细胞外囊泡的量化和尺寸测定纳米粒子跟踪分析
2021年3月28日
我们演示了如何使用新型纳米粒子跟踪分析仪器来估计从小鼠围产层组织和人类血浆中分离出来的细胞外囊泡的大小分布和总颗粒浓度。
NTA 结果非常容易出现操作员偏差。此协议演示了更改 NTA 参数对已获得的结果的影响。标准化方法将有助于提高 NTA 分析的严谨性和可重复性。
分析 cuvette 中的样本允许在每个视频中捕获统计随机样本。这可产生更可重复的数据和各种尺寸的粒子可视化。由于在推荐的粒子浓度范围内获取样品可能很困难，因此一定要进行连续稀释，以确定理想的稀释因子。
安东尼·费兰特实验室的博士生蔡坤恒将演示这一程序。要为纳米粒子跟踪分析做好准备，请使用无绒毛材料覆盖工作空间，以防止纤维进入幼崽。戴着手套，将装有搅拌棒的夹具放在磁性小插曲上。
使用钩形工具将插入插入到库维特中，插入的插口在库维特前面可见。使用移液器将 400 到 500 微升纯化的细胞外囊塞慢慢添加到切口上，通过插入孔，通过轻轻的管道混合样品，而不引入气泡，然后盖住小面包，根据需要敲出气泡，并使用无绒布擦拭切口的外部表面。要分析稀释剂或样品的颗粒浓度，请打开计算机工作站和仪器，启动粒子跟踪分析程序。
提示时，单击 NTA 并打开录制选项卡。按照屏幕上的说明填写所有必要的示例信息。对于 EV 跟踪分析，将稀释剂设置为 PBS。
盐度将自动填充到 9% 为了获得稀释物或样品颗粒浓度，请打开仪器盖并取下将 cuvette 放置位置的保护盖。将 cuvette 以正确的方向加载到仪器中，插入器的插件朝面向摄像机，并更换盖子和仪表盖。单击流箭头打开相机并单击雪佛龙箭头以扩展记录设置。
调整对焦，直到相对较小的颗粒清晰可见。要设置小 EV 量化分析，将帧速率设置为每秒 30 帧，曝光时间设置为 15 毫秒，搅拌时间设置为 5 秒，等待时间设置为 3 秒，蓝色、绿色和红色激光动力分别设定为 210、12 和 8 毫瓦，每个视频的帧数设置为 300，增益到 30 分贝。调整对焦，直到相对较小的颗粒清晰可见。
增加变焦和/或增益有助于粒子对焦。但是，如果您增加增益，请记住在录制前将其设置为 30 分贝。一旦粒子处于焦点状态，将变焦设置设置设置为 0.5 倍，以节省带宽并防止丢失帧并单击记录以开始录制视频。
当提示显示已录制视频时，单击"确定"以完成录制并选择过程选项卡。如果在录制时任何视频中都可以看到非常大的颗粒，请导航到录制的视频目录，并在处理之前删除任何有问题的视频。检查禁用音频检测覆盖框，并将功能直径设置为 30。
单击过程以启动视频处理并查看实时分布图。处理完成后，单击"确定"并选择绘图选项卡。对于电动汽车，将主图表显示为日志箱二氧化硅。
图形的其他功能，如更改 x 轴以设置所生成图形的集成区域，可以自定义。要创建结果的 PDF 报告，请单击报告按钮。将显示因稀释因子和分布宽度的平均值、中位数、模式大小和浓度调整。
在任何样品之前应执行二分红的 NTA，以便从 EV 样品颗粒浓度中减去此空白的浓度。要在分析后清洁幼崽，清空幼虫，用去离子水将幼崽完全填满 10 到 15 次，用 70 到 100% 乙醇将三次切除任何残留样品。用无绒毛纤维布干燥幼虫的外部，用压缩空气除尘器干燥内部。
要清洁插入物和搅拌条，将材料放入含有 70 至 100% 乙醇的玻璃闪烁小瓶中，并大力摇动小瓶。然后冲洗插入物，在去离子水中搅拌棒，如所示，摇晃，然后用无绒布将其晾干。干燥后，立即将所有清洁部件放入存储，直到下一次分析。
在进行分析之前，使用聚苯乙烯珠测试仪器校准，以确保获得的数据的有效性。据观察，粒子跟踪仪器准确地报告了100纳米的马诺分散珠的大小，但只密切报告了400纳米珠子的大小。因此，此协议的仪器设置对于体积接近 100 纳米的较小粒子更准确。
使用这些设置，报告的粒子浓度相应地与稀释因子相符，表明仪器能够在各种稀释时准确检测粒子浓度，而技术复制器之间变化不大。每毫升小鼠组织衍生EV样本中4.41倍10至10个粒子的最佳稀释量被确定为1000至3000粒。在此分析中，增加增益可提高相机的灵敏度，从而增加更小颗粒的可视化性。
将蓝色激光功率从 70 毫瓦增加到 210 毫瓦，同时保持绿色和红色激光功率不变，将报告的平均粒子大小从 122 纳米增加到 105 纳米，并将报告的总粒子浓度从 1.1 倍 10 增加到第八倍，从 10 倍增加到第八倍。增加红色激光的功率使报告的平均粒子大小从175纳米增加到246纳米，并降低了报告的总粒子浓度。增加绿色激光功率导致报告的平均粒子大小减少，报告的总粒子浓度增加。
找到合适的稀释，将样品置于最佳检测范围内，可能需要为每个样品尝试几次。库维特清洁还需要格外小心的处理。我们建议在EV粒子大小和浓度测量中应用多种正交方法。
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概述
本研究探讨了使用一种新型纳米粒子跟踪分析（NTA）仪器来估算从小鼠睾旁脂肪组织和人类血浆中分离出的细胞外囊泡（EV）的大小分布和总粒子浓度。标准化方法强调了NTA分析中严谨性和可重复性的重要性。
关键研究组成部分
研究领域
- 纳米粒子跟踪分析
- 细胞外囊泡
- 客观量化
背景
- 提出减少NTA结果中操作者偏差的协议
- 强调在分析中实现最佳粒子浓度的挑战
- 重视方法性准备和分析的重要性
使用的方法
- 纳米粒子跟踪分析来量化细胞外囊泡
- 小鼠睾旁脂肪组织和人类血浆作为生物样品
- 使用特定的比色皿准备和稀释技术
主要结果
- 成功展示了提高数据可重复性的方法
- 建立了分析EV浓度的最佳稀释倍数
- 仪器设置优化以准确测量较小的粒子
结论
- 该研究验证了一个严格的协议，提高了NTA在EV测量中的可靠性。
- 结果支持EV分析的进步，与各种生物学研究应用相关。
常见问题
Executive Industry Relevance
Reliable quantification and sizing of extracellular vesicles (EVs) are critical for early discovery and translational research, as EV characteristics can reflect disease states and therapeutic responses. Nanoparticle tracking analysis (NTA) offers high-throughput, quantitative EV profiling, but standardization is essential to ensure reproducibility and cross-laboratory comparability. This protocol addresses key challenges in EV analytics, supporting predictive confidence and portfolio decision-making in biopharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rigorous hypothesis testing by providing quantitative EV concentration and size data.
