Name: 使用 CRISPR 介质基础编辑器对 BRCA1 变体进行功能评估 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: 学习使用CRISPR介导的碱基编辑器对BRCA1基因变体进行功能评估的方法。该技术直接突变内源性表达的BRCA1，可预测乳腺癌、卵巢癌等癌症风险，并有助于发现潜在药物靶点。

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本工作由韩国国家研究基金会资助（项目编号：2017M3A9B4062419、2019R1F1A1057637 和 2018R1A5A2020732，授予 Y.K.）。

注意：方法1（HAP1-BE3细胞系的构建）为可选步骤。可不构建表达BE3的细胞系，而将编码BE3的质粒DNA与编码gRNA的质粒DNA共转染。其他胞嘧啶碱基编辑器变体（如BE4max）也可用于实现高效碱基编辑。
1. HAP1-BE3 细胞系的构建
<ol>
	<li>质粒DNA的构建
	<ol>
		<li>为构建用于慢病毒生产的 lentiBE3-blast 质粒 DNA，扩增 pCMV-BE3 中的 BE3 编码序列（材料表通过高保真聚合酶 PCR 扩增，设计 PCR 引物使其包含步骤 1.1.2 中消化载体的重叠序列，用于等温组装，具体如下17: 
		引物-F：5’-TTTGCCGCCAGAACACAGGACCGGTTCTAGA GCCGCCACCATGAGCTCAGAG-3’ 
		引物-R：5’-CAGAGAGAAGTTTGTTGCGCCGGATCC GACTTTCCTCTTCTTCTTGGG-3’ 
		注意：下划线显示的核苷酸与消化后的载体重叠，这些序列将根据用户选择的目标载体而定。</li>
		<li>消化 lentiCas9-blast（材料清单) 用限制性内切酶 XbaI 和 BamHI（每微克质粒 DNA 使用 1 单位酶）消化质粒 DNA 1 μg）在室温下孵育1小时 37 °C在0.8%琼脂糖凝胶上电泳分离消化产物，并使用商业凝胶回收试剂盒纯化相应大小的条带（8.6 kb）材料表).</li>
		<li>使用等温组装试剂盒克隆扩增的 BE3 PCR 产物和经消化的 lentiCas9-Blast 载体材料表使用总量为 0.02–0.5 pmol 的 DNA 片段，并按载体:插入片段为 1:3 的比例进行连接。将连接产物转化至 DH5 alpha 感受态细胞中。18. 将转化子接种到含有氨苄青霉素的琼脂平板上（100 µg/mL）并将培养板在过夜孵育 37 °C.</li>
		<li>挑选数个菌落，接种于含氨苄青霉素的4 mL LB（Luria-Bertani）培养基中100 μg/mL）并在摇床培养箱中以180 rpm振荡培养。</li>
		<li>使用商业质粒DNA纯化试剂盒纯化质粒DNA（材料清单按照制造商提供的说明书进行操作。</li>
		<li>为验证DNA克隆成功，使用标准引物及BE3特异性引物，通过Sanger测序对每种纯化的质粒DNA（来自步骤1.1.5）的BE3序列进行分析补充表1）并筛选出精确的克隆lentiBE3-blast构建体。 
		注意：为了分析Sanger测序结果，我们推荐使用多种工具，例如BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）和CLUSTALW（https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞培养及HAP1-BE3细胞系的建立
	<ol>
		<li>保持细胞处于健康状态并处于活跃分裂状态。在Iscove改良的Dulbecco培养基（Iscove’s modified Dulbecco’s medium,材料表) 含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素。在杜氏改良伊格尔培养基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium, DMEM）中培养HEK293T/17细胞。材料表含10% FBS和1%青霉素/链霉素的培养基 
		注意：HAP1 细胞因其近乎单倍体的特性而适用于遗传学研究。然而，这些细胞在培养过程中可能自发地恢复为二倍体状态。使用 Hoechst 34580 染色进行富集n-利用流式细胞术对细胞群进行分析将有助于维持HAP1细胞的单倍性19.</li>
		<li>接种 5 × 106 转染前一天将HEK293T/17细胞接种于100 mm培养皿中。转染当天，转染质粒DNA（15 µg lentiBE3-blast的 9 µg psPAX2 病毒包装，以及 6 µg 2管病毒包膜pMD2.G的nd 使用商品化转染试剂，按照制造商方案，采用慢病毒包装系统材料表)20转染后6小时更换培养基，转染后48小时或72小时收集含病毒的培养基。使用滤器过滤上清液 0.45 µm 滤膜</li>
		<li>以0.1的感染复数（MOI）将BE3慢病毒颗粒转导至HAP1细胞中。为获得合适的MOI，使用梯度稀释的病毒浓度进行调整。移除培养基，更换为调整后的病毒上清液与新鲜培养基。</li>
		<li>转导后一天，更换培养基为 10 µg/mL 的杀稻瘟菌素（blasticidin）材料表)-培养基中，并用杀稻瘟菌素（blasticidin）筛选转导细胞3天。杀稻瘟菌素筛选后，选择存活细胞约占10%的孔进行下一步实验。</li>
		<li>经嘌呤霉素筛选后，将转导的细胞以每孔0.5个细胞的密度接种于96孔板中，以分离单克隆（例如，将50个细胞稀释至20 mL（每孔0.5个细胞） 200 µL) 培养基与分装 200 µL 每孔加入96孔板中。将96孔板孵育2周，挑取单克隆以验证BE3活性。</li>
