在培养的人类细胞中沉默BRCA2以鉴定新型BRCA2调控的生物学功能

本实验的总体目标是通过转染 SIR A 来沉默 B RCA 两个表达。首先制备 SIR a 转染试剂复合物，然后向融合度为 80% 的单层细胞中逐滴加入该复合物，进行第一轮转染。接着，使用更高的 SIR A 与转染试剂比例进行第二轮 SIR a 转染。

最后，用预冷的PBS洗涤细胞单层，并在4°C下使用基于去垢剂的裂解缓冲液裂解细胞。最终通过Western印迹分析检测B RCA A两个基因在蛋白质水平上的沉默效果。该方法相较于现有技术的主要优势在于，它能够实现高效的基因沉默，同时有利于对B RCA两个这类高分子量蛋白（如肿瘤抑制蛋白）进行最佳检测。实验开始时，先将人上皮细胞单层在37°C、5%二氧化碳的湿润培养箱中培养，随后移除培养基，并用室温PBS洗涤细胞。

为使细胞从培养板上脱落，加入2毫升0.25%胰蛋白酶-0.53毫摩尔/升EDTA溶液，根据细胞类型孵育3至5分钟。转移细胞前，加入2毫升含10%胎牛血清（FBS）的完全培养基以中和胰蛋白酶。将细胞悬液转移至15毫升离心管中，放入水平转子，于4°C、320至330×g条件下离心3分钟。

使用 5 毫升不含抗生素的培养基重悬沉淀，然后使用血球计数板或自动计数系统对细胞进行计数。随后将约 0.5 至 1 × 10⁶ 个细胞接种到 2 毫升不含抗生素的培养基中，每孔加入 6 孔板的每个孔内，孵育 24 小时至细胞融合度达到 80%。孵育结束后，开始第一轮转染：将 6 微升基于脂质的特异性 siRNA 转染试剂溶于 130 微升低血清培养基中。

将3微升10微摩尔的S irna加入130微升低血清培养基中稀释。将稀释后的irna与稀释的转染试剂混合，在室温下孵育5至10分钟。孵育期间，移除细胞中的培养基，并加入2毫升不含抗生素的新鲜培养基。

在37摄氏度下预热。随后将250微升的siRNA转染试剂复合物加入六孔板的每孔细胞中。然后将细胞置于含5%二氧化碳、37摄氏度的湿润培养箱中孵育。

24 小时后，将 5 微升 10 微摩尔的 irna 加入 130 微升低血清培养基中稀释，并按前述方法进行第二轮转染。第二轮中较高的 sarna 浓度对于实现高效的 B rca A2 沉默至关重要。

在分析前，将细胞于37摄氏度孵育一至两天，以制备细胞裂解液用于免疫印迹分析。根据此处所示配方配制新鲜裂解缓冲液。移除细胞培养基，并每孔加入2毫升预冷的PBS洗涤细胞。

随后，彻底移除孔板中的 PBS，并向每个孔中加入 200 微升预冷的裂解缓冲液。轻轻旋转孔板，使裂解缓冲液均匀分布，然后在 4 °C 条件下于摇床上孵育 15 分钟。接着使用细胞刮刀。

将细胞裂解液收集到预冷的微量离心管中，于冰上以17,900 ×g、4°C离心25分钟，收集上清液用于免疫印迹分析。通过将50毫升20×三羟甲基氨基甲烷乙酸钠SDS电泳缓冲液与950毫升蒸馏水混合，配制电泳缓冲液。样品准备步骤如下。

加入15微克总细胞裂解液。加入5微升含有硫酸锂ESAL的4倍上样缓冲液（pH 8.4）、2微升0.5摩尔DTT以及裂解缓冲液，总体积补至20微升。在55摄氏度下变性样品10分钟。

必须使用此温度，因为b RCA two蛋白具有热敏感性。接下来，按照制造商的说明组装电泳槽。然后，在预制胶上每孔加入10微升的高分子量预染蛋白标准品，并在120伏电压下电泳约两小时。

在此期间，使用 50 毫升 20× 转膜缓冲液、100 毫升 100% 甲醇和 850 毫升水配制转膜缓冲液。将 PVDF 膜浸入 100% 甲醇中 5 分钟以活化膜。用去离子水冲洗，并在转膜缓冲液中平衡至少 5 分钟。

将转印装置的海绵浸泡于4 °C的转印缓冲液中，直至使用。在55 kDa蓝色蛋白分子量标准尚未离开预制胶之前停止电泳，随后开始组装“三明治”结构，最底层为三片浸透转印缓冲液的海绵，其上放置一张浸透转印缓冲液的3 mm滤纸。

接下来，加入凝胶，然后是活化的PVDF膜，再放一张浸透缓冲液的3M滤纸，最后放三块浸透缓冲液的海绵。将此叠层放入转膜装置中，在4°C条件下以350毫安电流转移蛋白4小时，或在4°C条件下以180毫安电流过夜转膜。转膜完成后，用TBS洗涤膜，并在含5%脱脂奶粉的TBST中于室温下封闭1小时。

然后将缓冲液替换为含有30微升抗BCA2兔多克隆抗体的九毫升TBST脱脂牛奶缓冲液，在4摄氏度下孵育过夜。用TBST洗涤膜三次，每次10分钟，随后将滤膜在10毫升TBST脱脂牛奶缓冲液中与一微升辣根过氧化物酶标记的抗兔二抗抗体稀释液孵育一小时。膜洗涤三次后，按照制造商说明书进行化学发光免疫检测。

通过高分辨率 ECL 膜显影观察条带，以确认 Brca1 A2 沉默的特异性。如前所述，此处并行使用了 Scrambled RNA 与 BRCA1 A2 RNA。为实现高效的 BRCA1 A2 沉默，重要的是以高 RNA 与转染试剂比例进行第二轮 RNA 转染。

本结果展示了在不同细胞类型中，使用低浓度与高浓度 siRNA 转染比例时基因敲低效率的差异。在第二次 siRNA 转染后，达到最高基因沉默水平所需的最短时间可能有所不同，例如，如本图所示，对于 NTHY 甲状腺细胞，24 小时已足够，但 PNT1A 前列腺细胞中实现高效的 B RCA A 两基因敲低则需要长达 48 小时。B RCA 2 的沉默效果在第二次转染后直至第 7 天仍保持较为稳定。如前所述，将细胞裂解液在高于 55 摄氏度的温度下变性，会导致 B RCA A 2 蛋白损失高达 50%。

在本实验中，检测了经 24 小时药物处理后，B RCA A 两个被沉默的 PNT 一个 A 细胞对 PARP 抑制剂 rucaparib 的敏感性。与对照组相比，B RCA 两个缺失的 PNT 一个 A 细胞表现出随时间依赖性的细胞增殖下降。观看本视频后，您应能充分理解如何利用 CRNA 沉默长蛋白编码基因，以及如何通过优化的免疫阻断程序高效检测其蛋白产物，除 BRC 两个之外。

该方法可应用于许多其他难以处理的大分子蛋白质，特别是当这些蛋白质在细胞中表达水平极低时。