利用CRISPR介导的碱基编辑器对BRCA1变异体进行功能评估

通过利用CRISPR介导的胞嘧啶碱基编辑器高效诱导点突变，可以鉴定对疾病预防和诊断具有重要意义的BRCA1变异体的功能。该技术的优势在于能够直接对内源性表达的BRCA1进行突变，从而克服了使用外源性表达BRCA1进行功能评估的局限性。BRCA1功能缺失突变的鉴定可用于预测由BRCA1突变引发的相关癌症的发病风险，例如乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌和胰腺癌。

它还可用于通过搜索必需基因来发现潜在的药物靶点，这些基因在功能缺失后其存活能力会降低。首先，从美国国家生物技术信息中心（NCBI）的GenBank中获取BRCA1基因组序列，并在目标突变位点周围搜索含有原间隔序列邻近基序（NGGNCCN）的20个碱基对长的靶序列。目标突变应位于向导RNA靶序列的PAM远端4至8个核苷酸范围内。

每条向导RNA订购两条免费的寡核苷酸。对于正向寡核苷酸，在向导序列的5'端添加CACCG；对于反向寡核苷酸，在5'端添加AAC，在3'端添加C。收到寡核苷酸后，将其用蒸馏水重悬，最终浓度为100微摩尔（µM）。

将两条互补的寡核苷酸与T4连接缓冲液混合，使其终浓度为10微摩尔，加热至95摄氏度持续5分钟，然后冷却至室温以完成退火。使用限制性内切酶BsaI在37摄氏度下消化pRG2质粒1小时，随后将消化产物在1%琼脂糖凝胶上电泳，并纯化适当大小的条带。根据制造商说明书，使用购买的DNA连接酶将退火后的寡核苷酸双链与载体DNA连接，并将连接产物转化至DH5-alpha感受态细胞中。

将转化子接种至含有100微克/毫升氨苄青霉素的琼脂平板上，于37摄氏度培养过夜。从多个转化子中提取质粒DNA，并使用在U6启动子处结合的引物通过Sanger测序分析其向导RNA序列。转染前一天，将每孔5×10⁵个HAP1-BE3细胞接种于24孔板中，培养至转染时细胞融合度达到70%至80%。

根据制造商的说明书，使用购买的转染试剂转染靶向 BRCA1 的向导 RNA。使用 1 微克靶向 BRCA1 的向导 RNA 在 BRCA1 靶位点诱导 CG 转换为 TA，随后将细胞在 37 摄氏度培养，并每三至四天传代一次。转染后第 3、10 和 24 天收集细胞沉淀，以分析碱基编辑效率。

使用基因组DNA纯化试剂盒提取基因组DNA。设计第一轮PCR引物以扩增BRCA1靶位点。尽管对第一轮PCR产物的大小没有限制，但建议产物大小小于1 kb，以高效扩增特定区域。

根据二代测序（NGS）读长，设计位于第一轮PCR产物内部的第二轮PCR引物，并考虑扩增片段的大小。为了添加NGS分析所需的序列，需在第二轮PCR引物的5'端加入额外序列。使用高保真聚合酶，对从三个时间点获得的基因组DNA中的BRCA1靶位点进行扩增。

第一次PCR反应使用100纳克基因组DNA进行15个循环的扩增。第二次PCR反应取1微升第一次PCR产物进行20个循环的扩增。取5微升第二次PCR产物在2%琼脂糖凝胶上电泳，确认片段大小。

然后使用文稿中列出的引物，通过扩增第二次PCR产物来连接NGS分析所需的序列。使用不同的引物组分别扩增每个样本。每次扩增使用一微升第二次PCR产物，采用高保真聚合酶进行最多30个循环的扩增。

取5 µL PCR产物在2%琼脂糖凝胶上电泳，以确认扩增片段大小，并使用 commercial PCR cleanup kit 纯化扩增产物。将各样本等量混合，构建NGS文库。使用分光光度计对NGS文库进行定量，并用重悬缓冲液或pH 8.5的10 mmol/L Tris-HCl将其稀释至1 nmol/L的浓度。

准备100微升文库，稀释至适当的上样浓度。作为对照，将PhiX与稀释后的样本混合。将文库上样至芯片，并按照制造商的说明书运行高通量测序（NGS）。

每个目标扩增子需获得超过 10,000 条读长，以进行碱基编辑效率的深入分析。本方案用于对基于 CRISPR 的胞嘧啶碱基编辑器生成的内源性 BRCA1 变体进行功能评估。将 CAS-9 和向导 RNA 转染至 HAP1 细胞系以破坏 BRCA1，并分析突变频率。

HAP1 细胞系中的突变频率随时间显著降低，表明 BRCA1 是这些细胞存活所必需的基因。为了研究 CG 到 TA 的替换变异是否影响 BRCA1 的功能，将能够诱导每种突变的 DNA 质粒和编码向导 RNA 转染至 HAP1-BE3 细胞系，并分析了替换频率。

致病性变异3598C到T（可引发无义突变）的相对替换频率显著降低，而良性变异4527C到T（同样可引发无义突变）的替换频率则随时间保持相对稳定。研究发现，这三种变异的核苷酸替换频率均呈时间依赖性下降。

由于需要获得较高的初始突变频率，才能清晰地观察到随着时间推移细胞活力的变化，因此首要任务是建立优化的转染条件。该方法可用于验证其他未知的遗传变异，例如BRCA VUS。该方法可能为患者来源的未知变异的致病性及其治疗提供线索。