Name: 通过重组酶介导的盒式交换在重组人多能干细胞的快速高效生成 AAVS1轨迹 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: 了解利用重组酶介导盒式交换技术在人多能干细胞AAVS1位点进行快速基因编辑的方法。该技术可在15天内生成无随机整合的同基因细胞系，为干细胞生物学研究提供高效工具。

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L.O. 获得了 IWT/OZM/090838、IACS BPAMER3/08/04 以及阿拉贡政府 FMI048/08 的资助；RB 获得了 IWT 博士后奖学金 SB-121396 的支持；M.P. 由 FWO 1288714N 资助；R.S. 由荷兰糖尿病基金会资助。N.H.、J.V.、K.C. 和 Q.C. 分别获得了 IWT 博士后奖学金 SB-121396、SB-101230、SB-91228 和 SB-093228 的支持。C.M.V. 的资助来自 FWO G.0667.07、G.0975.11 和鲁汶大学（EIW-B4855-EF/05/11、ETH-C1900-PF、EME-C2161-GOA/11/012）、IWT-HEPSTEM、BELSPO-IUAP-DEVREPAIR 以及 FP7-HEMIBIO（266777）。

1. 用于转染的含FRT位点的hPSC主细胞系的制备
<ol>
	<li>根据标准操作，在灭活的小鼠胚胎成纤维细胞（iMEF）上或无饲养层条件下，分别使用hESC培养基或无饲养层iPSC培养基培养hESC/iPSC主细胞系（表1）。每种实验条件分别准备2个（有饲养层）或1个（无饲养层）6孔板中的hPSC孔。</li>
	<li>观察细胞培养状态，当细胞达到60–70%融合度时，接种耐药性iMEF（iDR4）。简要操作如下：用0.5 mL&#160;0.1%明胶溶液包被12孔板中所需孔，室温孵育5分钟。每孔接种125,000个iDR4细胞，并在iMEF培养基（表1）中过夜培养。</li>
</ol>
2. 通过核转染法对人多能干细胞进行转染
<ol>
	<li>次日，将hESC/iPSC培养物与含10 µM Rho相关蛋白激酶（ROCK）抑制剂（Y-27632）的新鲜培养基在37 °C预孵育1小时。随后，将hESC转染液从冰箱中取出，置于室温预温。</li>
	<li>制备1 mL核转染铺板培养基（表1每个核转染条件。吸去iMEF培养基，用1 mL室温PBS洗涤，加入500 µL核转染铺板培养基。将另外500 µL转移至无菌1.5 mL离心管中，于37 °C保存直至铺板。注意：典型的RMCE实验包含三种不同条件，其RMCE供体质粒与pFLPe质粒的分子比分别为2:0、2:1和0:1。</li>
	<li>将hESC/iPSC消化为单细胞悬液。
	<ol>
		<li>吸去培养基，用 2 mL 室温缓冲液洗涤&#160;PBS，并加入1 mL&#160;0.05% 胰蛋白酶或 accutase 分别用于饲养层或无饲养层的人多能干细胞（hPSC）培养。分别孵育 7 分钟（胰蛋白酶）或&#160;以及在37 °C下使用Accutase处理2 - 5分钟。Accutase处理过程中——细胞必须保持松散但仍然贴壁。</li>
		<li>小心地从培养箱中取出培养板，在不使细胞脱落的情况下，用抽吸法移除消化剂。加入1 mL&#160;更换hESC培养基，并通过轻柔地将培养基冲洗在培养皿表面来解离松散的细胞，避免产生气泡。确保细胞呈单细胞悬液状态。</li>
		<li>在洁净无菌的15或50 mL离心管中收集细胞&#160;mL&#160;管。用 1 mL 洗涤液清洗各孔&#160;hESC 培养基，并将细胞收集至相同的 15 或 50&#160;mL&#160;管。取 50 µL&#160;使用细胞计数仪对分装样品进行计数（在下一步中），记录收集的体积并计算总细胞数量。在室温下以300 × g离心5分钟，沉淀细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>重悬细胞沉淀，制成10的悬浮液6 cells/mL&#160;使用 PBS 进行 5&#160;mL&#160;血清移液管并轻柔移液，避免产生泡沫。转移2 mL&#160;每实验条件（约 2 x 106 细胞）转移至洁净、无菌的15&#160;mL&#160;管</li>
	<li>离心的同时，准备RMCE供体质粒-pFLPe 质粒混合物，最大体积为10 µL。
	<ol>
		<li>转移 2.5 µg 的 pFLPe (6.5 Kb) 至洁净无菌的 1.5&#160;mL&#160;管中。加入2:1分子比例的RMCE供体质粒13 pFLPe 载体。例如，约 10 µg 的 12 Kb RMCE 供体质粒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行核转染时，所有步骤均应避免产生泡沫。 
	&#8203;注意：一些hPSC转染方案在步骤2.4之前会额外增加一个iMEF去除步骤。然而在实际操作中，iMEF在单细胞悬液中所占比例很小，不会显著影响转染效率，也不会产生污染性的重组细胞，因为iMEF细胞不具备增殖能力。此外，在转染过程中快速操作对提高细胞存活率至关重要。基于上述原因，本方案未采用iMEF去除步骤。
	<ol>
		<li>移除 iDR4 培养板和 1.5&#160;mL&#160;从培养箱中取出含有铺板培养基的试管。每次取一支试管，小心用移液器吸去PBS，避免扰动细胞沉淀，尽可能彻底去除。用100 µL重悬沉淀&#160;用移液器轻轻吹打，将转染溶液混匀。将细胞悬液转移至1.5 mL离心管中。&#160;mL&#160;含有质粒混合物的离心管，轻轻混匀。</li>