		<li>将单克隆分为两组，一组用于检测BE3活性，另一组用于保种。将gRNA的慢病毒颗粒转导至其中一组细胞中，以确认BE3活性。使用T7核酸内切酶I（T7E1， 材料列表）检测，或通过靶向深度测序技术（步骤4）进行21. 选择状态健康且 BE3 活性较高的适当单克隆。 
		注意：为了准确验证突变频率，我们建议采用靶向深度测序而非T7E1检测。HEK2（5’-GAACACAAAGCATAGACTGCGGG-3’）是经过充分验证的BE3靶向位点。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 设计与构建靶向 BRCA1 的 gRNA
<img alt="BRCA1基因编辑，用于突变研究的CRISPR质粒图谱与DNA序列示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61557/61557fig02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：一种gRNA质粒DNA的示例。（A）为了利用BE3高效编辑目标序列，需要一个NGG PAM（CCN PAM），使目标C（或对应的G）位于五核苷酸窗口内。NGG PAM以红色标出，碱基编辑窗口由灰色方框表示。（B）显示了用于c.8047C&gt;T（H1283Y）碱基编辑的gRNA序列，目标C:G碱基对以红色标出，活性编辑窗口由灰色方框高亮显示。在进行gRNA克隆时，需在两端5ʹ端添加加粗所示的突出序列。gRNA模板通过退火两条互补寡核苷酸生成。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61557/61557fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
注意：BRCA1 变异体的阳性和阴性对照至关重要。本研究中，c.5252G&gt;A（R1751Q）和 c.4527C&gt;T（Y1509Y）用作良性对照，c.191G&gt;A（C64Y）、81-1G&gt;A 和 c.3598C&gt;T（Q1200*）用作致病性对照。每条 gRNA 的靶序列列于补充表 1中。
<ol>
	<li>获取 BRCA1 从美国国家生物技术信息中心（NCBI）的GenBank获取基因组序列22.</li>
	<li>在目标突变位点附近搜索具有 Protospacer Adjacent Motif（PAM）序列“NGG”和“CCN”的 20 bp 靶序列。由于 BE3 的活性窗口位于 gRNA 靶序列 PAM 远端的 4–8 个核苷酸范围内，因此目标突变应位于该区域。14. 在 c.8047C 的情况下&gt;T (H1283Y) 和 c.5252G&gt;靶向 A (R1751Q) 的 gRNA，5ʹ-TCAGGAACATCACCTTAGTG-AGG-3ʹ 和 5ʹ-CCA-CCAAGGTCCAAAGCGAGCAA-3ʹ，加粗序列为活性窗口。在NGG和CCN PAM序列下，分别发生C到T和G到A的转换（图 2A). 
	注意：BE-Designer（http://www.rgenome.net/be-designer/）23 是用于gRNA设计的实用网络工具。</li>
	<li>每个gRNA订购两条互补的寡核苷酸；对于正向寡核苷酸，在向导序列的5ʹ端添加“CACCG”；对于反向寡核苷酸，在5ʹ端添加“AAAC”，在3ʹ端添加“C”。这些额外序列是针对本实验方案所用的目的gRNA表达载体（来自步骤2.5）而设计的，若使用其他gRNA表达载体，用户应相应调整序列图 2B).</li>
	<li>将寡核苷酸溶于蒸馏水中，终浓度为 100 µM. 将两条互补的寡核苷酸混合至终浓度为 10 µM 使用T4连接酶缓冲液（材料清单）并在 95 °C 5 分钟，然后在室温下冷却以进行退火。</li>
	<li>使用限制性内切酶 BsaI（每微克 pRG2 使用 1 单位）消化 pRG2 质粒 1 μg1小时 37 °C (材料表在1%琼脂糖凝胶上电泳消化产物，并纯化适当大小的条带（2.5 kb）。 
	注意：可使用其他克隆方法（如 Golden Gate 克隆），而非经典的酶切与连接方法。</li>
	<li>使用购买的DNA连接酶将退火后的寡核苷酸双链连接至载体DNA上材料清单）按照制造商提供的方案进行操作，并将其转化至DH5 alpha感受态细胞中（也可使用其他广泛用于亚克隆的E. coli菌株）。</li>
	<li>将转化子接种至含有氨苄青霉素的琼脂平板上（100 μg/mL）并将培养板在37°C下孵育过夜 37 °C. 从多个转化子中纯化质粒DNA，并使用针对U6启动子的引物通过Sanger测序分析其gRNA序列材料清单).</li>
</ol>
3. 使用CRISPR介导的碱基编辑工具创建BRCA1突变体
注意：如果未使用 HAP1-BE3 细胞系，可将编码 BE3 的质粒 DNA 与靶向 BRCA1 的 gRNA 共同转染。与共转染 BE3 和 gRNA 质粒相比，在本实验条件下，将 gRNA 质粒转染至 HAP-BE3 细胞可在目标位点诱导实现高达 3 倍的高效碱基编辑。
<ol>
	<li>转染前一天，将5 × 105个HAP1-BE3细胞（若采用共转染方法，则为HAP1细胞）接种至24孔板中，每孔接种一次。转染时，细胞培养至合适密度（70%–80%融合度）。</li>
	<li>根据生产商说明书，使用购买的转染试剂（材料表）转染靶向BRCA1的gRNA。使用1 µg靶向BRCA1的gRNA（若采用共转染方法，则同时使用1 µg编码BE3的质粒DNA），以在BRCA1靶位点诱导C:G至T:A的转换。将细胞在37 °C培养，并每3–4天传代一次。</li>
	<li>转染后第3、10和24天收集细胞沉淀，用于分析碱基编辑效率（转染后第3天的样本视为第0天样本进行分析）。</li>
