纳米颗粒追踪分析用于细胞外囊泡的定量与粒径测定
2021年3月28日
我们演示如何使用一种新型纳米颗粒跟踪分析仪器，来估算从小鼠围生殖腺脂肪组织和人血浆中分离出的细胞外囊泡的粒径分布及总颗粒浓度。
纳米颗粒追踪分析（NTA）结果极易受到操作者偏差的影响。本实验方案展示了不同NTA参数设置对所得结果的影响。采用标准化方法将有助于提高NTA分析的严谨性和可重复性。
在比色皿中分析样品可确保在每段视频中捕获具有统计随机性的样品，从而获得更可重复的数据，并实现对粒径范围较宽的颗粒进行可视化观察。由于获得推荐颗粒浓度范围内的样品可能存在困难，务必进行系列稀释以确定最佳稀释倍数。
演示该实验步骤的是来自安东尼·费兰特实验室的博士研究生 Kungheng Cai。为准备用于纳米颗粒跟踪分析的比色皿，需使用无尘材料覆盖工作台面，以防止纤维进入比色皿中。佩戴手套后，将含有搅拌子的比色皿放置于磁力比色皿支架上。
使用钩状工具将插入件放入比色皿中，确保插入件的缺口在比色皿前方可见。用移液器通过插入件上的孔缓慢加入400至500 µL纯化的细胞外囊泡至比色皿中，并通过轻柔吹打混匀样品，避免引入气泡。然后盖上比色皿盖，必要时轻敲去除气泡，并使用无尘布擦拭比色皿外表面。为分析稀释液或样品的颗粒浓度，打开计算机工作站和仪器，启动颗粒追踪分析程序。
当系统提示时，单击 NTA 并打开记录选项卡。按照屏幕上的说明填写所有必要的样品信息。进行细胞外囊泡（EV）追踪分析时，将稀释液设置为 PBS。
盐度将自动填充为9%。要获得稀释液或样品的颗粒浓度，请打开仪器盖子，取下覆盖在比色皿放置位置的保护帽。将比色皿以正确方向插入仪器中，确保插槽朝向摄像头，然后重新装上保护帽并关闭仪器盖。单击流媒体箭头以开启摄像头，再单击下拉箭头以展开记录设置。
调节焦距，直至相对较小的颗粒清晰可见。为设置小细胞外囊泡（EV）定量分析，请将帧率设为30帧/秒，曝光时间设为15毫秒，搅拌时间为5秒，等待时间为3秒，蓝色、绿色和红色激光功率分别设为210、12和8毫瓦，每段视频的帧数设为300，增益设为30分贝。再次调节焦距，直至相对较小的颗粒清晰可见。
提高放大倍数和/或增益有助于颗粒聚焦。但如果增加了增益，请记得在开始录制前将其设为30分贝。一旦颗粒聚焦清晰，将放大倍数设为0.5X，以节省带宽并防止丢帧，然后点击“录制”按钮开始录制视频。
当出现提示框表明视频已录制完成时，单击“确定”以完成录制，并选择“处理”选项卡。如果在录制过程中任何视频中可见非常大的颗粒，请导航至录制视频的目录，并在处理前删除任何有问题的视频。勾选“禁用音频检测覆盖”复选框，并将特征直径设置为 30。
单击“处理”以启动视频处理并查看实时分布图。处理完成后，单击“确定”并选择“图表”选项卡。对于EVs，将主图表显示为对数分箱二氧化硅。
该图的其他功能，例如更改横轴以设定生成图形的积分面积，均可自定义。如需创建结果的 PDF 报告，请点击报告按钮。系统将显示经稀释因子和分布宽度校正后的平均值、中位数、众数尺寸及浓度。
在检测任何样品之前，应先对稀释液进行NTA分析，以便从EV样品的颗粒浓度中扣除该空白值。分析结束后清洗比色皿时，需将比色皿排空，并用去离子水彻底冲洗10至15次，再用70%至100%乙醇冲洗三次，以去除任何残留样品。使用无绒微纤维布擦干比色皿外壁，并用压缩空气除尘器吹干内壁。
为清洗插入件和搅拌子，将材料放入含有70%至100%乙醇的玻璃闪烁瓶中，并剧烈振荡瓶子。随后，在去离子水中振荡冲洗插入件和搅拌子，并使用无绒布将其干燥。干燥后，立即把所有洁净的部件放入储存容器中，直至下次分析使用。
