Name: 检测荧光纳米粒子的相互作用与原发性免疫细胞亚群流式细胞仪的 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: 学习利用流式细胞术检测荧光纳米粒子与原发性免疫细胞亚群的相互作用。该方法可定量分析淋巴细胞、单核细胞和粒细胞的纳米粒子内化率，为免疫治疗策略提供重要依据。

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本工作由意大利技术研究院基金会资助。 作者感谢德国米尔泰尼生物技术有限公司（Miltenyi Biotec GmbH，德国贝尔吉施格拉德巴赫）对本文稿的赞助，感谢意大利比萨洛蒂医院免疫血液学与输血科 Paolo Petrucciani 博士提供人外周血白细胞层，以及感谢意大利比萨大学生物学系细胞与发育生物学单元 Massimo Pasqualetti 教授提供小鼠饲养条件。

伦理学&#160;声明
人和动物样本的处理遵循意大利卫生部指南、法律116/92以及欧洲共同体理事会指令86/609/EEC的规定。
1. 单核细胞培养
<ol>
	<li>在含有RPMI-1640培养基的T-75培养瓶中培养人THP-1细胞，培养基中添加10%人血清、50 U/ml青霉素、50 mg/ml链霉素和0.05 mM β-巯基乙醇，在37 °C、5% CO2条件下培养。</li>
	<li>当细胞长满时进行传代（每3-5天一次）。</li>
</ol>
2. 从血沉棕黄层中分离外周血单个核细胞（PBMCs）
<ol>
	<li>开始分离实验前，配制磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2）并加入终浓度为 2 mM 的乙二胺四乙酸（EDTA）和 0.5% 牛血清白蛋白（BSA），即向 95 ml 洗涤缓冲液中加入 5 ml BSA 储存液（1:20 稀释）。对缓冲液进行脱气处理，并保持低温（2–8 °C）。 
	重要提示：若未对缓冲液进行脱气，可能导致结果不理想，因为气泡可能堵塞分离柱（参见步骤&#160;3.2）。 
	注意：可选用抗凝剂枸橼酸右旋葡萄糖溶液-A（ACD-A）或枸橼酸磷酸葡萄糖溶液（CPD）替代。此外，其他物种来源的白蛋白或血清可替代 BSA。请勿使用含有 Ca2+ 或 Mg2+ 的缓冲液。</li>
	<li>从健康供者（年龄 20–60 岁）获取血沉棕黄层。</li>
	<li>准备用于密度梯度离心的 50 ml 尖底离心管。根据待处理血液量确定所需离心管数量（每管可处理 35 ml 稀释血液），并在每支空管中加入 15 ml Ficoll-Paque 溶液。</li>
	<li>将 8 ml 血液用 24 ml PBS/BSA/EDTA 溶液稀释（1:4 稀释）。</li>
	<li>将稀释后的血液溶液小心地铺加至各 50 ml 尖底离心管中 Ficoll-Paque 液体（密度 = 1.077 g/ml）的上层。切勿混匀血液与 Ficoll-Paque 溶液。 
	重要提示：为避免血液与 Ficoll-Paque 混合，应将离心管倾斜约 45° 角，并缓慢铺加血液混合液。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 400 × g 离心 30 分钟。单个核细胞（MNCs）将停留在血浆与 Ficoll-Paque 的界面处，而粒细胞和红细胞因密度较高，在 Ficoll-Paque 的渗透压作用下发生沉降。</li>
	<li>将界面层细胞（外周血单个核细胞，PBMCs）转移至含有 PBS/BSA/EDTA 的新 50 ml 离心管中，并在 4 °C 条件下以 300 × g 离心 10 分钟。</li>
	<li>用 PBS/BSA/EDTA 洗涤沉淀物两次，以去除血小板。每次在 4 °C 条件下以 200 × g 离心 10 分钟。</li>
	<li>将细胞接种于含 10% 人血清和抗生素的完全 RPMI-1640 培养基中进行培养，或直接进行单核细胞纯化。</li>
</ol>
3. 从外周血单个核细胞中纯化原代单核细胞
<ol>
	<li>使用人全单核细胞分离试剂盒，通过磁珠分离法从外周血单个核细胞（PBMCs）中分离单核细胞：
	<ol>
		<li>将细胞通过30 µm尼龙筛网（预分离滤器，30 µm）过滤，以去除可能存在的细胞团块。</li>
		<li>使用血细胞计数板确定细胞数量。</li>
		<li>在室温（RT）下以300 × g离心10分钟，彻底吸除上清液。</li>
		<li>每107个总细胞，用30 µl PBS/EDTA/BSA缓冲液重悬细胞沉淀。</li>
		<li>每107个总细胞，加入10 µl FcR阻断试剂。</li>
		<li>每107个总细胞，加入10 µl生物素标记抗体混合液。</li>
		<li>充分混匀，在2–8 °C孵育5分钟。</li>
		<li>每107个总细胞，加入30 µl缓冲液。</li>
		<li>每107个总细胞，加入20 µl抗生物素磁珠（Anti-Biotin MicroBeads）。</li>
		<li>充分混匀，在2–8 °C孵育10分钟。</li>
		<li>将最多108个细胞重悬于500 µl PBS/EDTA/BSA缓冲液中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>磁性分离
	<ol>
		<li>根据总细胞数量，选择合适的MACS柱和MACS分离器（参见MACS柱产品说明书）。</li>
		<li>将柱子置于MACS分离器的磁场中。</li>
		<li>用适当体积的PBS/EDTA/BSA缓冲液冲洗柱子进行预处理（MS柱：500 µl；LS柱：3 ml）。 
		注意：柱子具有&#34;防干流&#34;功能，不可让其变干。</li>
		<li>将细胞悬液加至柱子上，收集流穿液，其中含有未标记细胞，即为富集的单核细胞组分。</li>