	<li>使用基因组DNA纯化试剂盒（材料表）提取基因组DNA。 
	注意：我们建议通过调整试剂与DNA的不同比例来优化转染条件。在本实验中，HAP1细胞转染的最佳条件为试剂与DNA的比例为4:1。</li>
</ol>
4. Illumina下一代测序（NGS）的样品制备
<img alt="使用PCR引物和NGS文库进行测序分析的BRCA1基因编辑示意图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61557/61557fig03.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：下一代测序的准备工作。 1st PCR引物设计用于扩增 BRCA1 基因组DNA上的靶位点。2nd PCR引物设计使其序列位置比1更靠内st PCR 引物序列。两端添加的额外序列以黄色条形表示，位于 2 的两侧nd 用于连接执行下一代测序所需关键序列的PCR引物 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61557/61557fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<ol>
	<li>设计 1st 扩增用 PCR 引物 BRCA1 靶点。尽管对1的大小没有限制st PCR 产物，产物大小为 &lt;建议使用1 kb以有效扩增特定区域（图3).</li>
	<li>设计 2nd 位于1内部的PCR引物st PCR产物。根据NGS读长考虑扩增子的大小（例如，对于2 × 150 bp的双端测序，扩增子产物的大小应小于300 bp，以便合并每条读段）。为连接NGS分析所需的序列，在2条引物的5’端添加额外序列nd PCR引物设计如下：对于正向引物，在5’端添加5’-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’序列；对于反向引物，在5’端添加5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’序列。 
	注意：我们采用巢式 PCR 来减少非特异性结合的扩增子，通过防止引物与非靶序列结合来实现。</li>
	<li>扩增 BRCA1 基因组DNA上来自三个时间点的靶标位点。为尽量减少PCR错误，请根据制造商的说明书使用高保真聚合酶。对于1st PCR 反应，使用 100 ng 基因组 DNA 进行扩增，共 15 个循环。对于 2nd PCR反应，使用 1 µL 的 1st PCR扩增20个循环的产物。运行 5 µL 2的nd 在2%琼脂糖凝胶上电泳PCR产物并确认其大小。</li>
	<li>为了连接NGS分析所需的序列，扩增2nd 使用下表所列引物进行PCR反应扩增PCR产物。 1 µL 2的nd PCR产物用于高保真聚合酶扩增，最多30个循环。
	<ol>
		<li>为对大量文库进行多重测序并同时进行混合与测序，使用具有独特索引序列的正向（D501 – D508）和反向（D701 – D712）引物，补充表 1使用不同的引物组合对每个样本进行扩增，以实施独特的双重索引策略。</li>
		<li>运行 5 µL 在2%琼脂糖凝胶上电泳检测PCR产物以确认其大小，并使用商业化的PCR纯化试剂盒纯化扩增子（材料清单）。将每个样本等量混合，以构建NGS文库。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用分光光度计在260 nm波长下定量NGS文库，并用重悬缓冲液或10 mM Tris-HCl（pH 8.5）将NGS文库稀释至1 nM浓度。准备 100 µL 根据文库类型将文库稀释至适当的上样浓度（例如，为Nextera DNA Flex制备200 pM的文库）。
	<ol>
		<li>作为对照，将 phiX 与适合试剂盒类型的稀释样本混合。</li>
		<li>将文库加载至测序芯片，并按照制造商的说明书运行下一代测序（NGS）。Illumina iSeq 100 或 MiSeq 系统可对长度达 300 bp 的扩增子进行单端或双端测序。为深入分析碱基编辑效率，我们建议每个目标扩增子获得超过 10,000 条读长。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. BRCA1 变体功能评估中的碱基编辑效率分析
<ol>
	<li>使用 MAUND24 分析碱基编辑效率。碱基编辑效率的计算方法如下所述。 
	<img alt="碱基编辑效率计算公式；靶向 C 到 T 转换；基因编辑研究用途。" src="/files/ftp_upload/61557/61557equ01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 1"> 
	如果 BE3 活性窗口中存在多个胞嘧啶，则仅考虑用于评估 BRCA1 变异体的靶向 C 到 T 转换。例如，若 BE3 活性窗口的序列为“C4A5T6C7T8”，则碱基编辑可能产生的序列包括“T4A5T6C7T8”、“C4A5T6T7T8”和“T4A5T6T7T8”。此时，若第4位是目标 BRCA1 变异体的靶位点，则仅将“T4A5T6C7T8”序列用于计算碱基编辑效率。 
	注意：我们还推荐使用其他网络工具分析碱基编辑活性，例如 CRISPResso225 和 BE-analyzer23。</li>
	<li>使用 BRCA1 变异体的阳性与阴性对照验证结果。良性对照的碱基编辑效率应保持不变，而致病性对照的碱基编辑效率应随时间降低。</li>
	<li>计算 BRCA1 变异体的相对碱基编辑效率，并判断其致病性。采用适当的统计学分析方法（如 t-检验）分析第0天与第21天样本之间的显著差异。</li>
</ol>