		<li>将细胞-DNA混合物转移至转染杯中，注意避免产生气泡。将转染杯插入核转染仪，选择程序A13（饲养层培养的细胞）或F16（无饲养层培养）。 
		&#8203;注意：其他转染方法或核转染装置可能需要对这些程序或转染条件进行优化。</li>
		<li>重新取用比色杯，使用核转染试剂盒中提供的一次性移液吸头，加入0.5 mL并吸取其中内容物&#160;轻轻且迅速地一次性吸除培养基的所有体积。</li>
		<li>将液体逐滴加入含有iDR4的12孔板中，每孔500 µL&#160;铺板培养基。对下一个实验条件重复步骤 2.6.1 - 2.6.4。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将培养皿放入培养箱的架子上，缓慢前后左右移动，以均匀分散细胞悬液。孵育24小时。&#160;在下次更换培养基之前，加入10 µM ROCK抑制剂（Y-27632），使细胞在其中恢复。</li>
</ol>
3. 发生 RMCE 的细胞的阳性与阴性筛选
<ol>
	<li>每天更换培养基（每孔1 mL），转染后2-3天开始使用100 ng/mL&#160;嘌罗霉素进行筛选。 
	&#8203;注意：每种新建立的人多能干细胞（hPSC）主细胞系，其阳性与阴性筛选试剂的最佳浓度需通过实验确定。使用主细胞系进行杀灭曲线实验13，以确定嘌罗霉素和氟尿苷（FIAU）的低剂量（筛选7天后出现轻微可见毒性但未过度生长的浓度）、最佳剂量（筛选7天后所有细胞均死亡的最低浓度）和高剂量（筛选2-3天后即引起明显毒性并杀死所有细胞的浓度）。
	<ol>
		<li>吸除hESC培养基，用1 mL&#160;PBS洗涤一次，加入含100 ng/mL&#160;嘌罗霉素的hESC培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>观察细胞生长情况，使细胞死亡与增殖达到平衡。按照步骤3.1.1每日更换含嘌罗霉素的培养基。当细胞增殖速度超过死亡速度时，以25-50 ng/mL&#160;为增量逐步提高嘌罗霉素浓度，最高不超过250 ng/mL。继续嘌罗霉素筛选5-7天。</li>
	<li>在开始嘌罗霉素筛选后3-4天（约转染后第6天），开始使用0.5 µM FIAU进行筛选。每日更换培养基，并持续使用FIAU不超过连续7天。</li>
</ol>
4. RMCE 细胞系的扩增与表征
<ol>
	<li>筛选完成后，约第14至15天，可见抗性RMCE克隆，即为新的RMCE细胞系。按照标准操作程序以1:2比例进行大量传代（第1代，P1）。</li>
	<li>在12孔板中接种2孔细胞（根据原始主细胞系的常规培养条件，选择使用或不使用饲养层）。其中一孔用于后续扩增、保存或实验设置（本方案中不再额外描述这些操作），另一孔用于鉴定。</li>
	<li>当P1代细胞准备传代时，按照2.4节所述方法将培养孔中的细胞解离为单细胞悬液，并收集至15 mL离心管中&#160;mL&#160;管中。注意：使用来自hPSC WT的细胞&#160;（无基因修饰）和主细胞系分别作为表征实验的阴性对照和阳性对照。</li>
	<li>在室温下以 300 x g 离心 5 分钟。用 1 mL 重悬&#160;加入 PBS 并将样品均分为两份，分别用于流式细胞术和 DNA 分析13.</li>
	<li>流式细胞术分析13 (300 µL):
	<ol>
		<li>向 PBS 中的细胞加入胎牛血清，使其终浓度为 5%。用细胞滤网将细胞转移至洁净的 FACS 管中，并置于冰上保存。 
		&#8203;注意：在此条件下细胞活力较高，因此可以但不是必须使用非活细胞荧光染料进行染色（例如， 7-AAD 或 PI</li>
		<li>立即在流式细胞仪细胞分析仪中进行分析，并记录20,000 - 30,000个事件。分析时，使用野生型阴性对照样本，将设门阈值设定在GFP或tdT背景荧光信号以上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>DNA分析13 (700 µL):
	<ol>
		<li>将细胞转移至一个洁净的1.5&#160;mL&#160;离心管。在室温下以300 × g离心5分钟，吸除上清液。使用商业试剂盒进行DNA提取，并按照制造商说明书操作。将干燥的沉淀物于-20 °C保存，以备后续分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>测定DNA浓度。
	<ol>
		<li>根据以下条件制备标准PCR反应 图3 和 表213在含有1×DNA凝胶染料的2%琼脂糖凝胶上以150 V电压电泳15–25分钟。使用凝胶成像系统分析结果。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+human+pluripotent+cells+using+TALE+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases.</a> Nat. Biotechnol. 29 (8), 731-734 (2011).</li>
