，样品读数可能会有显著差异，因为样品温度的变化会显著影响颗粒的布朗运动。</li>
	<li>打开仪器盖板，取下覆盖在样品池放置位置上的保护帽。 
	警告：该颗粒追踪仪器被认证为 1 类激光产品（21 CFR Ch. I part 1040），内部含有潜在危险的激光，可能导致烧伤和/或永久性视力损伤。为防止意外或伤害，请勿通过拧开侧面螺钉的方式拆除仪器外壳。请注意，在正常操作过程中，激光束完全封闭在仪器内部，不会对用户构成威胁。此外，仪器的样品架内置有磁性安全联锁装置，当样品架盖板被移除时，可防止激光运行。</li>
	<li>将步骤 4.3 中的样品池以正确方向放入仪器内（参见 图 5）。重新盖上样品池盖板，并关闭仪器盖板。操作仪器时，必须始终确保样品架上方盖板处于就位状态。切勿禁用或试图绕过安全联锁功能。</li>
</ol>
<img alt="用于标记实验图示中瞬态吸收光谱的激光光源光学装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62447/62447fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 5"> 
图 5：样品池在粒子追踪仪器中的正确取向。 样品池的正面（可看到插入件的“缺口”）应朝向相机。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62447/62447fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="5">
	<li>单击Streaming上方的箭头以开启相机。</li>
	<li>单击下拉箭头展开Record设置。将增益（Gain）和激光功率（Laser power）设置为适用于当前应用的数值。有关小尺寸（100 nm）EVs进行NTA时所用参数，请参见Table 1（以及Supplemental Figure 1）。 
	注意：通过单击下拉箭头访问的这些高级设置可能受密码保护。记录和处理稀释液（空白样）时，应使用与后续样品相同的设置。</li>
	<li>调节焦距，直至颗粒清晰对焦。对焦时应选择相对较小的颗粒进行（图6）。对于小EVs定量分析（与外泌体一致），推荐使用以下录制参数：帧率：30 fps，曝光时间：15 ms，搅拌时间：5 s，等待时间：3 s，激光功率—蓝色：210 mW，绿色：12 mW，红色：8 mW，每段视频帧数：300帧，增益：30 dB。 
	注意：用户可将缩放（Zoom）调至1x和/或提高增益以辅助对焦。请务必在录制视频前将这些参数重新设为推荐值。</li>
</ol>
<img alt="显示恒星形成不同阶段的显微镜图像；星系模式，天文观测。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62447/62447fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图6"> 
图6：显示颗粒聚焦状态的代表性实时画面。（A）颗粒未聚焦的实时画面示例。颗粒呈现类似光晕的辉光或显得模糊。需调整焦距。（B）颗粒处于正确聚焦状态的实时画面示例。最小的颗粒清晰对焦。此时开始记录。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62447/62447fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="8">
	<li>进行目视质量检查，以确保样品已适当稀释。如果样品浓度过高，请将比色皿从仪器中取出，并逐步稀释样品。重复此过程，直至样品达到适当稀释程度，然后进入第6步。 
	​注意：切勿过度稀释样品！务必逐级进行稀释。理想的空白样品在屏幕上仅显示少量颗粒（1–4个），如图4所示。对于细胞外囊泡（EV）样品，适当稀释后的样品在屏幕上应可见约20–100个颗粒，且背景无发光样或云雾状图像（参见图7示例）。这将使颗粒浓度处于每毫升5 × 106 至 2 × 108 个颗粒的最优范围内（未校正稀释因子）。</li>
</ol>
<img alt="显示不同细胞密度的荧光显微镜图像；图A、B、C；信号强度分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62447/62447fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图7"> 
图7：代表性的实时成像画面，展示不同颗粒稀释度下的情况。（A）浓度过高的样本实时成像示例。若样本浓度过高，将导致结果不准确。（B）稀释适当的样本实时成像示例。屏幕上可见60–100个颗粒，记录所得原始浓度为5 × 106–2 × 108 个颗粒/mL。（C）稀释过度的样本实时成像示例。若样本过于稀释，则被追踪的颗粒数量不足，样本量降低，因此结果在统计学上无效。在此情况下，建议增加录制视频的数量。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62447/62447fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
6. 视频数据采集
<ol>
	<li>（可选）将缩放设置为 0.5x，以节省带宽并防止丢失帧。</li>