		<li>用PBS/EDTA/BSA缓冲液洗涤柱子3次&#160;（每次MS柱500 µl，LS柱3 ml）。</li>
		<li>收集穿过的未标记细胞，即为富集的单核细胞，合并至步骤3.2.4中的流穿液中。 
		注意：只有当柱子储液腔为空时，才可加入PBS/EDTA/BSA缓冲液进行洗涤。</li>
		<li>（可选）将柱子从分离器上取下，放置于合适的收集管上。用移液器将缓冲液加入柱子（MS柱：1 ml；LS柱：5 ml），然后用力将推杆插入柱子，立即冲洗出磁性标记的非单核细胞。</li>
		<li>将纯化的单核细胞在含10%人血清和抗生素的完全RPMI-1640培养基中进行培养。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 从全血中纯化原代单核细胞
<ol>
	<li>使用全血单核细胞分离试剂盒，按照制造商说明书从全血中纯化单核细胞。</li>
</ol>
5. 纳米颗粒在血白细胞和纯化单核细胞中的内化
<ol>
	<li>在12孔板中，每孔加入1 ml分离得到的外周血单个核细胞（PBMCs）或纯化的CD14阳性单核细胞，细胞密度为5 × 105 个细胞/ml。</li>
	<li>涡旋混匀FITC-SiO2纳米颗粒储备液，并用完全培养基重悬至工作浓度100 nM。</li>
	<li>向处理组样品中每孔加入10 µl工作浓度的纳米颗粒悬液（100 nM），使纳米颗粒的终浓度为1 nM；对照组每孔加入等体积的完全培养基。</li>
	<li>孵育1小时以促进细胞内化后，将各孔样品收集至1.5 ml聚丙烯管中，在室温下以6,000 × g离心3分钟。</li>
	<li>用1 ml运行缓冲液重悬细胞沉淀，在室温下以6,000 × g离心3分钟进行洗涤。</li>
	<li>将细胞沉淀用200 µl运行缓冲液重悬，样品即可用于流式细胞术检测。</li>
</ol>
6. 原代混合胶质细胞培养物的分离（参见 Bertero&#160;et al.7）
7. 混合胶质细胞融合培养物的重铺板
<ol>
	<li>用 10 ml 磷酸盐缓冲液（不含 Ca2+/Mg2+）清洗一个 T-75 培养瓶一次，然后加入 10 ml Versene 溶液，在 37 °C 下孵育 5–7 分钟。</li>
	<li>用移液器将上清液反复吹打数次，以使细胞从 T-75 培养瓶表面脱落并分散细胞团块。</li>
	<li>将细胞悬液转移至 15 ml 聚丙烯离心管中。取少量细胞悬液用于血细胞计数板进行细胞计数。</li>
	<li>在室温下以 300 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于胶质细胞完全培养基中，调整终浓度为 5 × 105 个细胞/ml。</li>
	<li>以每孔 0.5 ml 接种至 24 孔板中，于纳米颗粒处理前静置 2–4 小时&#160;，使细胞贴壁。</li>
</ol>
8. 小胶质细胞对纳米颗粒的内化
<ol>
	<li>向每个孔中加入 500 µl 完全胶质细胞培养基（用于未处理对照组）或 500 µl 含 2x&#160;Rhodamine-SiO2 纳米颗粒的完全胶质细胞培养基（用于处理组样本）。</li>
	<li>在选定的时间点用移液器吹打细胞，使非快速贴壁细胞脱落，并将其收集至 2 ml 聚丙烯管中。</li>
	<li>向每个孔中加入 500 µl Versene，将培养板在 37 °C 孵育 5 分钟，然后使剩余的细胞组分脱落，并将每个样本与前一步骤中相应的非贴壁细胞合并收集。</li>
	<li>在室温下以 300 × g 离心 3 分钟。</li>
	<li>将沉淀重悬于 100 µl AutoMACS 运行缓冲液中。</li>
</ol>
9. 使用 CD11b-VioBlue 染色
<ol>
	<li>在运行缓冲液中，向100 µl细胞悬液加入10 µl VioBlue-CD11b人/小鼠抗体（1:11比例），在4 °C孵育10分钟。</li>
	<li>加入1 ml运行缓冲液，并混匀细胞悬液。</li>
	<li>将每个样品以300 × g离心3分钟。</li>
	<li>弃去上清液，并将沉淀重悬于100–150 µl运行缓冲液中。</li>
	<li>将样品上机进行流式细胞仪检测（在最后两个步骤之间可将样品保存于4 °C）。 
	重要：在分析样品前，需对不同荧光染料之间发射光谱重叠的信号进行补偿校正（包括荧光染料偶联的纳米颗粒或抗体）。</li>
</ol>
10. 光谱溢出补偿
<ol>
	<li>打开所有仪器软件程序中均包含的&#34;仪器设置&#34;窗口。 
	注意：如果使用的仪器与材料表中列出的仪器不同，请参考相应仪器的专用手册以获取采集参数详情。</li>
	<li>以低流速（若仪器允许）采集未经处理的样本（不含纳米颗粒）。在采集过程中，通过调节电压通道手动调整前向散射和侧向散射信号（分别为FSC和SSC）。 
	注意：调整SSC和FSC坐标轴的尺度，以便在图中最佳显示完整的细胞群体。可为每种目标细胞类型创建、保存并后续使用相应的仪器设置模板。</li>
	<li>在软件中打开特定的&#34;区域&#34;选项卡。围绕目标细胞群绘制一个适当大小的区域（&#34;门控&#34;）。 
	注意：纳米颗粒的内化会导致细胞SSC信号发生偏移。如果门控范围过于紧密地限定在目标细胞群周围，则采集的数据可能会遗漏部分待检测的细胞。</li>
	<li>使用两个未染色样本，其中一个作为空白样本，另一个用于PI染色的补偿（可选）；另准备每个需补偿荧光通道对应的单一荧光染料标记样本。 
	注意：实验中标记时，每种荧光染料偶联抗体应使用不同的1.5 ml样本管。</li>
	<li>在&#34;仪器设置&#34;窗口中打开&#34;补偿选项卡&#34;。在采集过程中增加或减少补偿系数，直至荧光阳性群体与阴性群体在溢出通道中的荧光强度大致相同。</li>
	<li>完成补偿调节后，采集经纳米颗粒处理的样本。</li>
</ol>