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<li>Takata, Y., Kondo, S., Goda, N., Kanegae, Y., Saito, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+efficiency+between+FLPe+and+Cre+for+recombinase-mediated+cassette+exchange+in+vitro+and+in+adenovirus+vector+production%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+to+Cells%22%5BJournal%5D)">Comparison of efficiency between FLPe and Cre for recombinase-mediated cassette exchange in vitro and in adenovirus vector production.</a> Genes to Cells. 16 (7), 765-777 (2011).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在人多能干细胞（hPSCs）中建立转基因技术，基因编辑方法在安全港位点的应用仍是一项关键工具。尽管AAVS1位点在某些应用中的安全港特性最近受到质疑13,18，但该位点目前仍是人类来源细胞系中特征最明确的安全港位点。了解其在hPSCs中的局限性有助于获得可靠的数据。因此，AAVS1仍被认为是一个有用的靶位点，&#160;例如用于&#160;需要在特定遗传背景下实现同基因型环境的基因功能获得与缺失研究，或因子的诱导型/组成型表达。
AAVS1 位点已被多个研究团队利用 ZFNs、TALEN 或 CRISPR/Cas91,2,19 进行靶向操作。这些核酸酶可显著提高特定基因位点同源重组的效率。然而，筛选并全面鉴定正确靶向的克隆，排除随机整合事件，并维持多能性与基因组完整性&#160;，可能需要长达 3 个月的时间（使用优化的基因编辑工具）（图 3）。后两个问题可能由脱靶核酸酶活性引发的潜在突变所致。然而，本研究所采用的 RMCE 系统提供了一种快速、高效且精巧的方法，一旦重组酶特异性靶序列已预先整合至 AAVS1 位点，仅需两周即可实现该目标。阳性/阴性筛选与合理的筛选方案是通过 RMCE 简化 AAVS1 位点基因编辑的主要因素。
新转基因品系的基因型鉴定工作显著减少（无需进行克隆筛选），并且由于FLPe对FRT位点具有高度特异性，因而无需再进行与核酸酶脱靶活性相关的鉴定。在常规的RMCE实验中，鉴定步骤也可进一步简化：只需证明主细胞系中的GFP表达完全消失（图2A），因为完整的表达盒替换以及无随机整合的现象，已通过PCR（图2B）和Southern印迹13得到充分验证。采用正/负筛选策略也是本方法与以往报道的主要区别。此前多个研究组在人多能干细胞（hPSCs）中报道过RMCE技术，无论靶向AAVS1位点或其他位点，均仅使用单一的正向筛选步骤7,14,16。这种方法相较于使用核酸酶进行的基因编辑并无显著技术优势，因为在克隆水平上仍需进行同等程度的克隆筛选，以证实正确整合且不存在随机整合。
在多个人类胚胎干细胞（hESC）或诱导多能干细胞（iPSC）系中使用该RMCE系统，需要预先将含有FRT的表达盒整合到各个独立细胞系的AAVS1位点。然而，一旦构建完成，该系统因其快速和简便的特性，使得在明确的同基因背景下开展上述应用的半高通量遗传筛选成为可能，而此类筛选若采用传统方法则技术上极为耗时。此外，所有RMCE载体均构建于pZ AAVS1基因靶向载体中，该载体最初用于ZFN介导的位点靶向，但也有报道使用TALEN或CRISPR/Cas9系统实现靶向。RMCE载体的双重用途特性在hPSC中生成携带或不携带FRT的多个转基因细胞系方面具有高度实用性。例如，在通过RMCE进行的特定遗传筛选中获得的一个阳性克隆，理想情况下需在多个hPSC&#160;系中进行验证以确认结果。若缺乏多个适于RMCE的主细胞系，则可采用核酸酶直接对阳性克隆进行基因靶向操作。我们课题组已证实了RMCE载体双重特性的实用性20。在该研究中，针对携带导致PROGRANULIN（PGRN）表达缺陷突变的额颞叶痴呆（FTD）患者来源iPSC进行了基因校正。通过ZFN介导将可恢复PGRN表达水平的表达盒插入AAVS1位点，成功纠正了由该突变引起的皮层发育缺陷表型。此外，还利用RMCE在野生型hESC中构建了相应的对照细胞系，用于外源性PGRN表达的研究。
若未观察到重组菌落，请检查RMCE供体质粒的转染效率。当转染效率高于30%时，可获得上述结果；较低的转染效率会降低重组效率。最后，该RMCE系统虽构建于AAVS1位点，但同样适用于其他任何位点。

靶向基因组重组促进了多个研究领域的快速发展。在小鼠中，基因组编辑与干细胞研究的协同作用加深了人们对基因功能和基因调控复杂机制的理解。人们也期待在人类多能干细胞（hPSCs）中取得类似的进展；然而，自首次分离人类胚胎干细胞（hESCs）以及后来的人类诱导多能干细胞（hiPSCs）以来的多年间，基因编辑一直是一项技术难题。近年来，利用靶向核酸酶进行基因组工程的技术取得了进展——包括锌指核酸酶（ZFNs）、转录激活因子样效应物核酸酶（TALEN）以及成簇规律间隔短回文重复序列/CRISPR相关蛋白9（CRISPR/Cas9）&#160;，使我们能够克服这些困难，使靶向重组成为一种高效的流程1-3。
小鼠基因组中可在无不良影响的情况下实现外源基因稳定、可靠且普遍表达的特定位点&#160;例如 Rosa26, Hprt1，或 Col1A1&#160;已成为遗传学研究中不可或缺的工具。安全港位点使得在同基因背景下对不同小鼠品系进行可比性分析成为可能。而使用标准的随机整合方法则无法实现这一点，因为后者存在众所周知的局限性，例如插入突变、剂量依赖性效应或转基因表达的异质性。通过使用位点特异性靶向重组酶（如 Cre 或 Flippase（FLPe）），可显著提高在安全港位点进行基因编辑的便捷性与灵活性；这些重组酶可特异性识别目标序列（分别为 loxP 或 FRT），并在相同的目标序列之间催化高效的重组反应。基于上述特性，在预先整合的安全港位点中利用 loxP 或 FRT 序列介导的重组酶进行基因编辑，已成为小鼠转基因研究中的常用工具。除表达盒的插入或切除外&#160;在相同靶序列之间介导时，利用不相容的 loxP 或 FRT 位点可实现重组酶介导的基因表达盒替换（RMCE）4.