<ol><li>Roy, R., Chun, J., Powell, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRCA1+and+BRCA2%3A+different+roles+in+a+common+pathway+of+genome+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (1), 68-78 (2011).</li>
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<li>Hwang, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Web-based+design+and+analysis+tools+for+CRISPR+base+editing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Web-based design and analysis tools for CRISPR base editing.</a> BMC Bioinformatics. 19 (1), 542(2018).</li>
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<li>Clement, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPResso2+provides+accurate+and+rapid+genome+editing+sequence+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">CRISPResso2 provides accurate and rapid genome editing sequence analysis.</a> Nature Biotechnology. 37 (3), 224-226 (2019).</li>
<li>Hu, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolved+Cas9+variants+with+broad+PAM+compatibility+and+high+DNA+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity.</a> Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).</li>
<li>Nishimasu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+CRISPR-Cas9+nuclease+with+expanded+targeting+space%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space.</a> Science. 361 (6408), 1259-1262 (2018).</li>
<li>Walton, R. T., Christie, K. A., Whittaker, M. N., Kleinstiver, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unconstrained+genome+targeting+with+near-PAMless+engineered+CRISPR-Cas9+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Unconstrained genome targeting with near-PAMless engineered CRISPR-Cas9 variants.</a> Science. , (2020).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+target+specificities+of+CRISPR+RNA-guided+programmable+deaminases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Genome-wide target specificities of CRISPR RNA-guided programmable deaminases.</a> Nature Biotechnology. 35 (5), 475-480 (2017).</li>
<li>Zuo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosine+base+editor+generates+substantial+off-target+single-nucleotide+variants+in+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cytosine base editor generates substantial off-target single-nucleotide variants in mouse embryos.</a> Science. 364 (6437), 289-292 (2019).</li>
<li>Jin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosine%2C+but+not+adenine%2C+base+editors+induce+genome-wide+off-target+mutations+in+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cytosine, but not adenine, base editors induce genome-wide off-target mutations in rice.</a> Science. 364 (6437), 292-295 (2019).</li>
<li>Grunewald, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+off-target+RNA+editing+induced+by+CRISPR-guided+DNA+base+editors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide off-target RNA editing induced by CRISPR-guided DNA base editors.</a> Nature. 569 (7756), 433-437 (2019).</li>
<li>Doman, J. L., Raguram, A., Newby, G. A., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+minimization+of+Cas9-independent+off-target+DNA+editing+by+cytosine+base+editors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Evaluation and minimization of Cas9-independent off-target DNA editing by cytosine base editors.</a> Nature Biotechnology. 38 (5), 620-628 (2020).</li>
<li>Gaudelli, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+base+editing+of+A%2AT+to+G%2AC+in+genomic+DNA+without+DNA+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Programmable base editing of A*T to G*C in genomic DNA without DNA cleavage.</a> Nature. 551 (7681), 464-471 (2017).</li>
<li>Anzalone, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Search-and-replace+genome+editing+without+double-strand+breaks+or+donor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA.</a> Nature. 576 (7785), 149-157 (2019).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案描述了一种利用CRISPR介导的胞嘧啶碱基编辑器对BRCA1变异体进行功能评估的简便方法。该方案详细说明了在目标位点设计gRNA以及构建表达这些gRNA的质粒DNA的方法。胞嘧啶碱基编辑器可在活性窗口内诱导核苷酸转换（以BE3为例，其活性窗口为gRNA靶序列PAM远端的第4至第8位核苷酸）。研究人员应谨慎选择目标序列，因为活性窗口内的所有胞嘧啶均可能被替换为胸腺嘧啶。此外，如步骤5所述，应对活性窗口内多个胞嘧啶的编辑情况进行仔细分析，以评估BRCA1变异体的功能。
其中一个最关键的步骤是向目标细胞系转染，这会影响BRCA1功能评估的初始突变频率。为了提高初始突变频率，研究人员应优化针对目标细胞系的递送方法。如步骤1所述，构建表达BE3的细胞系是提高初始突变频率的有效策略。我们不建议通过慢病毒转导将gRNA导入HAP1-BE3细胞，因为BE3和gRNA的持续表达可能导致累积性的核苷酸转换，从而干扰BRCA1变异体的功能评估。
除了本方案中介绍的BE3介...