	<li>点击录制开始录制视频（推荐的录制参数见表 1）。 
	注意：默认情况下，仪器将对样品搅拌 5 秒，静置 3 秒，然后录制 10 秒，之后重复此过程。通常录制 50 个视频所需时间约为 15 分钟，处理时间约为 13 分钟。</li>
	<li>录制视频期间请勿触碰仪器。确保实验台表面无振动。 
	注意：建议将仪器放置在防震平台或防震台上，以减少附近设备产生的振动干扰，避免影响纳米颗粒运动的测定。请勿在放置颗粒追踪仪器的同一实验台上操作离心机、涡旋混合器或其他可能产生振动的设备。振动会在屏幕上表现为原本呈圆形的颗粒出现拉长现象。若仪器受到强烈振动，可能需要重新调整光学元件。该仪器未设计为由用户进行维护或校准；如需维护、服务或校准，请联系制造商。</li>
	<li>记录下任何可见到大而形状不规则的白色团块（即异常大颗粒）的视频，并在步骤 7.3 中将其从处理流程中剔除。</li>
</ol>
7. 处理采集的数据
<ol>
	<li>当出现提示表明视频已录制完成时，点击 OK 以完成录制。然后选择 Process 选项卡。 
	注意：此处可暂停实验流程。之后可通过打开颗粒追踪仪器的软件并指定已录制视频的保存目录，直接进入 Process 选项卡，重新启动数据处理。</li>
	<li>分析细胞外囊泡（EVs）时，勾选 Disable auto detection override 复选框，并将特征直径（Feature Diameter）设置为 30。点击 Process。（处理参数参见 Table 2，处理界面参见 Supplemental Figure 2）。系统将实时显示分布图，以便用户实时查看处理过程。
	<ol>
		<li>对于外泌体（exosomes），使用默认的 Polydisperse Sample 检测阈值进行处理。仅当溶液中颗粒尺寸差异极大时，才将 Detection Threshold Manual 设置为 0.8，而非标准阈值 0.99。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>如果某些视频中明显可见过大的颗粒（参见步骤 6.4），请导航至已录制视频的目录并删除有问题的视频文件。编辑视频文件列表后，还需在其他用户维护的日志中更新已录制视频的数量。</li>
	<li>处理完成后，点击 OK，然后选择 Plot 选项卡。对于细胞外囊泡（EVs），将主图（Main chart）显示为 LogBinSilica。 
	​注意：在 Plot 选项卡中，用户可自定义图表的其他参数，例如设定横轴范围（颗粒直径，nm），以确定生成图表的积分区域。</li>
</ol>
8. 显示并解读结果
<ol>
	<li>要创建 PDF 报告，请点击 Report 按钮。此时测量已完成，可以查看结果。 
	注意：请务必先记录和处理空白样品，以便校正后续样品的背景颗粒浓度。如果遗漏此步骤，可在样品测量后补录空白样品，并手动校正样品颗粒浓度。</li>
	<li>查看 PDF 报告，报告中显示了平均粒径、中位粒径和众数粒径，以及根据稀释因子校正并扣除分散液颗粒浓度后的颗粒浓度。报告还显示了分布宽度（标准偏差）。 
	​注意：极少有应用场景适合仅用单一数值来代表整体情况。因此，建议描述完整的粒径分布，并报告所分析样品的分布宽度（例如，如表 3所示）。</li>
	<li>记录生成数据时所使用的以下仪器参数，报告结果时应注明这些设置：分散液、各激光器的激光功率 [mW]、曝光时间 [ms]、增益 [dB]、帧率 [fps]、每段视频的帧数、记录的视频数量、处理设置（例如 LogBinSilica）、积分范围 [最小 nm, 最大 nm]（建议将最小值设为 50 nm），以及被追踪的颗粒数量（建议每段视频至少分析约 150 个颗粒；每样品总追踪颗粒数建议不少于 3,750，以避免粒径分布中出现人为假象峰，并获得具有统计学意义的数据）。</li>
</ol>
9. 清洗比色皿
<ol>
	<li>在样品之间手动清洗比色皿。首先，倒空比色皿。 
	注意：样品可从比色皿中回收保存，也可弃去。</li>
	<li>比色皿排空后，用去离子水（DI水）冲洗10至15次以清洁比色皿，随后用70%–100%乙醇冲洗3次。操作时应确保溶剂完全充满比色皿。</li>
	<li>用无绒微纤维布擦干比色皿外壁，避免在表面留下污渍。让比色皿内壁自然风干，或使用压缩空气除尘器吹干。 
	注意：仅应使用镜头清洁纸或无绒微纤维布擦拭比色皿的光学表面，因为大多数纸制品含有微小的木质纤维，可能会划伤或损坏比色皿表面。</li>
	<li>准备两个玻璃闪烁瓶：一个装有70-100%乙醇，另一个装有去离子水。先将插入件和搅拌子放入乙醇中（随后再放入去离子水中）进行清洗，即将插入件或搅拌子放入相应的闪烁瓶中，剧烈振荡。使用无绒布或压缩空气除尘器将插入件和搅拌子干燥。 
	注意：比色皿和插入件也可使用超声波水浴进行清洗。操作时，首先确保超声波设备内含有足够的水（水深至少5 cm）。然后将比色皿和插入件放入一个玻璃烧杯（50 mL 或更大）中，向烧杯内加入酒精至与水浴液面高度相同，将烧杯置于水中，开启电源。每次超声时间不超过5分钟，并让设备适当间歇休息 &gt;每次5分钟脉冲之间间隔5分钟，若需要更长时间则以此类推。</li>
	<li>完成后，立即将所有清洁并干燥的部件收好存放。</li>
</ol>