在人类中，已开展寻找安全港位点的研究。小鼠的同源位点 次黄嘌呤磷酸核糖转移酶， 尽管其与导致功能缺失的莱施-奈恩综合征相关， ROSA26 已在hPSCs中被靶向。 HPRT 在ESC中被报道会迅速沉默转基因表达，且类似于 ROSA26 其在终末分化细胞中维持转基因表达的能力尚未被研究5-7. 由于纯合性无效突变的 CCR5 该基因在人类中似乎具有良好的耐受性，因此其作为安全港位点的价值得到了评估。 CCR5 被靶向并被报道可在包括胚胎干细胞在内的不同人类细胞系中维持外源基因的稳定表达8,9然而，后者在长期培养的单克隆水平上尚未得到验证，且未在三个胚层来源的分化后代中证实转基因的普遍表达。 AAVS1，作为2型腺相关病毒（AAV）的天然整合位点，也在hESC中进行了测试，因其被报道具有抵抗转基因沉默的特性10. 随后，许多研究团队采用了该方法 AAVS1 基因座，并在未分化的hPSCs及其所有分化后代中描述了稳定的转基因表达&#160;三个胚层，两者均 体外 和 在体内2,8,11,12然而，最近的研究结果对这些发现提出了更为细致的解读， AAVS1 该位点被发现具有可变的转基因抑制作用 体外 在未分化的hESCs及肝细胞后代中13.
采用随机整合方法及确定单拷贝整合的技术进行的额外筛选研究，旨在发现基因组中在人多能干细胞扩增与分化过程中对转基因沉默具有抗性的整合位点14,15总体而言，迄今为止，尚未有任何基因组位点被充分验证为人类多能干细胞（hPSCs）及其分化后代中的安全港；仍需鉴定出合适的位点，以实现外源基因在hPSCs及其分化后代中普遍且稳定的表达 体外 和 在体内，仍有待解决。在所有已研究的位点中，尽管存在局限性， AAVS1 仍是干细胞研究中表征最充分且使用最广泛的。
在这些位点中的部分位点，已成功在hPSCs中实现RMCE6,7,14,16，主要使用Cre重组酶，尽管有研究表明FLPe的效率高于Cre17。在所有这些案例中，均使用一种阳性药物抗性盒来筛选重组克隆。尽管该方法可行，但这些流程相较于使用ZFNs、TALENs或CRISPR/Cas9的标准基因编辑技术并未构成技术上的进步，因为单一抗生素筛选无法排除随机整合，仍需进行克隆筛选以鉴定正确靶向的克隆。
在此方案中，我们描述了在 hPSCs 中进行 RMCE 的方法 AAVS1 位点，结合阳性（位于新插入的表达盒内）和阴性（位于预先整合的表达盒内）筛选策略，从而实现多克隆转基因细胞系的构建 &#177;15天内完成，效率达100%，且无随机整合事件。因此，该方法在人多能干细胞的重组酶介导的盒式交换技术方面较现有报道的方法有所进步。

<table><tbody><tr><td>DR4 小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）</td><td>AMS bio</td><td>GSC-6204G</td><td>hPSC 在饲养层上的培养</td></tr><tr><td>CF-1 MEF，经丝裂霉素-C处理</td><td>AMS Bio</td><td>GSC-6001M</td><td></td></tr><tr><td>EmbryoMax 0.1% 明胶溶液</td><td>Millipore</td><td>ES-006-B</td><td>iMEF 铺板</td></tr><tr><td>DMEM/F-12，HEPES</td><td>Gibco</td><td>31330-038</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut血清替代物 &lt;p&gt;&lt;/p&gt; &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td><td>Gibco</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8540</td><td>hESC 培养基</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺，200 mM</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>iMEF 培养基的配制</td></tr><tr><td>2-巯基乙醇，50&amp;nbsp;mM</td><td>Gibco</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>MEM非必需氨基酸溶液（100倍浓缩）</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10,000 U/mL）</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>人源碱性成纤维细胞生长因子</td><td>Peprotech</td><td>100-18C</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 溶液</td><td>VWR</td><td>688001-500</td><td></td></tr><tr><td>DMEM高糖</td><td>Gibco</td><td>41965-039&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.05%），酚红</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>hPSC 在饲养层上的培养</td></tr><tr><td>基质胶，hESC 级别</td><td>VWR</td><td>734-1440</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 完全培养基试剂盒</td><td>干细胞技术</td><td>05850</td><td>无饲养层培养</td></tr><tr><td>StemPro Accutase 细胞解离试剂</td><td>Gibco</td><td>A1110501</td><td>无饲养层培养</td></tr><tr><td>Y-27632 