沉默 BRCA2以确定新的BRCA2调控的生物学功能在人体细胞培养

siRNA 的基因沉默代表了一种方便的实验策略，可以分析 BRCA2 依赖性生物学，对更好地了解癌症生物学具有直接意义。提出了一种有效沉默 BRCA2 的方法，以及通过免疫印迹在人类细胞系中检测和量化 BRCA2 蛋白表达变化的实验程序。

该程序的总体目标是通过转染 SIR A 来沉默 B RCA 2 表达，这是通过首先制备 SIR a 转染试剂复合物来实现的。接下来，通过将复合物滴加到共流畅度为 80% 的单层细胞中来进行第一轮转染。然后，使用更高的 SIR、A 与转染试剂比率进行第二轮 SIR a 转染。

最后，用冰冷的 PBS 洗涤细胞单层，并在 4 摄氏度下用基于洗涤剂的裂解缓冲液裂解细胞。最终，Western blotting 分析用于显示 B RCA A 在蛋白质水平上沉默 2。与现有方法相比，该技术的主要优点是它允许有效的基因沉默以及高分子量蛋白质的最佳检测，如肿瘤抑制因子 B RCA 二首先在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的加湿室中培养人上皮细胞单层后，去除生长培养基并使用室温 PBS 洗涤细胞。

要从板中分离细胞，加入 2 毫升 0.25% 胰蛋白酶 0.53 毫摩尔 EDTA 溶液，并根据细胞类型孵育 3 至 5 分钟。在将细胞转移到 15 mL 试管中之前，加入 2 mL 含 10% FBS 的完全生长培养基来中和胰蛋白酶。将试管放入水平吊篮转子中，以 320 至 330 Gs 和 4 摄氏度离心 3 分钟。

使用 5 毫升不含抗生素的培养基重悬沉淀，然后使用 Burker 室或自动计数系统对细胞进行计数。然后将大约 0.5 至 1 乘以 10 至 6 个细胞放入 6 个孔板的每个孔中，放入 2 毫升无抗生素培养基中，孵育 24 小时至 80% 浓度。孵育后，在 130 μL 还原血清培养基中稀释 6 μL 脂质基 irna 特异性转染试剂，进行第一轮转染。

在 130 μL 还原血清培养基中稀释 3 μL 10 μmol S irna。将稀释的 irna 与稀释的转染试剂混合，并在室温下孵育 5 至 10 分钟。在孵育过程中，从细胞中取出培养基，并加入 2 mL 不含抗生素的新鲜培养基。

在 37 摄氏度预热。接下来，将 250 μL siRNA 转染试剂复合物加入 6 孔板中的每个细胞孔中。然后将细胞在 37 摄氏度的加湿培养箱中用 5% 二氧化碳孵育。

24 小时后，在 130 μL 减血清培养基中稀释 5 μL 10 μmolar irna，然后进行第二轮转染。第二轮中高浓度的 sarna 对于获得 B rca 的高效率至关重要。两个沉默。

分析前将细胞在 37 摄氏度下孵育 1 至 2 天，以制备用于免疫印迹分析的细胞裂解物。根据此处显示的配方制备新鲜的裂解缓冲液。从细胞中取出培养基，每孔加入 2 毫升冰冷的 PBS 以洗涤细胞。

然后，从板中完全去除 PBS，并向每个板中加入 200 微升冰冷的裂解缓冲液。轻轻旋转板，使裂解缓冲液均匀分布，并在旋转器上以 4 摄氏度孵育 15 分钟。然后使用细胞刮刀。

细胞裂解物收集在冰上的微量离心管中，在 17、900 Gs 和 4 摄氏度下离心 25 分钟，并收集上级进行免疫印迹分析。用 950 毫升蒸馏水稀释 50 毫升 20 x tris 乙酸盐 SDS 电泳缓冲液，制备电泳缓冲液。按如下方式准备样品。

加入 15 μg 总细胞裂解物。5 微升 4 x 样品缓冲液，含有 ESAL 硫酸锂、pH 8.42 微升、0.5 摩尔 DTT 和裂解缓冲液，总体积为 20 微升。将样品在 55 摄氏度下变性 10 分钟。

使用此温度至关重要，因为 b RCA 两种蛋白对热敏感。接下来，根据制造商的说明设置电泳室。然后将样品加载到预制凝胶上的 10 μL 高分子量重染蛋白标准品中，并在 120 伏特下运行约 2 小时。

同时，用 50 毫升 20 x 转印缓冲液、100 毫升 100% 甲醇和 850 毫升水制备转印缓冲液。在 100% 甲醇中浸泡 5 分钟，活化 PVDF 膜。用蒸馏水冲洗并在转印缓冲液中平衡至少 5 分钟。

转印装置的海绵浸泡在 4 摄氏度的转印缓冲液中直至使用。在 55 道尔顿蓝色标记物离开预制胶之前停止运行，并从浸泡在转印缓冲液中的三个海绵开始组装三明治。然后是一张浸透了转印缓冲液的 3 mm 纸。

接下来，加入凝胶，然后加入活化的 PVDF 膜，然后加入一张缓冲液浸泡的 3M 级纸，最后加入三块浸泡过的海绵。将堆栈放入设备中，以 350 毫安的浓度转移蛋白质 4 小时 4 摄氏度，或在 180 毫安和 4 摄氏度的温度下转移过夜。转移后，使用 TBS 清洗膜，并用 TBST 和 5% 脱脂奶粉封闭 1 小时。

然后用 9 毫升含有 30 微升抗 BCA 二兔多克隆抗体的 TBST 牛奶缓冲液替换缓冲液，并在 4 摄氏度下孵育过夜。使用 TBST 洗涤膜 3 次，每次 10 分钟后，将过滤器与 1 微升辣根过氧化物酶偶联的抗兔二抗（在 10 毫升 TBST 牛奶缓冲液中稀释）一起孵育 1 小时。洗涤膜 3 次后，按照制造商的说明进行 KEMMA 发光免疫检测。

在高分辨率 ECL 薄膜上可视化条带以确认 B rca 的特异性。两个沉默。如前所述，将加扰的 irna 与 B RCA 两个 irna 并排使用，重要的是以高 irna 转染比进行第二轮 irna 转染，以获得 B RCA A 2 的高效沉默。

此处的结果显示了使用低 siRNA 和高 siRNA 转染比之间的敲低效率差异，具体取决于细胞类型。在第二轮 siRNA 转染后，获得最高水平基因沉默的最佳最短时间可能会有所不同，例如，如图所示，24 小时对于 NTHY 甲状腺细胞来说已经足够了，但需要长达 48 小时才能在 PNT 中实现高效的 B RCA A 两次敲低 1 A 前列腺细胞 b RCA 2 沉默在第二轮转染后的第 7 天之前相当稳定。如前所述，在 55 摄氏度以上的温度下使细胞裂解物变性会导致 B RCA A 2 蛋白损失高达 50%。

在本实验中，用药物治疗 24 小时后检查 B RCA A 两个沉默的 PNT 一个 A 细胞对 PARP 抑制剂 rucaparib 的敏感性。与对照组相比，在 B RCA 中观察到细胞增殖的时间依赖性降低，两个耗尽的 PNT 和一个 A 细胞。看完这个视频后，它应该对如何通过 CRNA 沉默长蛋白编码基因以及如何通过除 BRC 2 之外的优化免疫阻断程序有效地检测其蛋白质产物有一个很好的了解。

这种物质可以应用于许多其他具有挑战性的大蛋白，特别是当它们在细胞中以非常低的水平表达时。