检测荧光纳米粒子的相互作用与原发性免疫细胞亚群流式细胞仪的

该程序的总体目标是通过流式细胞术检测荧光纳米颗粒与原代免疫细胞亚群的相互作用。这是通过首先用纳米颗粒处理感兴趣的细胞来实现的。在下一步中，用针对细胞特异性表面标志物的抗体标记细胞，然后通过流式细胞术进行分析。

最终，可以测量纳米颗粒与单个免疫细胞群的相互作用。与显微镜等现有方法相比，该技术的主要优点是，使用这种技术，可以在非贴壁细胞群中量化纳米颗粒诱导的荧光强度变化。对于血液白细胞或纯化单核细胞中的纳米颗粒内化，首先将 10 到 5 倍的感兴趣细胞铺板在每孔 1 毫升中。在 12 孔板的每个孔中。

然后向每个实验孔中加入 10 微升新鲜制备的工作荧光二氧化硅纳米颗粒悬浮液，此时也向未处理的对照孔中加入等体积的完全培养基。在 37 摄氏度下内化 1 小时后，将样品转移到单独的 1.5 毫升聚丙烯管中，然后在 6， 000 倍 G 和室温下旋转样品 3 分钟，用 CD 14 对细胞进行染色，方法是将 100 微升每种细胞悬液以 1：11 的比例在 10 微升人抗体中，在 4 摄氏度下以 1：11 的比例在电泳缓冲液中孵育 10 分钟。在 1 mL 电泳缓冲液中洗去未结合的抗体后，将细胞重悬于 200 μL 新鲜电泳缓冲液中，用于流式细胞分析。

接下来，要设置光谱溢出补偿，请打开流式细胞术软件中的仪器设置框，然后以低流速获取抗体未标记的无纳米颗粒样品。在荧光纳米颗粒存在下调整补偿设置是该程序中最棘手的部分，因为纳米颗粒会干扰侧向散射以确保成功，必须定义感兴趣细胞群的门通过调节电压通道来手动调整前向和侧向散射。然后在所需的细胞群周围绘制一个适当大的门。

加载另一个未标记的样品，然后打开仪器设置框中的补偿选项卡。在采集过程中调整补偿因子，直到溢出通道中的荧光强度与荧光染料阳性和阴性群体大致相同。最后，在调整每个单染色荧光染料对照管的补偿后，读取纳米颗粒处理的样品以更好地表征响应纳米颗粒的白细胞行为，如刚刚所示进行内化测定。

例如，在这个代表性实验中，PBMC 分离后通过前向和侧向散射清楚地鉴定了三个主要的血白细胞亚群。此外，在 fz 二氧化硅处理后，淋巴细胞、单核细胞和粒细胞表现出不同的纳米颗粒内化速率，如它们的荧光强度所示。在这些图像中，纳米颗粒内化在从 PBMC 纯化的原代 CD 14 阳性单核细胞中得到证实。

这些散点图显示了 fitz 二氧化硅纳米颗粒存在下的 CD 14 阳性单核细胞。直方图说明了以荧光强度表示的 fitzy 阳性细胞的定量。用浓度递增的 fitz 二氧化硅纳米颗粒处理的 TP one 单核细胞进行类似的内化实验，未处理的细胞作为阴性对照。

点图说明了纳米颗粒内化后 TP 一个细胞系中侧向散射的剂量依赖性增加，而前向散射保持不变。这些图表中的数据表明，用 fitz 的二氧化硅纳米颗粒处理会诱导单核细胞中的剂量依赖性内化，其特点是细胞内粒度的增强，以进一步了解免疫细胞和纳米颗粒之间的相互作用，小胶质细胞在体外培养 7 天并与纳米颗粒孵育 1 小时。荧光显微镜检查显示混合原代神经胶质细胞培养物，含有大量 GFP 阴性非贴壁星形胶质细胞和一些 GFP 阳性细胞。

在这个代表性实验中，通过流式细胞术可以区分三个神经胶质细胞亚群，单个 CD 11 B 抗体染色 CD 11 B，阴性 GFP 阴性星形胶质细胞和其他神经胶质细胞小胶质细胞 CD 11 B 阳性 GFP 阴性细胞，以及一个 CD 11 B 阳性 GFP 阳性亚群。后两个亚群能够内化 GFP 阳性群体略微增加缺陷的纳米颗粒。纳米颗粒内化可以通过共聚焦显微镜进一步验证，如本图中使用棒状 domine 二氧化硅纳米颗粒所示。

在尝试此程序时，请务必记住将样品置于黑暗中，以避免荧光染料漂白，并在抗体孵育期间将样品保持在 4 度。按照这个程序，可以执行其他方法，如共聚焦显微镜，以回答有关纳米颗粒细胞内定位的其他问题。