乳腺癌1型易感基因（BRCA1) 是一个广为人知的肿瘤抑制基因。由于 BRCA1 基因与DNA损伤修复相关，该基因的突变将导致个体患癌风险增加1乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌和胰腺癌与遗传性功能丧失（LOF）突变相关 BRCA1 基因2功能评估与鉴定 BRCA1 变异体可能有助于预防和诊断多种疾病。为研究BRCA1变异体的功能，已开发出多种方法并广泛用于探究其致病性 BRCA1 诸如胚胎干细胞活力检测、荧光报告基因检测以及基于治疗药物的敏感性检测等方法3,4,5,6尽管这些方法已评估了大量BRCA1变异体的功能，但涉及外源性表达的实验方法 BRCA1 过表达可能导致下游调控、基因剂量和蛋白质折叠受到影响，这在变异体研究中存在局限性7此外，这些检测方法无法用于研究转录后调控，例如 mRNA 剪接、转录本稳定性以及非翻译区的作用。8,9.
CRISPR-Cas9 系统能够在活细胞和生物体中实现靶向基因组编辑10。通过单导向RNA，Cas9 可在染色体DNA的特定基因组位点诱导双链断裂（DSBs），从而激活两种DNA修复通路：易错的非同源末端连接（NHEJ）通路和无错的同源定向修复（HDR）通路11。HDR 是一种精确的修复机制；然而，Cas9 核酸酶为实现HDR而诱导的DSBs常导致非预期的插入和缺失（indel）突变。此外，HDR需要同源供体DNA模板来修复DNA损伤，且效率相对较低。最近，Cas9 切口酶（nCas9）已被与胞苷脱氨酶结构域融合，用于实现无需同源DNA模板和DNA双链断裂的C:G到T:A的碱基替换12,13,14,15。利用胞嘧啶碱基编辑器，我们开发了一种用于BRCA1变异体功能分析的新方法16。
本研究中，我们采用了CRISPR介导的胞嘧啶碱基编辑器BE314，该编辑器可高效诱导C:G到T:A的点突变，用于对BRCA1变异体进行功能评估，并成功鉴定了多个BRCA1变异体的功能（图1）。
<img alt="细胞中CRISPR诱变过程示意图，展示致病性与良性通路及工作流程步骤。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61557/61557fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：功能评估工作流程概览。（A）BRCA1功能评估示意图。由于BRCA1的功能丧失（LOF）会影响细胞活力，当BRCA1突变为致病性突变时，随着传代次数增加，细胞会死亡。（B）BRCA1功能评估的各个阶段。虚线框内步骤为可选步骤，可用共转染表达gRNA和表达BE3的质粒DNA替代。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61557/61557fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>BamHI</td><td>NEB</td><td>R3136</td><td>限制性内切酶</td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1113903</td><td>用于筛选转导细胞的药物</td></tr><tr><td>BsaI</td><td>NEB</td><td>R0535</td><td>限制性内切酶</td></tr><tr><td>DNeasy Blood &amp; Tissue Kit</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td>基因组DNA提取试剂盒</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modified Eagle&amp;rsquo;s medium</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td>HEK293T/17细胞培养基</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>16000036</td><td>细胞培养添加剂</td></tr><tr><td>FuGENE HD Transfection Reagent</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td>转染试剂</td></tr><tr><td>Gibson Assembly Master Mix</td><td>NEB</td><td>E2611L</td><td>Gibson组装试剂盒</td></tr><tr><td>Iscove&amp;rsquo;s modified Dulbecco&amp;rsquo;s medium</td><td>Gibco</td><td>12440046</td><td>HAP1细胞培养基</td></tr><tr><td>lentiCas9-Blast</td><td>Addgene</td><td>52962</td><td>用于lentiBE3克隆的质粒DNA</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668027</td><td>转染试剂</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td>转染用材料</td></tr><tr><td>pCMV-BE3</td><td>Addgene</td><td>73021</td><td>用于lentiBE3克隆的质粒DNA</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td>细胞培养添加剂</td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td><td>NEB</td><td>M0530SQ</td><td>高保真DNA聚合酶</td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td>病毒制备用质粒DNA</td></tr><tr><td>pRG2</td><td>Addgene</td><td>104174</td><td>gRNA克隆载体</td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td>病毒制备用质粒DNA</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>质粒DNA提取试剂盒</td></tr><tr><td>QIAquick Gel extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>凝胶回收试剂盒</td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>PCR产物纯化试剂盒</td></tr><tr><td>Quick Ligation Kit</td><td>NEB</td><td>M2200</td><td>gRNA克隆用连接酶</td></tr><tr><td>T7 Endonuclease I</td><td>NEB</td><td>M0302</td><td>T7E1检测用材料</td></tr><tr><td>XbaI</td><td>NEB</td><td>R0145</td><td>限制性内切酶</td></tr></tbody></table>