溶液</td><td>VWR</td><td>56726</td><td></td></tr><tr><td>人类干细胞核转染试剂盒2</td><td>Lonza</td><td>VVPH-5022</td><td></td></tr><tr><td>嘌呤霉素二盐酸盐</td><td>Gibco</td><td>A11138-03</td><td></td></tr><tr><td>FIAU（氟脲苷）</td><td>ABX</td><td>2910</td><td></td></tr><tr><td>潮霉素B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3274</td><td></td></tr><tr><td>pFLPe</td><td></td><td></td><td>从 pCAGGS-FLPe（MES4488，Open Biosystems）改造而来，以去除嘌呤霉素抗性基因</td></tr><tr><td>RMCE 供体质粒</td><td>-</td><td>-</td><td>源自 pZ 供体质粒的修饰 &lt;em&gt;AAVS1 &lt;/em&gt;嘌呤霉素载体（PZD0020-1KT，Sigma Aldrich）&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>5 mL 圆底聚苯乙烯试管，带细胞筛</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>PureLink 基因组 DNA 试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>K182001</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Flexi DNA聚合酶</td><td>普洛麦格</td><td>M8298</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>西格玛</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA凝胶染料</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector 2b 仪器</td><td>龙沙（Amaxa）</td><td>AAB-1001</td><td></td></tr><tr><td>NucleoCounter NC-100</td><td>Chemometec</td><td>NC-100</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS Canto</td><td>BD Biosciences</td><td>337175</td><td></td></tr><tr><td>NucleoCassette</td><td>Chemometec</td><td>941-0002</td><td></td></tr></tbody></table>

通过aavs1位点的重组酶介导的盒式交换快速高效地生成重组人多能干细胞

Rapid and Efficient Generation of Recombinant Human Pluripotent Stem Cells by Recombinase-mediated Cassette Exchange in the AAVS1 Locus

尽管CRISPR-Cas9引领了基因靶向技术的革命，人类多能干细胞的遗传修饰&#160;(人多能干细胞 (hPSCs)&#160;仍然耗时较长。使用将转基因整合到安全港位点的重组品系进行比较研究时，可受益于位点特异性靶向重组酶（如 Cre 或 FLPe）相关方法，这些方法速度更快，且脱靶效应更少。尽管已有相关方法的报道，但在大多数方面其性能并未显著优于基因靶向技术。我们先前利用锌指核酸酶构建了一株主细胞系 AAVS1 基因座 hPSCs&#160;包含一个由异源FRT序列侧翼的GFP-潮霉素-tk表达盒。本文描述了利用该细胞系进行FLPe重组酶介导的盒式交换（RMCE）的操作步骤。将含有无启动子的嘌呤霉素抗性基因的RMCE供体质粒以及FLPe重组酶共转染至主细胞系中。通过正向（嘌呤霉素）和负向（FIAU）筛选程序，可获得仅发生RMCE而无随机整合的细胞克隆。RMCE可在15天内生成完全表征的多能性多克隆转基因细胞系&#160;效率为100%。尽管最近已报道了其局限性 AAVS1 基因座，该系统的便捷性为在同基因背景下进行人多能干细胞（hPSC）转基因操作铺平了道路，对于比较研究十分必要，并可实现半高通量的基因筛选，用于基因功能获得/缺失分析，而这些分析若采用传统方法将极为耗时。

使用 AAVS1特异的ZNFs，已生成并描述了包含异源FRT靶序列的完全表征的人胚胎干细胞/诱导多能干细胞主细胞系13含FRT的主细胞系在经ZFN处理后仍维持多能性和基因组完整性，并稳定表达GFP 体外 和 体内. 通过将主细胞系与FLPe重组酶和RMCE供体质粒共同转染来进行RMCE操作（图1A）。RMCE 载体包含与靶位点中相同的 FRT 序列 AAVS1 主细胞系，其侧翼为转基因。 图1B 使用组成型表达的tdT监测RMCE pZ:F3-P CAGGS tdTPH-F 转染后，hPSC 在 iDR4 MEF 层上形成均匀分布的小细胞团，且转染的 hPSC 同时表达 GFP 和瞬时 tdT图1B，D 2）。转染后让细胞恢复 2 - 3 天再开始筛选。首先使用低剂量嘌呤霉素进行阳性筛选，以促进 RMCE 供体质粒的插入。初始阶段应温和加入嘌呤霉素，因为早期大量细胞死亡可能导致单个细胞发生重组但无法存活。在随后几天中，需逐步提高嘌呤霉素浓度至最佳剂量，使重组细胞能够生长形成小克隆，而非重组细胞则逐渐死亡。
在开始阳性筛选后的3至4天（转染后约第6天），启动阴性筛选，以确保仅保留由FRT介导的重组事件。RMCE会导致胸苷激酶（Tk）自杀基因的丢失，从而使细胞对氟尿苷（FIAU）产生抗性。在此阶段施加阴性筛选，可使少量2至4个GFP-/tdT+（RMCE）细胞形成的细胞簇在FIAU最佳浓度下存活（图1B，第6天），从而排除随机整合事件，因为在随机整合中，AAVS1位点中的Tk基因仍保持完整。FRT介导的重组与随机整合同时发生的概率极低，后续鉴定结果中未检测到随机整合事件即证明了这一点（图2B）。
混合的RMCE GFP-/tdT+ 克隆持续生长，并逐渐变得更加均一，因此在转染后第9至10天（D 9 - 10），可观察到一些尚未完全筛选的混合RMCE克隆（图1B）。仅当同时使用RMCE供体质粒和FLPe质粒（2:1）时，才会出现GFP-/tdT+ RMCE克隆；而在无FLPe的情况下（2:0），不发生RMCE。转染后第13至15天使用FIAU进行完全筛选，可获得均一的GFP-/tdT+ 细胞群体。RMCE在15天内平均产生12.8 ± 6.8（n = 6）个PuroR/FIAUR 克隆13。对新建立的RMCE细胞系（将PuroR/FIAUR RMCE克隆合并为非克隆性细胞群体）进行流式细胞术分析，证实100%的细胞均呈现RMCE的GFP-/tdT+ 表型（图2A）。当使用的RMCE供体质粒不含组成型表达的荧光报告基因时，所获得的PuroR/FIAUR RMCE人多能干细胞系在GFP表达上呈均一阴性（GFP-）。