<ol><li>Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis%2C+secretion%2C+and+intercellular+interactions+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).</li>
<li>Hessvik, N. P., Llorente, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+knowledge+on+exosome+biogenesis+and+release%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+molecular+life+sciences%3A+CMLS%22%5BJournal%5D)">Current knowledge on exosome biogenesis and release.</a> Cellular and molecular life sciences: CMLS. 75, 193-208 (2018).</li>
<li>Johnstone, R. M., Adam, M., Hammond, J. R., Orr, L., Turbide, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+formation+during+reticulocyte+maturation.+Association+of+plasma+membrane+activities+with+released+vesicles+%28exosomes%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Vesicle formation during reticulocyte maturation. Association of plasma membrane activities with released vesicles (exosomes).</a> The Journal of Biological Chemistry. 262, 9412-9420 (1987).</li>
<li>Théry, C., Ostrowski, M., Segura, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+vesicles+as+conveyors+of+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Membrane vesicles as conveyors of immune responses.</a> Nature Reviews Immunology. 9, 581-593 (2009).</li>
<li>Yáñez-Mó, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+properties+of+extracellular+vesicles+and+their+physiological+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066(2015).</li>
<li>Lo Cicero, A., Stahl, A., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+shuffling+intercellular+messages%3A+for+good+or+for+bad%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles shuffling intercellular messages: for good or for bad.</a> Current Opinion in Cell Biology. 35, 69-77 (2015).</li>
<li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+exosomes%2C+microvesicles%2C+and+friends%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends.</a> The Journal of Cell Biology. 200, 373-383 (2013).</li>
<li>Mathivanan, S., Ji, H., Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+extracellular+organelles+important+in+intercellular+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Exosomes: extracellular organelles important in intercellular communication.</a> Journal of Proteomics. 73, 1907-1920 (2010).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+and+technologies+for+exosome+isolation+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Small+Methods%22%5BJournal%5D)">Methods and technologies for exosome isolation and characterization.</a> Small Methods. 2, 1800021(2018).</li>
<li>Szatanek, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+methods+of+choice+for+extracellular+vesicles+%28EVs%29+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">The methods of choice for extracellular vesicles (EVs) characterization.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18, (2017).</li>
<li>Erdbrügger, U., Lannigan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+challenges+of+extracellular+vesicle+detection%3A+A+comparison+of+different+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A%3A+The+Journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Analytical challenges of extracellular vesicle detection: A comparison of different techniques.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 89, 123-134 (2016).</li>
<li>Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Extracellular+Vesicles%3A+General+Methodologies+and+Latest+Trends%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Isolation of Extracellular Vesicles: General Methodologies and Latest Trends.</a> BioMed Research International. 2018, 1-27 (2018).</li>
<li>Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+rotor+type+and+centrifugation+time+on+the+yield+and+purity+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).</li>
<li>Taylor, D. D., Shah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+isolating+extracellular+vesicles+impact+down-stream+analyses+of+their+cargoes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes.</a> Methods. 87, San Diego, California. 3-10 (2015).</li>
<li>Desdín-Micó, G., Mittelbrunn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+exosomes+in+the+protection+of+cellular+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adhesion+%26+Migration%22%5BJournal%5D)">Role of exosomes in the protection of cellular homeostasis.</a> Cell Adhesion & Migration. 11, 127-134 (2017).</li>
<li>Kanemoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivesicular+body+formation+enhancement+and+exosome+release+during+endoplasmic+reticulum+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Multivesicular body formation enhancement and exosome release during endoplasmic reticulum stress.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 480, 166-172 (2016).</li>
<li>Benedikter, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cigarette+smoke+extract+induced+exosome+release+is+mediated+by+depletion+of+exofacial+thiols+and+can+be+inhibited+by+thiol-antioxidants%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cigarette smoke extract induced exosome release is mediated by depletion of exofacial thiols and can be inhibited by thiol-antioxidants.</a> Free Radical Biology & Medicine. 108, 334-344 (2017).</li>
<li>Saeed-Zidane, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+exosome+mediated+molecular+defense+mechanism+in+bovine+granulosa+cells+exposed+to+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Cellular and exosome mediated molecular defense mechanism in bovine granulosa cells exposed to oxidative stress.</a> PloS One. 12, 0187569(2017).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stress-dependent+autophagy+component+release+via+extracellular+nanovesicles+in+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Mechanical stress-dependent autophagy component release via extracellular nanovesicles in tumor cells.</a> ACS Nano. 13, 4589-4602 (2019).</li>
<li>King, H. W., Michael, M. Z., Gleadle, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxic+enhancement+of+exosome+release+by+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Hypoxic enhancement of exosome release by breast cancer cells.</a> BMC Cancer. 12, 421(2012).</li>
<li>Bonzini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+particulate+matter+exposure+induces+extracellular+vesicle+release+in+overweight+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Environment+Research%22%5BJournal%5D)">Short-term particulate matter exposure induces extracellular vesicle release in overweight subjects.</a> Environment Research. 155, 228-234 (2017).</li>
<li>Neri, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particulate+matter+induces+prothrombotic+microparticle+shedding+by+human+mononuclear+and+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Particulate matter induces prothrombotic microparticle shedding by human mononuclear and endothelial cells.</a> Toxicology In Vitro. 32, 333-338 (2016).</li>
<li>Flaherty, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lipase-independent+pathway+of+lipid+release+and+immune+modulation+by+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A lipase-independent pathway of lipid release and immune modulation by adipocytes.</a> Science. 363, 989-993 (2019).</li>
<li>van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shedding+light+on+the+cell+biology+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19, 213-228 (2018).</li>
<li>Dragovic, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sizing+and+phenotyping+of+cellular+vesicles+using+Nanoparticle+Tracking+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%3A+Nanotechnology%2C+Biology%2C+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 7, 780-788 (2011).</li>
<li>Saveyn, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+particle+size+distribution+determination+by+nanoparticle+tracking+analysis+based+on+2-D+Brownian+dynamics+simulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Colloid+and+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Accurate particle size distribution determination by nanoparticle tracking analysis based on 2-D Brownian dynamics simulation.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 352, 593-600 (2010).</li>
<li>Vander Meeren, P., Kasinos, M., Saveyn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relevance+of+two-dimensional+Brownian+motion+dynamics+in+applying+nanoparticle+tracking+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Relevance of two-dimensional Brownian motion dynamics in applying nanoparticle tracking analysis.</a> Methods in Molecular Biology. , Clifton, N.J. 525-534 (2012).</li>
<li>Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+evaluation+of+Nanoparticle+Tracking+Analysis+%28NTA%29+by+NanoSight+for+the+measurement+of+nanoparticles+and+protein+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Critical evaluation of Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates.</a> Pharmaceutical Research. 27, 796-810 (2010).</li>
<li>Bachurski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle+measurements+with+nanoparticle+tracking+analysis+-+An+accuracy+and+repeatability+comparison+between+NanoSight+NS300+and+ZetaView%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle measurements with nanoparticle tracking analysis - An accuracy and repeatability comparison between NanoSight NS300 and ZetaView.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1596016(2019).</li>
<li>Varga, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hollow+organosilica+beads+as+reference+particles+for+optical+detection+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Hollow organosilica beads as reference particles for optical detection of extracellular vesicles.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16, 1646-1655 (2018).</li>
<li>Serrano-Pertierra, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+Current+analytical+techniques+for+detection+and+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: Current analytical techniques for detection and quantification.</a> Biomolecules. 10, (2020).</li>
<li>Maguire, C. M., Rösslein, M., Wick, P., Prina-Mello, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+particles+in+solution+-+a+perspective+on+light+scattering+and+comparative+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Science+and+Technology+of+Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Characterisation of particles in solution - a perspective on light scattering and comparative technologies.</a> Science and Technology of Advanced Materials. 19, 732-745 (2018).</li>
<li>Bohren, C. F., Huffman, D. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBohren%2C+CF+%22Absorption+and+Scattering+of+Light+by+Small+Particles%22">Absorption and Scattering of Light by Small Particles</a>. , John Wiley & Sons. (1983).</li>
</ol>