利用crispr介导的碱基编辑器对brca1变异体进行功能评估

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

近期研究采用多种功能评估方法，如荧光报告基因检测、胚胎干细胞活力检测以及基于治疗药物的敏感性检测，探讨了与BRCA1基因突变相关的风险。尽管这些方法已阐明大量BRCA1变异体，但涉及外源性表达BRCA1变异体的检测存在过表达问题，且无法应用于转录后调控研究。为克服这些局限性，我们此前报道了一种利用CRISPR介导的胞嘧啶碱基编辑器在活细胞中诱导靶向核苷酸替换，从而实现BRCA1变异体功能分析的方法。利用该方法，我们鉴定出若干功能尚不明确的变异体，包括c.-97C&#62;T、c.154C&#62;T、c.3847C&#62;T、c.5056C&#62;T以及c.4986+5G&#62;A，并证实CRISPR介导的碱基编辑器是重新分类BRCA1基因中临床意义未明变异体的有效工具。本文中，我们详细描述了一种基于CRISPR的胞嘧啶碱基编辑器对BRCA1变异体进行功能分析的实验方案，该方案提供了靶位点选择、功能分析及BRCA1变异体评估的操作指南。

本方案中描述的实验方法可用于对由基于CRISPR的胞嘧啶碱基编辑器产生的内源性BRCA1变异体进行功能评估。为选择适用于BRCA1变异体功能评估的细胞系，研究人员应首先确认BRCA1在目标细胞系中为必需基因。例如，我们首先将Cas9和gRNA转染至HAP1细胞系中以破坏BRCA1，并通过靶向深度测序分析突变频率。我们发现，在HAP1细胞系中，突变频率随时间显著下降（图4A）。这些结果表明，BRCA1是HAP1细胞系维持细胞活力所必需的基因。为了探究C:G到T:A的替换变异是否影响BRCA1的功能，我们将编码可诱导各突变的gRNA的质粒DNA转染至HAP1-BE3细胞系，并分析了碱基替换频率。结果显示，致病性变异c.3598C&gt;T（p.Q1200*）的相对替换频率显著随时间下降，而良性变异c.4527C&gt;T（p.Y1509Y）的替换频率则在相同时间内保持稳定（图4B）。在ClinVar数据库中，...

携带BRCA1基因突变的个体患癌风险更高，因此有必要对BRCA1变异体的功能进行准确评估。本文介绍了一种利用CRISPR介导的胞嘧啶碱基编辑器在活细胞中实现靶向C:G到T:A转换的功能评估BRCA1变异体的实验方案。

利用CRISPR介导的碱基编辑器对BRCA1变异体进行功能评估

近期研究采用多种功能评估方法（如荧光报告系统）探讨了BRCA1基因突变相关的风险……

通过利用CRISPR介导的胞嘧啶碱基编辑器高效诱导点突变，可以鉴定对疾病预防和诊断具有重要意义的BRCA1变异体的功能。该技术的优势在于能够直接对内源性表达的BRCA1进行突变，从而克服了使用外源性表达BRCA1进行功能评估的局限性。BRCA1功能缺失突变的鉴定可用于预测由BRCA1突变引发的相关癌症的发病风险，例如乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌和胰腺癌。它还可用于通过搜索必需基因来发现潜在的药物靶点，这些基因在功能缺失后其存活能力会降低。首先，从美国国家生物技术信息中心（NCBI）的GenBank中获取BRCA1基因组序列，并在目标突变位点周围搜索含有原间隔序列邻近基序（NGGNCCN）的20个碱基对长的靶序列。目标突变应位于向导RNA靶序列的PAM远端4至8个核苷酸范围内。每条向导RNA订购两条免费的寡核苷酸。对于正向寡核苷酸，在向导序列的5'端添加CACCG；对于反向寡核苷酸，在5'端添加AAC，在3'端添加C。收到寡核苷酸后，将其用蒸馏水重悬，最终浓度为100微摩尔（µM）。