非克隆性RMCE细胞系的PCR鉴定表明，已实现完整的盒式交换（无法检测到主细胞系中原始盒式结构的任何痕迹），并且所用筛选程序可产生无随机整合的细胞系（RMCE供体质粒和FLPe表达载体均无随机整合）（图2B）。这些结果进一步通过Southern印迹分析得到验证，此外，我们还证实RMCE细胞系仍保持多能性13。因此，在常规RMCE实验中，不再需要进行全基因组水平的随机整合评估或多能性检测。综上所述，采用本方案可在15天内以100%的效率快速获得在AAVS1位点整合且无随机整合的hPSC转基因细胞系，且无需进行 extensive 的表征分析。
<img alt="基因编辑过程示意图，显示GFP和tdT荧光显微镜结果；嘌呤霉素筛选时间线。" src="/files/ftp_upload/54718/54718fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1： RMCE的示意图概述。 （A）RMCE筛选程序的时间线。左侧：主细胞系（MCL），携带一个由FRT位点侧翼（三角形）的表达盒（包含通过2A自剪切肽连接的GFP和潮霉素-tk），通过核转染（NF）共转染表达FLPe的载体和RMCE供体质粒，后者包含一个无启动子的嘌呤霉素抗性基因（剪接受体-SA-PuroR）以及一个可变的实验表达盒（X）。右侧：在完成嘌呤霉素（红色三角形）和FIAU（蓝色线条）筛选后获得的新RMCE细胞系（RMCEL）。（B）使用组成型表达tdT的供体质粒，并以不同比例的供体DNA与FLPe DNA（0:1、2:1、2:0）进行RMCE，通过荧光显微镜（GFP—绿色荧光，tdT—红色荧光）在不同时间点监测结果。第2天和第6天：比例尺代表100 µm。第10天：比例尺代表200 µm。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54718/54718fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术和凝胶电泳；干细胞中的GFP、tdT标记物；基因修饰分析。" src="/files/ftp_upload/54718/54718fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2： RMCE细胞系的表征。 （A）通过流式细胞术确定RMCE。显示了野生型细胞系（WT）、主细胞系（MCL）以及在核转染后第15天使用组成型tdT表达载体（CAGGS tdT）或由GOOSECOID启动子（GSCp GFP，定型内胚层标志物）或AAT启动子（APOeAATp GFP，肝细胞标志物）驱动GFP表达的供体质粒所生成的新RMCE细胞系中GFP和tdT的表达情况。（B）通过PCR使用所示引物对，验证RMCE（5'/3' JA RMCEL）、主细胞系（MCL）载体盒的缺失（5'/3' JA MCL）以及无随机整合（5'/3'/FLPe RI）。使用的DNA样本来自WT、MCL、RMCE细胞系（1–5）、含随机整合的供体RMCE载体（+RI）、表达FLPe的载体以及无模板对照（NTC）。本图改编自（Ordovas et al., 2015）13。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54718/54718fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="基因靶向和RMCE示意图；ZFNs、FLPe转染、GFP、筛选过程；克隆筛选。" src="/files/ftp_upload/54718/54718fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. RMCE适用的主细胞系的建立及在AAVS1位点进行基因靶向与RMCE的比较。 左图：基因靶向使用未经修饰的野生型细胞，共转染供体质粒（用于构建主细胞系MCL，其表达盒如图1A所述）和特异性优化的ZFNs。完成全部鉴定过程最长需要3个月。右图：RMCE通过将供体质粒与FLPe载体共转染实现，可在15天内获得完全鉴定的细胞系。在AAVS1位点的基因靶向效率数据来自先前的研究1,2。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54718/54718fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>培养基</td>
			<td>组分</td>
			<td>终浓度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="7">hESC 培养基</td>
			<td>DMEM-F12, HEPES</td>
			<td>80%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>血清替代培养基</td>
			<td>20%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-谷氨酰胺</td>
			<td>146 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM 非必需氨基酸溶液 (100x)</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-巯基乙醇</td>
			<td>0.1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>青霉素/链霉素</td>
			<td>0.1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）</td>
			<td>4 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="6">iMEF 培养基</td>
			<td>DMEM 高糖</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>胎牛血清 (FBS)</td>
			<td>15%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>青霉素-链霉素</td>