<ol><li>Zhang, X. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+nanomaterials+and+biological+systems%3A+Implications+to+personalized+nanomedicine%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Interactions of nanomaterials and biological systems: Implications to personalized nanomedicine.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 64, 1363-1384 (2012).</li>
<li>Radad, K., Al-Shraim, M., Moldzio, R., Rausch, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+benefits+and+hazards+of+engineered+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Toxicol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Recent advances in benefits and hazards of engineered nanoparticles.</a> Environ. Toxicol. Pharmacol. 34, 661-672 (2012).</li>
<li>Dobrovolskaia, M. A., McNeil, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+properties+of+engineered+nanomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Immunological properties of engineered nanomaterials.</a> Nat. Nanotechnol. 2, 469-478 (2007).</li>
<li>Shi, C., Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+recruitment+during+infection+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Monocyte recruitment during infection and inflammation.</a> Nat. Rev. Immunol. 11, 762-774 (2011).</li>
<li>Sica, A., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+plasticity+and+polarization%3A+in+vivo+veritas%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas.</a> J. Clin. Invest. 122, 787-795 (2012).</li>
<li>Hubbell, J. A., Thomas, S. N., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Materials+engineering+for+immunomodulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Materials engineering for immunomodulation.</a> Nature. 462, 449-460 (2009).</li>
<li>Bertero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+functionalisation+regulates+polyamidoamine+dendrimer+toxicity+on+blood-brain+barrier+cells+and+the+modulation+of+key+inflammatory+receptors+on+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotoxicology%22%5BJournal%5D)">Surface functionalisation regulates polyamidoamine dendrimer toxicity on blood-brain barrier cells and the modulation of key inflammatory receptors on microglia.</a> Nanotoxicology. 8, 158-168 (2013).</li>
<li>Kroll, A., Pillukat, M. H., Hahn, D., Schnekenburger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interference+of+engineered+nanoparticles+with+in+vitro+toxicity+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Interference of engineered nanoparticles with in vitro toxicity assays.</a> Arch. Toxicol. 86, 1123-1136 (2012).</li>
<li>Malvindi, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SiO2+nanoparticles+biocompatibility+and+their+potential+for+gene+delivery+and+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">SiO2 nanoparticles biocompatibility and their potential for gene delivery and silencing.</a> Nanoscale. 4, 486-495 (2012).</li>
<li>Bardi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SiO2+NPs%3A+Promising+Candidates+for+Drug+and+Gene+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Deliv.+Lett%22%5BJournal%5D)">SiO2 NPs: Promising Candidates for Drug and Gene Delivery.</a> Drug Deliv. Lett. 1, 9-12 (2011).</li>
<li>Bardi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biocompatibility+of+amino+functionalized+CdSe%2FZnS+quantum-dot-Doped+SiO2+nanoparticles+with+primary+neural+cells+and+their+gene+carrying+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The biocompatibility of amino functionalized CdSe/ZnS quantum-dot-Doped SiO2 nanoparticles with primary neural cells and their gene carrying performance.</a> Biomaterials. 31, 6555-6566 (2010).</li>
<li>Jung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+fractalkine+receptor+CX%283%29CR1+function+by+targeted+deletion+andgreen+fluorescent+protein+reporter+gene+insertion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion andgreen fluorescent protein reporter gene insertion.</a> Mol. Cell Biol. 20, 4106-4114 (2000).</li>
</ol>