所有作者均声明不存在利益冲突。

本文展示了一种通过纳米颗粒跟踪分析（NTA）检测细胞外囊泡（EV）的方案，可同时测量多种粒径范围的粒径分布，并测定多分散样品中EV的总浓度。本研究中使用小鼠腹股沟脂肪组织和人血浆作为EV来源，但其他组织或生物液体（如血清、尿液、唾液、乳汁、羊水及细胞培养上清液）中分离得到的EV也可用于NTA检测。通过测定聚苯乙烯标准微球，确认仪器已正确校准，并证明该NTA仪器能够准确测量直径≤400 nm的纳米颗粒。随后对小鼠组织EV样品进行不同稀释倍数的检测。如图9所示，所报告的颗粒浓度随稀释倍数成比例变化，符合预期，表明仪器在不同稀释条件下对颗粒浓度的检测具有较高准确性，且技术重复之间的变异较小。然而，该结果仅在颗粒浓度处于仪器工作范围（每毫升5×106至2×108个颗粒）内时成立；因此，适当稀释样品是本方案中的关键步骤。校正稀释倍数后，四种不同稀释度下测得的样品总颗粒浓度估算值基本一致，四次检测间的变异系数（CV）为15.1%。此外，对同一样品多次稀释后重复测量的结果显示，粒径分布评估具有良好的精确性：颗粒浓度随稀释倍数成比例变化，而报告的粒径...