			<td>0.1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-谷氨酰胺 200 mM</td>
			<td>4 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM 非必需氨基酸溶液 (100x)</td>
			<td>2x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-巯基乙醇</td>
			<td>0.1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">铺板培养基</td>
			<td>hESC 培养基</td>
			<td>100%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK 抑制剂 (Y-27632)</td>
			<td>10 µM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 培养基成分。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>检测</td>
			<td colspan="2">正向引物</td>
			<td colspan="2">反向引物</td>
			<td>扩增子</td>
			<td>PCR 循环程序</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5’JA MCL</td>
			<td colspan="2">CACTTTGAGCTCTACTGGCTTC</td>
			<td colspan="2">CGTTACTATGGGAACATACGTCA</td>
			<td>1.1 Kb</td>
			<td>95 ºC, 5’ – [95 ºC, 30’’ – 68 ºC (-0.5 ºC/cycle), 1’ 30’’]X15 – [95 ºC, 30’’ – 58 ºC, 30’’ – 72 ºC, 1’ 30’’]X25 – 72 ºC, 5’</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3’JA MCL</td>
			<td colspan="2">TAACTGAAACACGGAAGGAG</td>
			<td colspan="2">AAGGCAGCCTGGTAGACA</td>
			<td>1.4 Kb</td>
			<td>95 ºC, 5’ – [95 ºC, 30’’ – 68 ºC (-0.5 ºC/cycle), 1’ 30’’]X15 – [95 ºC, 30’’ – 58 ºC, 30’’ – 72 ºC, 1’ 30’’]X25 – 72 ºC, 5’</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5’JA RMCEL</td>
			<td colspan="2">CACTTTGAGCTCTACTGGCTTC</td>
			<td colspan="2">CATGTTAGAAGACTTCCTCTGC</td>
			<td>1.1 Kb</td>
			<td>95 ºC, 5’ – [95 ºC, 30’’ – 68 ºC (-0.5 ºC/cycle), 1’ 30’’]X15 – [95 ºC, 30’’ – 58 ºC, 30’’ – 72 ºC, 1’ 30’’]X25 – 72 ºC, 5’</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3’JA RMCEL</td>
			<td colspan="2">TTCACTGCATTCTAGTTGTGG</td>
			<td colspan="2">AAGGCAGCCTGGTAGACA</td>
			<td>1.5 Kb</td>
			<td>95 ºC, 5’ – [95 ºC, 30’’ – 68 ºC (-0.5 ºC/cycle), 1’ 30’’]X15 – [95 ºC, 30’’ – 58 ºC, 30’’ – 72 ºC, 1’ 30’’]X25 – 72 ºC, 5’</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5’RI DONOR</td>
			<td colspan="2">GTACTTTGGGGTTGTCCAG</td>
			<td colspan="2">TTGTAAAACGACGGCCAG</td>
			<td>0.5 Kb</td>
			<td>95 ºC, 5’ – [95 ºC, 30’’ - 60 ºC, 30’’ - 72 ºC, 30’’]X25 – 72 ºC, 5’</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3’RI DONOR</td>
			<td colspan="2">CCTGAGTTCTAACTTTGGCTC</td>
			<td colspan="2">ACACAGGAAACAGCTATGAC</td>
			<td>0.5 Kb</td>
			<td>95 ºC, 5’ – [95 ºC, 30’’ - 60 ºC, 30’’ - 72 ºC, 30’’]X25 – 72 ºC, 5’</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RI FLPe</td>
			<td colspan="2">CCTAGCTACTTTCATCAATTGTG</td>
			<td colspan="2">GTATGCTTCCTTCAGCACTAC</td>
			<td>0.65 Kb</td>
			<td>95 ºC, 5’ – [95 ºC, 30’’ - 60 ºC, 30’’ - 72 ºC, 30’’]X25 – 72 ºC, 5’</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2. 用于PCR基因分型的引物序列组合。 修改自 Ordovas 等，201513。

在此，我们报告一种基于RMCE的快速高效基因编辑方法 AAVS1 人类多能干细胞（hPSCs）的基因座，该系统较以往描述的系统有所改进。利用此技术，可快速、可靠地生成同基因型细胞系，从而开展恰当的比较研究，推动以转基因介导的科研工作 hPSCs.