作者声明，Miltenyi Biotech GmbH 赞助了本稿件的提交。HiQ-Nano 公司（<a href="http://www.hiq-nano.com/index.html">http://www.hiq-nano.com/index.html</a>）是一家源自 IIT 的纳米技术衍生公司。

实验方案中有几个非常关键的要点需要注意。在整个染色步骤中，必须在4 °C（冰上）操作，并尽可能避光，因为较高的温度和光照可能对染色效果产生不利影响。纳米颗粒在使用前可进行超声处理，以使其更好地重悬。
正确的流式细胞术分析需要对不同通道进行准确的校准。每次实验前都应校准仪器。除了仪器本身的技术问题外，抗体标记也可能存在问题。必须使用适当浓度的抗体，若浓度过高或过低，均可能导致信号强度不理想。
该技术的缺点在于需要使用单分散样品，且无法定位信号的来源位置（即 不同的细胞区室）。此外，在可联合使用的荧光染料选择上也存在一些限制：激发波长和发射波段必须有足够的分离度，以便进行准确检测。如果所用抗体的光谱发生重叠，则需要进行正确的补偿。
流式细胞术是一种在存在或不存在纳米颗粒的情况下进行细胞分析的强大方法。该技术能够对细胞进行多参数研究，检测大量细胞事件，分析速度快（每秒超过1000个细胞），具有良好的重复性和统计学读数。样品处理过程中可保持细胞活性不丢失。
通过使用荧光标记的纳米颗粒，可以定性和定量分析其在细胞亚群中的内化情况，这些细胞亚群由细胞膜表面表达的特定标志物加以识别。在特定纳米颗粒存在的情况下，细胞参数可能发生改变。根据研究目的的不同，这些变化可用于识别特定现象，例如细胞的侧向散射会随着纳米颗粒内化速率的增加而呈比例地增强。
纳米颗粒诱导的细胞表面改变也可能成为该技术的局限性。因此，必须始终考虑细胞膜受体的更新速率，最好预先了解该参数，以精确表征目标细胞群体。在纳米颗粒过载的样本中，细胞膜渗透功能的严重受损可能导致细胞死亡。
应针对每种细胞群体通过实验验证纳米材料的剂量依赖性毒性。必须从荧光定量分析中明确排除已定义的死亡细胞。例如，Annexin V/PI 染色是常用于检测坏死和凋亡细胞的多种方法之一。
表达GFP的原代细胞也是一种强大的工具，可用于选择特定的细胞亚群并收集数据，而无需预先标记。结合互补的荧光纳米颗粒，可实现对细胞-纳米颗粒相互作用的快速而精确的定量分析。未来，通过应用能够在选定组织中释放特定药物负荷的纳米颗粒，有望改善药物或基因递送效果。
将纳米颗粒用作药物制剂的特异性递送载体和/或免疫调节剂，需要了解其生物学环境（即 通过流式细胞术研究细胞与纳米颗粒的相互作用。