细胞外囊泡（EVs）是一类由几乎所有细胞类型分泌的微小（0.03–2 µm）膜性囊泡1。根据其释放机制和大小，这些囊泡常被称为“外泌体”、“微囊泡”或“凋亡小体”2。早期认为EVs仅是细胞清除废物以维持稳态的一种简单方式3，但现在已知它们还可通过传递包括DNA、RNA（mRNA、microRNA）、脂质和蛋白质在内的分子物质参与细胞间通讯4,5，并在正常生理过程及病理过程中发挥重要的调控作用1,5,6,7,8。
分离和定量EVs的方法有多种，已在其他地方有所描述9,10,11,12分离方案的选择以及EV的来源会显著影响EV的得率和纯度。即使是长期以来被视为外泌体分离“金标准”的差速离心法，也可能存在较大的实验变异性，进而影响所获得的EV群体及其后续分析结果。13因此，细胞外囊泡分离与定量的各种不同方法使得文献中报道的实验结果难以进行比较、重复和解释。14此外，细胞外囊泡（EV）的释放可受到细胞状态或多种外界因素的调控。有研究表明，EV可通过保护细胞免受细胞内应激损伤，在维持细胞稳态中发挥重要作用。15，因为多项研究表明，细胞应激会促进细胞外囊泡（EV）的分泌。例如，在细胞暴露于缺氧、内质网应激、氧化应激、机械应激、香烟烟雾提取物以及颗粒物空气污染后，均已报道EV释放增加16,17,18,19,20,21,22。EV 的释放也已被证明会受到修饰 体内 高脂饮食或禁食16小时的小鼠释放的脂肪细胞EVs增多23为了研究特定处理或条件是否改变细胞外囊泡（EV）的释放，必须准确测定EV的数量。对EV大小分布的评估还可能提示EV的主要亚细胞来源（例如，晚期内体/多泡体与质膜融合 versus 质膜出芽）。24因此，需要有可靠的方法来准确测量所研究的EV制备物的总浓度及其粒径分布。
一种快速且高度灵敏的溶液中细胞外囊泡（EVs）可视化与表征方法是纳米颗粒追踪分析（NTA）。该方法的原理以及与其他EVs粒径和浓度检测方法的比较此前已有详细阐述25,26,27,28。简而言之，在NTA检测过程中，当EVs被激光束照射时，通过其散射的光进行可视化。散射光经显微镜聚焦到相机上，记录颗粒的运动轨迹。NTA软件追踪每个颗粒的随机热运动（即布朗运动），以确定扩散系数，并利用斯托克斯-爱因斯坦方程计算每个颗粒的粒径。NTA首次应用于生物样本中EVs的检测是在2011年25。直到最近，仅有两家主流公司提供商用NTA仪器29，随后ViewSizer 3000（下文简称颗粒追踪仪器）的推出，通过结合创新的硬件与软件解决方案，克服了其他NTA技术的重大局限性。
粒子追踪仪器通过分析液体样品中纳米颗粒的布朗运动来表征其特性，并通过分析微米级较大颗粒的重力沉降来表征其特性。该仪器独特的光学系统包含三个激光光源（波长分别为450 nm、520 nm和635 nm）的多光谱照明，使研究人员能够同时分析多种粒径范围的颗粒（如外泌体、微囊泡）。图1展示了该仪器的装置示意图。
本文展示了如何利用一种新型纳米颗粒跟踪分析仪，对分离的小鼠和人源细胞外囊泡（EVs）进行粒径分布和浓度测定。
<img alt="用于450-635 nm波长多色显微成像的光学装置示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62447/62447fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：颗粒追踪仪光学系统。 纳米颗粒跟踪分析仪（NTA）使用三种不同波长的激光照射颗粒，分别为：450 nm、520 nm 和 635 nm。通过位于比色皿90°方向的数码摄像机检测并追踪单个颗粒散射的光信号，进行视频记录。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62447/62447fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>1X dPBS</td><td>VWR</td><td>02-0119-1000</td><td>用于稀释样品</td></tr><tr><td>100 nm 乳胶微球标准品</td><td>Thermo Scientific</td><td>3100A</td><td>用于测试 ViewSizer 3000 的校准</td></tr><tr><td>400 nm 乳胶微球标准品</td><td>Thermo Scientific</td><td>3400A</td><td>用于测试 ViewSizer 3000 的校准</td></tr><tr><td>离心过滤单元</td><td>Amicon</td><td>UFC901024</td><td>用于过滤 PBS 稀释液</td></tr><tr><td>收集管，2 mL</td><td>Qiagen</td><td>19201</td><td>用于人血浆细胞外囊泡的分离</td></tr><tr><td>压缩空气除尘器</td><td>DustOff</td><td>DPSJB-12</td><td>用于清洁比色皿</td></tr><tr><td>比色皿插件</td><td>HORIBA Scientific</td><td>-</td><td>随 ViewSizer 3000 购买时提供</td></tr><tr><td>比色皿定位夹具</td><td>HORIBA Scientific</td><td>-</td><td>在将插件放入比色皿时用于固定磁力搅拌子；随 ViewSizer 3000 购买时提供</td></tr><tr><td>去离子水</td><td>VWR</td><td>02-0201-1000</td><td>用于清洁比色皿</td></tr><tr><td>配备显示器、键盘、鼠标及所有必要线缆的台式计算机</td><td>Dell</td><td>-</td><td>随 ViewSizer 3000 购买时提供</td></tr><tr><td>乙醇（70–100%）</td><td>Millipore Sigma</td><td>-</td><td>用于清洁比色皿</td></tr><tr><td>ExoQuick ULTRA</td><td>System Biosciences</td><td>EQULTRA-20A-1</td><td>用于人血浆细胞外囊泡的分离</td></tr><tr><td>带盖玻璃闪烁小瓶</td><td>Thermo Scientific</td><td>B780020</td><td>用于清洁比色皿</td></tr><tr><td>&quot;Hook&quot; 工具</td><td>Excelta</td><td>-</td><td>随 ViewSizer 3000 购买时提供</td></tr><tr><td>无尘超细纤维布</td><td>Texwipe</td><td>TX629</td><td>用于清洁比色皿及覆盖工作台面</td></tr><tr><td>微量离心管，2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22363344</td><td>用于人血浆细胞外囊泡的分离</td></tr><tr><td>搅拌子</td><td>Sp Scienceware</td><td>F37119-0005</td><td></td></tr><tr><td>带盖 Suprasil 石英比色皿</td><td>Agilent Technologies</td><td>AG1000-0544</td><td>初次购买 ViewSizer 3000 时提供</td></tr><tr><td>ViewSizer 3000</td><td>HORIBA Scientific</td><td>-</td><td>纳米颗粒追踪分析仪</td></tr></tbody></table>