将两条互补的寡核苷酸与T4连接缓冲液混合，使其终浓度为10微摩尔，加热至95摄氏度持续5分钟，然后冷却至室温以完成退火。使用限制性内切酶BsaI在37摄氏度下消化pRG2质粒1小时，随后将消化产物在1%琼脂糖凝胶上电泳，并纯化适当大小的条带。根据制造商说明书，使用购买的DNA连接酶将退火后的寡核苷酸双链与载体DNA连接，并将连接产物转化至DH5-alpha感受态细胞中。将转化子接种至含有100微克/毫升氨苄青霉素的琼脂平板上，于37摄氏度培养过夜。从多个转化子中提取质粒DNA，并使用在U6启动子处结合的引物通过Sanger测序分析其向导RNA序列。转染前一天，将每孔5×10⁵个HAP1-BE3细胞接种于24孔板中，培养至转染时细胞融合度达到70%至80%。根据制造商的说明书，使用购买的转染试剂转染靶向 BRCA1 的向导 RNA。使用 1 微克靶向 BRCA1 的向导 RNA 在 BRCA1 靶位点诱导 CG 转换为 TA，随后将细胞在 37 摄氏度培养，并每三至四天传代一次。转染后第 3、10 和 24 天收集细胞沉淀，以分析碱基编辑效率。使用基因组DNA纯化试剂盒提取基因组DNA。设计第一轮PCR引物以扩增BRCA1靶位点。尽管对第一轮PCR产物的大小没有限制，但建议产物大小小于1 kb，以高效扩增特定区域。根据二代测序（NGS）读长，设计位于第一轮PCR产物内部的第二轮PCR引物，并考虑扩增片段的大小。为了添加NGS分析所需的序列，需在第二轮PCR引物的5'端加入额外序列。使用高保真聚合酶，对从三个时间点获得的基因组DNA中的BRCA1靶位点进行扩增。第一次PCR反应使用100纳克基因组DNA进行15个循环的扩增。第二次PCR反应取1微升第一次PCR产物进行20个循环的扩增。取5微升第二次PCR产物在2%琼脂糖凝胶上电泳，确认片段大小。然后使用文稿中列出的引物，通过扩增第二次PCR产物来连接NGS分析所需的序列。使用不同的引物组分别扩增每个样本。每次扩增使用一微升第二次PCR产物，采用高保真聚合酶进行最多30个循环的扩增。取5 µL PCR产物在2%琼脂糖凝胶上电泳，以确认扩增片段大小，并使用 commercial PCR cleanup kit 纯化扩增产物。将各样本等量混合，构建NGS文库。使用分光光度计对NGS文库进行定量，并用重悬缓冲液或pH 8.5的10 mmol/L Tris-HCl将其稀释至1 nmol/L的浓度。准备100微升文库，稀释至适当的上样浓度。作为对照，将PhiX与稀释后的样本混合。将文库上样至芯片，并按照制造商的说明书运行高通量测序（NGS）。每个目标扩增子需获得超过 10,000 条读长，以进行碱基编辑效率的深入分析。本方案用于对基于 CRISPR 的胞嘧啶碱基编辑器生成的内源性 BRCA1 变体进行功能评估。将 CAS-9 和向导 RNA 转染至 HAP1 细胞系以破坏 BRCA1，并分析突变频率。HAP1 细胞系中的突变频率随时间显著降低，表明 BRCA1 是这些细胞存活所必需的基因。为了研究 CG 到 TA 的替换变异是否影响 BRCA1 的功能，将能够诱导每种突变的 DNA 质粒和编码向导 RNA 转染至 HAP1-BE3 细胞系，并分析了替换频率。致病性变异3598C到T（可引发无义突变）的相对替换频率显著降低，而良性变异4527C到T（同样可引发无义突变）的替换频率则随时间保持相对稳定。研究发现，这三种变异的核苷酸替换频率均呈时间依赖性下降。由于需要获得较高的初始突变频率，才能清晰地观察到随着时间推移细胞活力的变化，因此首要任务是建立优化的转染条件。该方法可用于验证其他未知的遗传变异，例如BRCA VUS。该方法可能为患者来源的未知变异的致病性及其治疗提供线索。

