CRISPR 介导的碱基编辑工具:一种诱导靶向碱基替换的基因组编辑技术

对于 CRISPR 介导的基因组编辑，从 HAP1-BE3 培养物开始，这是一种单倍体细胞系，具有编码碱基编辑器酶的整合 BE 基因。向该培养物中加入含有CRISPR-Cas9质粒的慢病毒载体，该质粒设计用于特定靶标，例如人乳腺癌基因BRCA1。

慢病毒颗粒与宿主细胞膜融合，释放质粒，最终整合到宿主细胞基因组中，形成CRISPR-Cas9-BE基因片段。这些基因产生靶向 BRCA1 的 gRNA、Cas9 核酸内切酶和 BE-胞苷脱氨酶。

靶向 BRCA1 的 gRNA 是一种与 Cas9 融合并将复合物引导至 BRCA1 基因位点的 RNA。在该基因附近，基因座是一个原间隔区相邻基序或 PAM，其中 BE 可以稳定对接并向上游移动以到达其活性催化区域。在这里，BE 识别胞苷碱并将其转化为尿苷。

这种碱基取代突变触发 Cas9 核酸酶切断未修饰的 DNA 链。DNA 链断裂会激活修复酶，填充缺失的碱基并将尿嘧啶（一种非 DNA 碱基）转化为胸腺嘧啶。总的来说，这些过程会产生基因变异。

现在，在生理条件下孵育细胞并传代培养以繁殖基因变异。提取基因组 DNA 并对其进行测序，以分析 CRISPR 介导的碱基编辑效率。

染前一天，在 24 孔板中每孔接种 5 x 10⁵ 个 HAP1-BE3 细胞，并培养它们以达到 70% 至 80% 的汇合度以进行转染。根据制造商的方案，使用购买的转染试剂转染BRCA1靶向向导RNA。使用 1 微克 BRCA1 靶向引导 RNA 在 BRCA1 靶位点诱导 CG 到 TA 的转化。然后，将细胞在37摄氏度下孵育，每3至4天传代培养一次。转染后 3、10 和 24 天收获细胞沉淀，以分析碱基编辑效率。使用基因组 DNA 纯化试剂盒提取基因组 DNA。