纳米颗粒追踪分析用于细胞外囊泡的定量与粒径测定

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

细胞外囊泡（EVs）的生理与病理生理作用日益受到重视，使得EV研究领域迅速发展。目前存在多种EV分离方法，每种方法在EV的下游得率和纯度方面各有优缺点。因此，对采用特定方法从特定来源分离得到的EV样本进行表征，对于正确解读下游实验结果以及不同实验室间结果的比较至关重要。目前已有多种方法可用于测定EV的大小和数量，这些参数可能因疾病状态或对外部条件的响应而发生变化。纳米颗粒追踪分析（NTA）是用于单个EV高通量分析的重要技术之一。本文介绍了一种利用NTA领域重大技术突破的新型仪器，对从小鼠围生殖腺脂肪组织和人血浆中分离的EV进行定量和粒径测定的详细实验方案。结果表明，该方法可对采用不同方法从不同来源分离的EV提供可重复且可靠的总颗粒浓度和粒径分布数据，并已通过透射电子显微镜得到验证。该仪器在NTA中的应用将有助于推动NTA方法的标准化，提升EV研究的严谨性和可重复性。

在本演示之前，首先通过测量聚苯乙烯微球标准品的粒径分布来验证仪器的校准情况，以确保所获取数据的有效性。我们使用本方案推荐的默认记录参数和处理设置，测试了100 nm和400 nm微球的粒径分布（图8）。
对于100 nm的聚苯乙烯微球标准品，测得浓度为4.205 × 107 个颗粒/mL。平均粒径（标准差，SD）为102（±17）nm，变异系数（CV）为0.16。D10/D50/D90值分别为76/104/126 nm。这表明粒子追踪仪器对100 nm单分散微球的粒径报告准确。对于400 nm的聚苯乙烯微球标准品，浓度为4.365 × 107 个颗粒/mL。平均粒径（SD）为391（±47）nm，CV为0.12。D10/D50/D90值分别为150/358/456 nm（表3）。尽管报告的平均粒径与微球的实际尺寸非常接近，但可以看出本方案中所用的仪器设置对约100 nm的小颗粒更为准确。因此，对于大于400 nm的颗粒，建议优化激光参数。研究人员...