如今，工程纳米材料因其在生物医学领域的潜在应用而引起了生命科学家的广泛关注1。多种无机和有机材料可用于制备具有不同形态、物理和化学特性的纳米结构。在这些结构中，球形工程纳米颗粒在诊断和转化医学方面展现出巨大潜力2。其核心与表面设计取决于具体应用，因而需要深入研究纳米颗粒与细胞接触和相互作用后靶细胞的响应。拟用于人体的纳米颗粒将直接与多种免疫细胞接触，而免疫细胞在维持机体完整性方面发挥关键作用，因此成为纳米医学研究中的重要课题3。
先天免疫系统的细胞成分主要由吞噬细胞构成。其中，单核细胞/巨噬细胞谱系来源的细胞（包括中枢神经系统常驻的小胶质细胞）在免疫防御中发挥关键作用4,5。它们在接触异物后数小时内即可启动保护性反应。此外，单核细胞通过释放细胞因子来协调并指导适应性免疫反应。即使在工程材料存在的情况下，这些事件仍会发生，因为免疫系统通常将这些材料识别为&#34;非己&#34;6。 
在免疫学历史上用于细胞分析的方法中，流式细胞术是最强大的工具之一。此外，目前已有可用于鉴定或纯化特定免疫亚群的技术（通常利用某一单一膜蛋白的缺失或存在），从而能够精确研究特定纳米颗粒对某一原代细胞类型的影响&#160;7。然而，细胞在暴露于纳米颗粒后可能出现生理和形态学上的改变。同时，纳米颗粒可能干扰特定的光学参数，例如在特定波长下的光吸收或发射，从而影响实验结果8。因此，在研究新型材料时，应考虑传统免疫学检测方法的使用局限性以及可能需要进行的相应调整。
本研究涉及通过流式细胞术检测纳米颗粒与原代免疫细胞的相互作用。为解决这一问题，采用50 nm的FITC-SiO2纳米颗粒作为模型纳米材料来描述该方法。二氧化硅颗粒可在纳米尺度上以非常精确的方式制备，其尺寸、形状及表面特性（如电荷或疏水性）可被精细调控，以提高其生物相容性9。SiO2纳米颗粒的多种特性使其可作为药物递送颗粒的模型10。此外，荧光染料或量子点可被包埋或连接至这些颗粒上，从而为成像应用提供有用的纳米工具11。

<table><tbody><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14170-088</td><td>37℃预热 &amp;deg;使用前将水浴锅预热至 C</td></tr><tr><td>RPMI-1640（ATCC 改良型）</td><td>Gibco</td><td>A10491-01</td><td>37℃预热 &amp;deg;使用前将水浴锅预热至 C</td></tr><tr><td>DMEM，高糖，酚红</td><td>Gibco</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>Gibco</td><td>15710-049</td><td></td></tr><tr><td>马血清（批号 n&amp;deg; 1131917)</td><td>Gibco</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇</td><td>Gibco</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>2.5% 胰蛋白酶</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>人混合血清</td><td>Invitrogen</td><td>34005100</td><td></td></tr><tr><td>Versene</td><td>Invitrogen</td><td>15040-033</td><td></td></tr><tr><td>DNA酶I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5025-150KU</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-VioBlue 人 &amp;和小鼠</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-336</td><td></td></tr><tr><td>MACS BSA 储存液&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS 冲洗液&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td></td></tr><tr><td>运行缓冲液</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-747</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS 运行缓冲液</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>人Pan单核细胞分离试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-537</td><td></td></tr><tr><td>全血柱提取试剂盒</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-545</td><td></td></tr><tr><td>人全血CD14 MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-879</td><td></td></tr><tr><td>质谱柱</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>LS 柱</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MidiMACS 分离器</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS 分离器</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>红细胞裂解液&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-183</td><td></td></tr><tr><td>预分离滤器 30 &amp;micro;m</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>MACSQuant Analyzer 流式细胞仪</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-197</td><td></td></tr><tr><td>MACSQuant 校准微球</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-607</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Premium</td><td>GE Healthcare</td><td>GEH17544202</td><td></td></tr><tr><td>FITC-SiO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 纳米颗粒（50 nm，+45 mV）</td><td>HiQ-Nano 公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>罗丹明-SiO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 纳米颗粒（50 nm，+45 mV）</td><td>HiQ-Nano 公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>12孔板 Falcon</td><td>Becton Dickinson</td><td>353043</td><td></td></tr></tbody></table>

