TALEN 介导的靶向基因整合:使用工程序列特异性核酸酶将荧光蛋白基因精确插入 hiPSC 中

从培养基中的人诱导多能干细胞或hiPSC悬浮液开始。添加一对转录激活因子样效应核酸酶或TALEN编码质粒。补充带有荧光蛋白基因的供体质粒，与抗生素耐药基因偶联，具有相邻的同源臂，以与靶位点进行特异性比对。

穿孔混合物以在细胞膜中产生瞬时孔，从而实现质粒内化。一旦进入细胞，编码 TALEN 的质粒就会被处理，产生 TALEN - 嵌合蛋白，由与非特异性 FokI 限制性核酸内切酶切割结构域融合的位点特异性 TALE DNA 结合结构域组成。

每个 TALEN 单体通过其 DNA 结合结构域（包括串联氨基酸重复模块）识别并结合到每条 DNA 链上以相反方向的靶位点（每个核苷酸一个模块）结合，由间隔序列隔开。然后，FokI 结构域在间隔序列内二聚并切割 DNA，产生带有突出端的双链断裂。

在存在含有与裂解位点两侧区域互补的同源臂的供体质粒的情况下，利用同源序列作为 DNA 修复合成的模板来桥接双链断裂，从而发生同源定向修复。在切口连接后，中间的荧光蛋白和抗生素耐药基因被整合到宿主基因组中。

用含抗生素的培养基处理接种在饲养层细胞层上以支持生长的hiPSC。无启动子抗生素耐药基因 - 由上游内源性启动子驱动 - 促进 TALEN 编辑细胞的选择。

首先用PBS洗涤iPSC培养物一次，然后向每个孔中加入1毫升37摄氏度温和的细胞解离试剂，并将细胞在37摄氏度下孵育约5分钟。当超过 50% 的细胞从培养容器中解离时，使用 P1000 移液器机械破坏任何剩余的细胞团块或附着的细胞。然后，向每个孔中加入 2 毫升 E8 培养基，并使用 10 毫升移液器将培养物进一步分解成单细胞悬浮液。

现在，将收获的细胞倒入 15 毫升的锥形管中并向下旋转。将沉淀重悬于最少量的 E8 培养基中进行计数。然后，在通过台盼蓝排除确认培养物的活力及其充分解离后，将300万个细胞转移到两个15毫升锥形管中的每一个中。

在细胞离心时，将电穿孔系统设置为人胚胎干细胞系H9的细胞类型特异性程序。然后，将 10 微克同源重组供体单独添加到 1 个沉淀中作为对照样品，将 10 微克同源重组供体质粒与 5 微克每个 TALEN 质粒添加到实验样品中。

接下来，向每个对照和实验沉淀中加入 100 微升室温完全 P3 原代细胞转染溶液，并重悬细胞。将样品转移到单独的比色皿中，然后对样品进行电穿孔。转染后，立即向每个比色皿中加入500微升室温E8培养基，然后将转切的iPSC样品滴移到含有DR4小鼠胚胎成纤维细胞的单个10厘米培养皿中。