我们演示如何使用一种新型纳米颗粒跟踪分析仪器，来估算从小鼠围生殖腺脂肪组织和人血浆中分离出的细胞外囊泡的粒径分布及总颗粒浓度。

细胞外囊泡（EVs）的生理与病理生理作用日益受到重视，使得EV研究领域成为一个快速发展的……

纳米颗粒追踪分析（NTA）结果极易受到操作者偏差的影响。本实验方案展示了不同NTA参数设置对所得结果的影响。采用标准化方法将有助于提高NTA分析的严谨性和可重复性。在比色皿中分析样品可确保在每段视频中捕获具有统计随机性的样品，从而获得更可重复的数据，并实现对粒径范围较宽的颗粒进行可视化观察。由于获得推荐颗粒浓度范围内的样品可能存在困难，务必进行系列稀释以确定最佳稀释倍数。演示该实验步骤的是来自安东尼·费兰特实验室的博士研究生 Kungheng Cai。为准备用于纳米颗粒跟踪分析的比色皿，需使用无尘材料覆盖工作台面，以防止纤维进入比色皿中。佩戴手套后，将含有搅拌子的比色皿放置于磁力比色皿支架上。使用钩状工具将插入件放入比色皿中，确保插入件的缺口在比色皿前方可见。用移液器通过插入件上的孔缓慢加入400至500 µL纯化的细胞外囊泡至比色皿中，并通过轻柔吹打混匀样品，避免引入气泡。然后盖上比色皿盖，必要时轻敲去除气泡，并使用无尘布擦拭比色皿外表面。为分析稀释液或样品的颗粒浓度，打开计算机工作站和仪器，启动颗粒追踪分析程序。当系统提示时，单击 NTA 并打开记录选项卡。按照屏幕上的说明填写所有必要的样品信息。进行细胞外囊泡（EV）追踪分析时，将稀释液设置为 PBS。盐度将自动填充为9%。要获得稀释液或样品的颗粒浓度，请打开仪器盖子，取下覆盖在比色皿放置位置的保护帽。将比色皿以正确方向插入仪器中，确保插槽朝向摄像头，然后重新装上保护帽并关闭仪器盖。单击流媒体箭头以开启摄像头，再单击下拉箭头以展开记录设置。调节焦距，直至相对较小的颗粒清晰可见。为设置小细胞外囊泡（EV）定量分析，请将帧率设为30帧/秒，曝光时间设为15毫秒，搅拌时间为5秒，等待时间为3秒，蓝色、绿色和红色激光功率分别设为210、12和8毫瓦，每段视频的帧数设为300，增益设为30分贝。再次调节焦距，直至相对较小的颗粒清晰可见。提高放大倍数和/或增益有助于颗粒聚焦。但如果增加了增益，请记得在开始录制前将其设为30分贝。一旦颗粒聚焦清晰，将放大倍数设为0.5X，以节省带宽并防止丢帧，然后点击“录制”按钮开始录制视频。当出现提示框表明视频已录制完成时，单击“确定”以完成录制，并选择“处理”选项卡。如果在录制过程中任何视频中可见非常大的颗粒，请导航至录制视频的目录，并在处理前删除任何有问题的视频。勾选“禁用音频检测覆盖”复选框，并将特征直径设置为 30。单击“处理”以启动视频处理并查看实时分布图。处理完成后，单击“确定”并选择“图表”选项卡。对于EVs，将主图表显示为对数分箱二氧化硅。该图的其他功能，例如更改横轴以设定生成图形的积分面积，均可自定义。如需创建结果的 PDF 报告，请点击报告按钮。系统将显示经稀释因子和分布宽度校正后的平均值、中位数、众数尺寸及浓度。在检测任何样品之前，应先对稀释液进行NTA分析，以便从EV样品的颗粒浓度中扣除该空白值。分析结束后清洗比色皿时，需将比色皿排空，并用去离子水彻底冲洗10至15次，再用70%至100%乙醇冲洗三次，以去除任何残留样品。使用无绒微纤维布擦干比色皿外壁，并用压缩空气除尘器吹干内壁。为清洗插入件和搅拌子，将材料放入含有70%至100%乙醇的玻璃闪烁瓶中，并剧烈振荡瓶子。随后，在去离子水中振荡冲洗插入件和搅拌子，并使用无绒布将其干燥。干燥后，立即把所有洁净的部件放入储存容器中，直至下次分析使用。在进行分析之前，使用聚苯乙烯微球检测仪器校准，以确保所获取数据的有效性。如观察结果所示，颗粒追踪仪器准确报告了100纳米单分散微球的尺寸，但仅近似报告了400纳米微球的尺寸。因此，本实验方案的仪器设置对较小颗粒（尺寸接近100纳米）更为准确。采用这些设置时，报告的颗粒浓度随稀释倍数成比例变化，表明该仪器能够准确检测不同稀释度下的颗粒浓度，且技术重复样本之间的变异较小。对于浓度为每毫升4.41 × 10¹⁰个颗粒的小鼠组织来源EV样本，最佳稀释倍数确定为1,000至3,000倍之间。在此分析中，提高增益可增强相机的灵敏度，从而有助于可视化更多数量的较小颗粒。在保持绿光和红光激光功率不变的情况下，将蓝光激光功率从70毫瓦增加到210毫瓦，导致报告的平均粒径从122纳米减小至105纳米，同时报告的总颗粒浓度从1.1 × 10⁸增加至1.7 × 10⁸。增加红光激光功率导致报告的平均粒径从175纳米增大至246纳米，同时报告的总颗粒浓度降低。增加绿光激光功率则导致报告的平均粒径减小，而报告的总颗粒浓度增加。为使样本处于最佳检测范围而确定合适的稀释倍数，通常需要对每个样本进行数次尝试。比色皿的清洗也需要格外小心地操作。我们建议采用多种正交方法对细胞外囊泡（EV）的粒径和浓度进行测量。还可采用动态光散射、电阻脉冲传感、透射电子显微镜以及单颗粒干涉反射成像传感等方法对细胞外囊泡（EVs）进行表征。