通过流式细胞术检测荧光纳米颗粒与主要免疫细胞亚群的相互作用

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

工程纳米颗粒具有非常有前景的特性，可用于治疗和诊断目的。本工作描述了一种通过流式细胞术快速且可靠地分析纳米颗粒与免疫细胞相互作用的方法。可通过抗体介导的磁分离技术，从人或小鼠组织中轻松纯化获得原代免疫细胞。首先，流式细胞仪中不同细胞群体可通过前向散射光（FSC，与细胞大小成正比）和侧向散射光（SSC，与细胞内部复杂性相关）加以区分。此外，使用针对特定细胞表面受体的荧光标记抗体，可在同一样本中识别多个亚群。通常，当细胞受到改变其生理和形态状态的外部刺激激活时，这些特征均会发生变化。在此，以50 nm的FITC-SiO2纳米颗粒作为模型，用于识别纳米结构材料在人血免疫细胞中的内化过程。细胞经纳米颗粒孵育后，荧光信号和侧向散射光增强，使我们能够确定纳米颗粒-细胞相互作用的时间和浓度依赖性。此外，该方案还可拓展用于研究Rhodamine-SiO2纳米颗粒与原代小胶质细胞（中枢神经系统常驻免疫细胞）的相互作用，这些小胶质细胞来源于突变小鼠，其单核细胞/巨噬细胞谱系特异性表达绿色荧光蛋白（GFP）。最后，流式细胞术检测到的纳米颗粒内化结果已通过共聚焦显微镜得到验证。