在进行分析之前，使用聚苯乙烯微球检测仪器校准，以确保所获取数据的有效性。如观察结果所示，颗粒追踪仪器准确报告了100纳米单分散微球的尺寸，但仅近似报告了400纳米微球的尺寸。因此，本实验方案的仪器设置对较小颗粒（尺寸接近100纳米）更为准确。
采用这些设置时，报告的颗粒浓度随稀释倍数成比例变化，表明该仪器能够准确检测不同稀释度下的颗粒浓度，且技术重复样本之间的变异较小。对于浓度为每毫升4.41 × 10¹⁰个颗粒的小鼠组织来源EV样本，最佳稀释倍数确定为1,000至3,000倍之间。在此分析中，提高增益可增强相机的灵敏度，从而有助于可视化更多数量的较小颗粒。
在保持绿光和红光激光功率不变的情况下，将蓝光激光功率从70毫瓦增加到210毫瓦，导致报告的平均粒径从122纳米减小至105纳米，同时报告的总颗粒浓度从1.1 × 10⁸增加至1.7 × 10⁸。增加红光激光功率导致报告的平均粒径从175纳米增大至246纳米，同时报告的总颗粒浓度降低。增加绿光激光功率则导致报告的平均粒径减小，而报告的总颗粒浓度增加。
为使样本处于最佳检测范围而确定合适的稀释倍数，通常需要对每个样本进行数次尝试。比色皿的清洗也需要格外小心地操作。我们建议采用多种正交方法对细胞外囊泡（EV）的粒径和浓度进行测量。
还可采用动态光散射、电阻脉冲传感、透射电子显微镜以及单颗粒干涉反射成像传感等方法对细胞外囊泡（EVs）进行表征。
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概述
本文介绍了一种利用纳米颗粒追踪分析（NTA）对外泌体（EVs）进行定量和粒径测定的详细实验方案。该方案强调了标准化NTA参数的重要性，以提高外泌体研究的严谨性和可重复性，并展示了NTA设置改变对数据质量的影响。本方法使用从小鼠围生殖腺脂肪组织和人血浆中分离的外泌体进行验证，结果经透射电子显微镜确认。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞外囊泡研究
- 纳米颗粒追踪分析
- 分析生物化学
背景
- 细胞外囊泡在生理和病理生理过程中发挥重要作用。
- 存在多种细胞外囊泡分离方法，每种方法均会影响得率和纯度。
- 对细胞外囊泡制备物进行准确表征，对于实验可重复性和跨实验室比较至关重要。
- 纳米颗粒跟踪分析（NTA）是一种广泛用于高通量细胞外囊泡分析的技术，但其结果对操作者技术和仪器设置较为敏感。
研究目的
- 提供一种基于纳米颗粒跟踪分析（NTA）的细胞外囊泡定量和粒径测定的标准化、可重复的实验方案。
- 演示如何通过调整NTA参数影响测量结果。
- 利用来自不同生物来源的细胞外囊泡对该实验方案进行验证。
使用的方法
- 使用比色皿制备EV样品时需小心操作，避免污染。
- 进行系列稀释以获得适合纳米颗粒追踪分析（NTA）的粒子浓度。
- 详细设置NTA仪器参数（帧率、曝光时间、激光功率、增益等）。
- 使用已知尺寸的聚苯乙烯微球对仪器进行校准。
- 利用NTA软件进行数据采集、处理与报告生成。
- 分析完成后彻底清洗比色皿及附件。
- 通过透射电子显微镜验证结果，并建议采用正交方法（如动态光散射、电阻脉冲感应）进行补充验证。
主要结果
- 操作者偏差和NTA参数变化会显著影响EV的大小和浓度测量结果。
- 基于比色皿的标准化分析可在较宽的粒径范围内获得可重复的数据。
- 仪器校准对较小颗粒（约100 nm）的准确性高于较大颗粒。
- 调整激光功率和增益会改变报告的颗粒大小和浓度。
- 最佳稀释度对准确定量至关重要；技术重复样本显示变异度较低。
结论
- NTA 实验方案的标准化对于严谨且可重复的细胞外囊泡研究至关重要。