nanoparticle-tracking-analysis-for-quantification-size-determination

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

细胞外囊泡的量化和尺寸测定纳米粒子跟踪分析

本文介绍了一种从全血中分离外泌体，并利用半自动仪器通过纳米颗粒追踪技术进行进一步分析的方法。该技术为液体悬浮液中颗粒的可视化与分析提供了极为灵敏的方法。...

一种用于外泌体定量与粒径测量的创新方法

细胞外囊泡在生理和病理过程中发挥重要作用，包括凝血、免疫反应以及癌症，也可作为药物递送或再生医学中潜在的治疗剂。本方案介绍了利用可调电阻脉冲传感技术对多种液体中已分离和未分离的细胞外囊泡进行定量和粒径表征的方法。...

使用可调电阻脉冲传感技术对外泌体囊泡进行定量和粒径分析

在本实验方案中，我们描述了从人全血中快速分离细胞外囊泡并通过基于荧光的纳米颗粒追踪分析对特定标志物进行表征的完整流程。所展示的结果具有高度可重复性，且该方法可调整用于细胞培养上清液的分析。...

基于纳米颗粒示踪分析的单个细胞外囊泡在人血中快速荧光表征

本方案描述了一种可重复的方法，专为使用细胞培养上清液检测小细胞外囊泡（EV）表面表位而设计。该方法利用与识别表面抗原CD9、CD63和CD81的抗体偶联的磁珠，对EV进行特异性免疫沉淀。本方法已针对后续的流式细胞术分析进行了优化。...

细胞条件培养基中外泌体的流式细胞术分析

纳米颗粒追踪分析（NTA）是一种广泛用于表征细胞外囊泡的方法。本文重点介绍了NTA实验参数与对照，以及分析和表征样品及稀释液的统一方法，这些内容是对MISEV2018和EV-TRACK指南的必要补充，以实现实验室间的可重复性。...

提高可重复性以符合《2018年细胞外囊泡研究最低信息标准》中的纳米颗粒追踪分析指南

最新一代的细胞外囊泡（EV）表征工具能够同时对单个EV的多个参数进行分析。纳米流式细胞术可对大于45...

单个细胞外囊泡跨膜蛋白的纳米流式检测表征

本文提出了一种新一代的多参数分析平台，可提高细胞外囊泡亚群表征的通量。该方法结合了多重生物传感技术与原子力显微镜的计量学和形貌力学分析，并耦合拉曼光谱，用于对捕获在微阵列生物芯片上的囊泡靶标进行定性分析。...

基于多重表面等离子体共振成像芯片的多模态分析平台用于细胞外囊泡亚群分析

本方案通过优化空气喷雾喷嘴尺寸、鞘液压力、样品流压力、电压、增益和触发阈值等参数，提供了一种快速且基于尺寸特异性的外泌体小细胞外囊泡分离方法。...

优化流式细胞分选参数以实现小细胞外囊泡的高通量分离与纯化

本文介绍了一种分离、表征和定量人血浆来源的细胞外囊泡（EV）的方法，并提供了一个利用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）对EV蛋白质组进行无标记分析的工作流程。...

用于心血管生物标志物发现的血浆来源细胞外囊泡的分离、表征及蛋白质组学分析

本方案描述了从小鼠骨骼肌和骨髓中分离小细胞外囊泡的方法，该方法结合酶消化和尺寸排阻色谱技术，能够从结构复杂且产量较低的组织中可重复地回收富含囊泡的组分，用于后续分子分析。...

通过尺寸排阻色谱法从小鼠骨骼肌和骨髓中分离小细胞外囊泡

了解使用纳米粒子跟踪分析技术对细胞外囊泡进行定量化和尺寸测定的标准化实验方案。该方法通过优化仪器参数设置，有效减少操作者偏差，提高数据的可重复性和准确性，适用于小鼠脂肪组织和人类血浆等多种生物样本来源的细胞外囊泡表征分析。

纳米颗粒追踪分析用于细胞外囊泡的定量与粒径测定

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