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Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

使用 CRISPR 介质基础编辑器对 BRCA1 变体进行功能评估

我们提供一种方法，通过RNA干扰技术耗尽细胞内源性的BRCA1蛋白，并用含有编码改变的BRCA1点突变体进行替代，在基于组织培养的体系中检测BRCA1变异体在DNA损伤同源重组修复中的功能。...

利用表达内源性野生型 BRCA1 的细胞鉴定 BRCA1 突变对同源重组的影响

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筛选基因组修饰：一种在Drosophila中鉴定CRISPR诱导突变体的方法

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CRISPR介导的碱基编辑工具：一种诱导靶向碱基替换的基因组编辑技术

用于NGS测序的基因组DNA富集是研究遗传性突变的一种简便而强大的工具。本文介绍了对11个参与DNA损伤修复的基因进行完整序列分析的实验流程。...

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本方案概述了一种基于CRISPR/Cas9的基因编辑系统，用于修复哺乳动物细胞中的点突变。在此，我们采用组合式基因编辑方法，并结合详细的后续实验策略，以检测靶位点处的插入缺失（indel）形成情况——实质上是对靶位点的诱变效应进行分析。...

一种检测人细胞中CRISPR/Cas9与单链寡脱氧核苷酸介导的定点突变修复所致原位诱变性的标准方法

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使用 dpy-10 共 CRISPR 筛选标记和组装的核糖核蛋白复合物对 C. elegans rbm-3.2 基因进行 CRISPR/Cas9 编辑。

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利用zSpRY-ABE8e实现高效无PAM限制的碱基编辑以构建斑马鱼人类遗传病模型

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通过电穿孔递送编辑器RNA在原代哺乳动物细胞中进行基因组编辑

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利用CRISPR介导的碱基编辑器对BRCA1变异体进行功能评估

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