- 所述方法可从多种来源获得可靠的细胞外囊泡大小和浓度数据。
- 建议采用互补的分析技术对细胞外囊泡进行全面表征。
常见问题
行业重要性概述
细胞外囊泡（EV）的可靠定量与粒径分析对于早期发现和转化研究至关重要，因为EV的特征可以反映疾病状态及治疗反应。纳米颗粒追踪分析（NTA）可实现高通量、定量的EV表征，但必须进行标准化，以确保结果的可重复性以及不同实验室之间的可比性。本方案针对EV分析中的关键挑战，支持生物制药研发中的预测性判断与项目决策。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 通过提供定量的细胞外囊泡（EV）浓度和尺寸数据，实现严格的假设检验。
- 通过在不同样本间可重复地测量EV特性，支持生物学层面的风险降低。
- 通过将EV特征谱与疾病或治疗状态相关联，促进功能靶点的验证。
筛选与检测方法开发
- 为后续筛选和机制分析制备经过验证的细胞外囊泡（EV）样本。
- 标准化分析条件，以确保定量结果的可重复性和可比性。
- 实现对化合物在EV释放或组分方面效应的可靠评估。
转化与临床前研究
- 将细胞外囊泡（EV）分析与疾病相关生物标志物的发现和验证相结合。
- 通过支持一致的EV检测，实现从发现到临床前研究的连续性。
- 通过实现可靠的跨研究和跨机构数据整合，降低转化医学风险。
流程与工作流整合
基于NTA的EV定量与粒径分析适用于从发现到临床前研究的连续过程，可支持早期假设验证及转化生物标志物的开发。
- 发现生物学：提供定量的EV数据，用于阐明通路并降低机制研究中的风险。
- 筛选：提供标准化、可重复的EV测量结果，用于检测就绪性评估和化合物评价。
- 分析：生成粒径分布和浓度输出结果，支持不同条件间的稳健统计比较。
- 转化研究：在EV与疾病相关时，支持生物标志物的对接以及临床前研究的连续性。
- 企业级复用：建立标准化、可重复使用的EV分析工作流程，适用于不同项目和地点。
运营与企业影响
- 科学价值：提高基于细胞外囊泡（EV）研究的预测可信度，降低机制上的模糊性。
- 操作价值：增强EV分析的可重复性、标准化程度和可扩展性。
- 战略价值：通过降低生物学风险，改善决策推进（go/no-go）判断和资本使用效率。
- 项目组合影响：实现基于风险调整的EV相关项目的优先排序与推进。
实施注意事项
- 需要具备细胞外囊泡（EV）分离、纳米颗粒跟踪分析（NTA）操作及数据分析方面的专业知识。
- 需要使用经过校准的NTA仪器及相关分析基础设施。
- 要求不同团队在样本制备和分析参数方面进行严格统一的标准化。
- 针对不同类型的样本，可能需要调整稀释和清洗方案。
- 对于较小颗粒的检测准确性较高；建议结合正交方法以实现对EV的全面表征。
生物制药常见问题
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:58
Cuvette Preparation
1:53
Particle Tracking Instrument Preparation and Nanoparticle Tracking Analysis
4:01
NTA Data Processing, Display, and Interpretation
5:29
Cuvette Cleaning
6:33
Results: Using a Novel NTA Instrument to Estimate EV Size Distribution and Total Particle Concentration
8:33
Conclusion