流式细胞术是一种用于鉴定和表征不同细胞的有用工具，也是鉴定特定免疫细胞（如单核细胞、粒细胞、T细胞、B细胞、自然杀伤（NK）细胞、树突状细胞（DCs）以及其他白细胞亚群）的首选技术。
为了更好地表征白细胞对纳米颗粒的响应行为，我们开展了内化实验，所用细胞包括从健康供体血液中分离的原代白细胞（图1 和 图2）以及人单核细胞系（THP-1细胞，图3）。
如图1A所示，在外周血单个核细胞（PBMC）分离后，通过前向散射和侧向散射可清晰识别出三种主要的血液白细胞亚群。此外，经FITC-SiO2处理后，淋巴细胞（灰色）、单核细胞（蓝色）和粒细胞（红色）表现出不同的纳米颗粒内化速率，这通过绿色荧光强度得以体现（图1B）。本方案所述方法可实现从PBMC中纯化出CD14阳性原代单核细胞。图2A展示了在存在FITC-SiO2的条件下CD14+单核细胞的流式细胞术点图。图2B显示了在同一细胞中定量的FITC-SiO2内化情况，并以对数尺度直方图形式表示。
对经不同浓度 FITC-SiO2 纳米颗粒处理的 THP-1 单核细胞进行了类似的内化实验。未处理的细胞作为阴性对照。图3A 显示 THP-1 细胞系的侧向散射呈剂量依赖性增强，而前向散射保持不变。在图3B中，除展示了各 FITC-SiO2 纳米颗粒浓度下侧向散射（SSC）和前向散射（FSC）的直方图外，还提供了平均荧光强度（MFI）的定量结果。这些数据表明，FITC-SiO2 纳米颗粒处理可诱导单核细胞发生剂量依赖性的内化，表现为细胞内颗粒度（侧向散射）和荧光信号（绿色通道）的增强。
为进一步了解免疫细胞与纳米颗粒之间的相互作用类型，分离了原代混合胶质细胞培养物，并纯化了中枢神经系统常驻免疫细胞——小胶质细胞。利用表达绿色荧光蛋白标记的小胶质细胞的转基因小鼠模型，可实现对不同神经炎症机制的可视化观察。转基因小鼠品系 B6.129P-CX3CR1tm1Litt/J 在本研究中用于在 CX3CR1 启动子控制下表达绿色荧光蛋白（GFP）127天后 体外 （体外培养天数），荧光显微镜显示混合型原代胶质细胞培养物，包含大量星形胶质细胞（GFP阴性贴壁细胞）和少量绿色细胞（GFP阳性， 图 5A）。在此小鼠模型中，通过单一CD11b抗体染色的流式细胞术可区分三种胶质细胞亚群：第一类为CD11b-GFP- （星形胶质细胞和其他胶ial细胞），另一群 distinct 的小胶质细胞 CD11b+GFP+ 细胞，以及第三种 CD11b+GFP- 亚群（图 4A）。这两种亚群均能够内化纳米颗粒，其中GFP亚群的内化效率略有提高+ 群体（通过CX3CR1启动子的转录标记巡逻状态的未成熟小胶质细胞），流式细胞术分析结果如所示（图 4B）。可通过共聚焦显微镜使用相同终浓度的Rhodamine-SiO进一步验证发生的内化现象。2 如图所示的纳米颗粒 图 5B.
<img alt="Flow cytometry analysis diagram; scatter plot, histogram showing lymphocyte, monocyte, granulocyte." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图1. FITC-SiO2 分离血白细胞中纳米颗粒的内化 A) 代表性前向散射（FSC） 与 Ficoll-Paque 分离的外周血白细胞的侧向散射（SSC）流式细胞术点图 B) 三种主要血液白细胞亚群在1 nM FITC-SiO存在下的绿色荧光叠加直方图2 纳米颗粒（+45 mV）孵育1小时。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig1highres.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Flow cytometry graph of CD14+ monocytes with FITC-SiO₂ NPs; fluorescence intensity analysis." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
图2. FITC-SiO2 CD14 细胞中纳米颗粒的内化+ 纯化的单核细胞 A) 代表性前向散射（FSC） 与 纯化的CD14阳性单核细胞的侧向散射（SSC）流式细胞术点图 B) 存在1 nM FITC-SiO时纯化单核细胞亚群的绿色荧光直方图2 纳米颗粒（+45 mV）孵育1小时。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig2highres.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Flow cytometry analysis of nanoparticle effects; dot plots and bar graphs of scattering and fluorescence." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
图3. FITC-SiO₂纳米颗粒对细胞活力和细胞周期的影响2 THP-1细胞对纳米颗粒的内化作用 A) 代表性前向散射（FSC） 与 侧向散射（SSC）流式细胞术点图，显示THP-1单核细胞系在暴露于FITC-SiO2 1小时后的散射特征2 纳米颗粒浓度增加。 B) 侧向散射（SSC）、前向散射（FSC）及绿色荧光在存在FITC-SiO时随浓度变化的差异2 纳米颗粒（+45 mV）孵育1小时。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig3highres.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Flow cytometry scatter and histogram plots for GFP microglia analysis; CD11b, GFP, fluorescence data." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
图4. 罗丹明-SiO₂2 纳米颗粒被从B6.129P-品系小鼠分离的原代小胶质细胞摄取CX3CR1tm1Litt/J 小鼠 A) 绿色荧光蛋白（GFP） 与 CD11b-VioBlue 流式细胞术点图，显示从 B6.129P-CX3CR1tm1Litt/J 小鼠。CD11b+GFP+ 和 CD11b+GFP- 种群分别显示在右上象限和右下象限。 B) 小胶质细胞亚群在1 nM Rhodamine-SiO存在下的红色荧光叠加直方图2 纳米颗粒（+45 mV）孵育30分钟（红色直方图） 与 对照组（灰色直方图）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig4highres.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="细胞形态与免疫荧光；显微镜图像；细胞结构分析。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图5"> 
图5. GFP+-小胶质细胞的可视化。 (A) 培养7天时的荧光显微图像，以及(B) GFP+-小胶质细胞摄取罗丹明-SiO2纳米颗粒（红色箭头）的共聚焦显微图像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig5highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>

