使用 CRISPR 介质基础编辑器对 BRCA1 变体进行功能评估

通过使用CRISPR介导的细胞素基础编辑器有效诱导点突变，可以确定BRCA1变种的功能，这对疾病预防和诊断非常重要。该技术的优点是直接变异内源表达BRCA1，克服了使用外源表达BRCA1进行功能评估的局限性。识别BRCA1功能突变的丧失可用于预测与BRCA1突变相关的癌症（如乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌和胰腺癌）的发癌几率。

它还可用于寻找基本基因，这些基因的生存能力因功能耗竭而降低，从而寻找潜在的药物靶点。首先，从NCBI的GenBank获得BRCA1基因组序列，并围绕兴趣突变搜索20个碱基对目标位点和原空间相邻图案序列NGGNCCN。兴趣突变应位于引导RNA目标序列的PAM-分端的四到八个核苷酸内。

订购每指南RNA两个免费的寡核苷酸。对于前寡核苷酸，将 CACCG 添加到指南序列的 5'末端和反向寡核苷酸中，将 AAC 添加到 5'端，C 添加到 3'端。接受寡核苷酸后，将其在蒸馏水中重新悬而未决，最终浓度为100微摩尔。

将两种免费的寡核苷酸混合到最终浓度为10微摩尔的T4结结缓冲液中，加热至95摄氏度5分钟，然后冷却至室温以进行退火。在37摄氏度下使用限制酶Bsa1进行一小时的消化pRG2，然后在1%的凝胶上运行消化的产品，并净化适大小的带子。根据制造商的协议，使用购买的DNA韧带将未分离的寡核苷酸复式物与载体DNA分离，并将其转化为DH5-alpha称职细胞。

将变压器添加到每毫升两栖素含有100微克的琼脂板中，并在37摄氏度下将变压器孵育过夜。从几个变形金刚中纯化等离子体DNA，并通过桑格测序分析其引导RNA序列，用入门，在U6促进剂中处于重要性。种子五次10至第五个HAP1-BE3细胞每井在24井板前一天转染和培养他们达到70%至80%的汇合进行转体。

根据制造商的协议，使用购买的转染试剂的转染 BRCA1 目标指南 RNA。使用一微克BRCA1靶向指南RNA在BRCA1目标地点诱导CG进行TA转换，然后在37摄氏度下孵育细胞，每三到四天孵育一次亚培养。在转化后3天、10天和24天收获细胞颗粒，以分析基础编辑效率。

使用基因组DNA净化套件提取基因组DNA。设计第一个 PCR 入门器以放大 BRCA1 目标站点。虽然对第一个 PCR 产品的规模没有限制，但建议产品尺寸小于一千基，以有效放大特定区域。

根据 NGS 读数长度考虑放大器的大小，设计位于第一个 PCR 产品内的第二个 PCR 入门器。为了附加用于 NGS 分析的基本序列，在第二个 PCR 入门的 5 端添加额外的序列。利用高保真聚合酶从三个时间点获得的基因组DNA上放大BRCA1靶点。

对于第一个PCR反应，使用100纳米的基因组DNA在15个周期内进行放大。对于第二个 PCR 反应，请使用第一个 PCR 产品的一微升，进行超过 20 个周期的放大。在 2%的凝胶上运行第二个 PCR 产品的 5 微升，并确认尺寸。

然后使用文本手稿中列出的引物放大第二个 PCR 产品，从而附加 NGS 分析的基本序列。使用不同的入门集放大每个示例。使用第二台 PCR 产品的一微升，使用高保真聚合酶进行长达 30 周期的放大。

在 2%agarose 凝胶上运行 PCR 产品的 5 个微光片，以确认尺寸并使用商用 PCR 清理套件净化放大器。将每个样本等量混合以创建 NGS 库。使用光谱仪对NGS库进行量化，并使用悬念缓冲器或pH8.5的10毫摩尔Tris-HCl将其稀释为一纳米摩尔的浓度。

准备100微升的库稀释到适当的加载浓度。作为对照，PhiX 与稀释的样品相结合。将库加载到墨盒上，然后根据制造商的协议运行 NGS。

获得每个目标放大片超过 10，000 次读取，以便深入分析基础编辑效率。该协议用于对基于CRISPR的细胞素基础编辑器生成的内源BRCA1变种进行功能评估。CAS-9 和引导 RNA 被转染到 HAP1 细胞系中，以破坏 BRCA1，并分析突变频率。

随着时间的推移，HAP1细胞系的突变频率显著降低，这表明BRCA1是这些细胞细胞生存能力的基本基因。为了调查CG到TA替代变异是否影响BRCA1的功能，DNA质粒和编码指南RNA可以诱导每个突变被转染为具有HAP1-BE3细胞系。分析了替换频率。

相对替代频率为3598C到T，一种诱发无稽之谈突变的致病变种，急剧下降。而那些4527C到T，一个良性的变种，诱导一个无稽之谈的突变，与时间保持相似。研究发现，这三个变异的核苷酸替代频率以时间依赖的方式减少。

由于需要获得较高的初始突变频率，以便通过日期清楚地识别细胞存活率的变化，因此建立优化的变异条件是当务之急。此程序可用于验证其他未知的基因变异，如 BRCA VUS。它可能为患者来源的未知变种的致病性及其治疗提供线索。