- Supports biological de-risking through reproducible measurement of EV characteristics across samples.
- Facilitates functional target validation by linking EV profiles to disease or treatment conditions.
Screening & Assay Development
- Prepares validated EV samples for downstream screening and mechanistic assays.
- Standardizes assay conditions to ensure reproducibility and comparability of quantitative outputs.
- Enables reliable evaluation of compound effects on EV release or composition.
Translational & Preclinical Research
- Aligns EV analytics with disease-relevant biomarker discovery and validation.
- Provides continuity from discovery through preclinical studies by supporting consistent EV measurement.
- Reduces translational risk by enabling robust cross-study and cross-site data integration.
Pipeline & Workflow Integration
NTA-based EV quantification and sizing fit within the discovery-to-preclinical continuum, supporting both early-stage hypothesis testing and translational biomarker development.
- Discovery Biology: Delivers quantitative EV data for pathway clarification and mechanistic de-risking.
- Screening: Provides standardized, reproducible EV measurements for assay readiness and compound evaluation.
- Analytics: Generates size distribution and concentration outputs for robust statistical comparison across conditions.
- Translational Research: Supports biomarker alignment and preclinical continuity when EVs are disease-relevant.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, reusable workflow for EV analytics across programs and sites.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in EV-based studies.
- Operational Value: Enhances reproducibility, standardization, and scalability of EV analytics.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by reducing biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of EV-related programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in EV isolation, NTA operation, and data interpretation.
- Needs access to calibrated NTA instrumentation and analytical infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization of sample preparation and analysis parameters.
- May require adaptation of dilution and cleaning protocols for different sample types.
- Accuracy is highest for smaller particles; orthogonal methods are recommended for comprehensive EV characterization.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:58
Cuvette Preparation
1:53
Particle Tracking Instrument Preparation and Nanoparticle Tracking Analysis
4:01
NTA Data Processing, Display, and Interpretation
5:29
Cuvette Cleaning
6:33
Results: Using a Novel NTA Instrument to Estimate EV Size Distribution and Total Particle Concentration
8:33
Conclusion