通过流式细胞术分析纳米颗粒与免疫细胞特定亚群的相互作用。

工程化纳米颗粒具有极具前景的治疗与诊断特性。本研究描述了一种快速且可靠的……

本实验的总体目标是通过流式细胞术检测荧光纳米颗粒与主要免疫细胞亚群之间的相互作用。首先将目标细胞与纳米颗粒共同孵育，随后使用针对细胞特异性表面标志物的抗体对细胞进行标记，最后通过流式细胞术进行分析。最终，可以测量纳米颗粒与单个免疫细胞群体之间的相互作用。与显微镜等现有方法相比，该技术的主要优势在于能够对非黏附性细胞群体中由纳米颗粒引起的荧光强度变化进行定量分析。对于血液白细胞或纯化单核细胞中的纳米颗粒内化实验，首先将目标细胞以每孔1毫升的体积接种于12孔板中，每孔细胞数量为5 × 10⁵。然后向每个实验孔中加入10 µL新配制的工作浓度荧光二氧化硅纳米颗粒悬液，同时向未处理的对照孔中加入等体积的完全培养基。在37 °C孵育1小时以促进内化后，将样品转移至各自的1.5 mL聚丙烯离心管中，于室温下以6,000 × g离心3分钟。随后通过蓝色孵育步骤对细胞进行CD14染色：将每份细胞悬液100 µL与10 µL人源抗体按1:11的比例加入运行缓冲液中，于4 °C孵育10分钟。用1 mL运行缓冲液洗去未结合的抗体后，将细胞重悬于200 µL新鲜运行缓冲液中，用于流式细胞术分析。接下来，为了设置光谱溢出补偿，请在流式细胞术软件中打开仪器设置框，然后以低流速获取不含荧光抗体标记纳米颗粒的样本。在存在荧光纳米颗粒的情况下调整补偿设置是该操作中最困难的部分，因为纳米颗粒可能干扰侧向散射。为确保成功，必须手动定义目标细胞群的门控。通过调节电压通道，手动调整前向散射和侧向散射，然后在目标细胞群周围绘制一个适当大小的门控区域。加载另一个未标记的样本，并在仪器设置框中打开补偿选项卡。在采集过程中调整补偿系数，直到溢出通道中荧光染料阳性群体和阴性群体的荧光强度大致相同。最后，在针对每种单染荧光染料对照管完成补偿调节后，读取纳米颗粒处理的样本，以进一步表征白细胞对纳米颗粒的响应行为；如上所述，进行了内化实验。例如，在本代表性实验中，外周血单个核细胞（PBMC）分离后，通过前向散射和侧向散射可清晰识别出三种主要的血液白细胞亚群。此外，经 fz 二氧化硅处理后，淋巴细胞、单核细胞和粒细胞表现出不同的纳米颗粒内化速率，这由其荧光强度反映出来。在这些图像中，纳米颗粒内化现象显示于从 PBMC 中分离的原代 CD14 阳性单核细胞中。这些散点图显示了在存在菲茨的二氧化硅纳米颗粒的情况下，CD14 阳性单核细胞的情况。直方图展示了以荧光强度表示的菲茨阳性细胞的定量结果。类似地，还对经不同浓度菲茨二氧化硅纳米颗粒处理的 TP1 单核细胞进行了内化实验，未处理细胞作为阴性对照。点图显示，在TP一细胞系中，纳米颗粒内化后侧向散射随剂量增加而增强，而前向散射保持不变。这些图谱的数据表明，使用Fitz的二氧化硅纳米颗粒处理可诱导单核细胞呈剂量依赖性内化，表现为细胞内颗粒度增强。为了进一步了解免疫细胞与纳米颗粒之间的相互作用，将小胶质细胞在体外培养七天，并与纳米颗粒共孵育一小时。荧光显微镜结果显示为混合型原代胶质细胞培养物，其中含有大量GFP阴性、非贴壁的星形胶质细胞以及少量GFP阳性细胞。在此代表性实验中，通过流式细胞术结合单一CD11b抗体染色，可区分出三种胶质细胞亚群：CD11b阴性GFP阴性星形胶质细胞及其他胶质细胞、CD11b阳性GFP阴性小胶质细胞，以及CD11b阳性GFP阳性亚群。后两种亚群能够内化纳米颗粒，其中GFP阳性群体的内化能力略有增强。纳米颗粒的内化还可通过共聚焦显微镜进一步验证，本图所示结果采用棒状二氧化硅纳米颗粒进行验证。在进行该实验操作时，需要注意将样品避光保存，以防止荧光染料发生漂白，并在抗体孵育过程中将样品保持在4°C。完成该步骤后，可进一步采用共聚焦显微镜等其他方法，以研究纳米颗粒在细胞内的定位等更多相关问题。

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