通过AAVS1位点的重组酶介导的盒式交换快速高效地生成重组人多能干细胞

尽管CRISPR-Cas9引领了基因靶向技术的革命，人类多能干细胞（hPSCs）的遗传修饰仍然……

本实验的主要目标是利用重组酶介导的盒式交换（RMCE）方法，通过翻转酶系统在人多能干细胞（human PSCs）的AAVS1位点进行快速、高效的靶向基因组编辑。RMCE可提高外源序列在AAVS1位点的靶向插入效率，在干细胞生物学研究中具有重要意义，因其可通过过表达或基因敲低手段快速验证分子功能。该技术的主要优势在于，仅需15天即可获得无随机整合事件、仍保持多能性且核型正常的hPSC细胞系。该方法为在AAVS1位点进行转基因提供了有用的工具，也可应用于其他人源许可位点。首先，将人多能干细胞（PSC）主细胞系在六孔板中，按照标准操作培养于灭活的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）或iMEFs上或去除iMEFs后进行培养。当细胞融合度达到60%至70%时，通过使用0.1%明胶溶液包被12孔板中所需孔板，并在室温下孵育5分钟，随后接种耐药性iMEFs。然后，每孔接种125,000个iDR4细胞，并用iMEF培养基过夜培养。次日，在37摄氏度条件下，用含有10微摩尔ROCK抑制剂的新鲜培养基预孵育人多能干细胞（PSC）培养物1小时。同时，将人胚胎干细胞（ESC）转染溶液和细胞解离试剂恢复至室温。每种电转染条件准备一毫升核转染铺板培养基。然后，从孔中移除iDR4培养基，用一毫升室温PBS洗涤细胞，并加入核转染铺板培养基。将每份样品500微升的铺板培养基转移至无菌的1.5毫升离心管中，置于37摄氏度保存，直至进行铺板。为了将人多能干细胞（PSCs）解离为单细胞悬液，先移除培养基，用室温的PBS洗涤细胞，然后分别向饲养层或无饲养层的hPSC培养物中加入1毫升0.05%胰蛋白酶或Accutase。将培养物在37摄氏度孵育。随后，小心地从孵箱中取出培养板，在细胞尚未解离前，吸除消化试剂，并加入1毫升人多能干细胞培养基。通过轻柔地将培养基冲洗培养板表面来分离松散的细胞，同时避免产生气泡。将细胞收集至干净无菌的15或50毫升离心管中，形成单细胞悬液。然后用1毫升hESC培养基洗涤细胞，并收集至同一管中。取50 µL细胞悬液用于计数，将剩余细胞在室温下以300 × g离心5分钟。在细胞悬液离心的同时，使用细胞计数仪进行细胞计数。弃去上清液，加入室温的PBS，轻轻重悬细胞沉淀，使细胞浓度为10⁶ 个细胞/毫升。然后，将每个实验条件下两毫升样品转移至洁净的无菌15毫升离心管中，并重复离心操作。在样品离心的同时，用三个洁净的1.5毫升离心管配制质粒混合物，分别使用0:1、2:1和2:0的供体质粒与Flippase的分子比，每管中含2.5微克Flippase质粒。为进行核转染，从培养箱中取出iDR4培养板以及含有铺板培养基的1.5毫升离心管。一次取一支离心管，小心吸取上清 PBS，尽量去除缓冲液，切勿扰动管底沉淀。加入 100 微升转染溶液，轻轻吹打使沉淀重悬。随后，将细胞悬液转移至含有质粒混合物的 1.5 毫升离心管中，轻轻混匀。将细胞DNA混合物转移至电转杯中，注意避免产生气泡。将电转杯插入核转染仪中，对饲养层培养的细胞运行程序A13，或对无饲养层的细胞运行程序F16。取出电转杯后，使用试剂盒中的一次性转移移液管，轻柔但迅速地一次性加入0.5毫升铺板培养基。然后，以相同方式回收体积，并将细胞悬液逐滴加入含有 iDR4 和铺板培养基的 12 孔板中。将培养皿放入培养箱的架子上，缓慢前后左右移动，使细胞悬液均匀分布。更换培养基前，先将培养皿孵育 24 小时。转染后两到三天开始筛选。吸除培养基，用1毫升PBS洗涤细胞，然后加入含100纳克/毫升嘌呤霉素的人胚胎干细胞培养基。观察细胞生长情况，并根据需要逐步提高嘌呤霉素浓度，最高至250纳克/毫升，持续进行嘌呤霉素筛选七天。在嘌呤霉素筛选3至4天后，开始使用0.5微摩尔的氟代尿苷（fialuridine）或FIAU进行筛选。每天更换培养基，FIAU处理持续时间不得超过连续7天。筛选完成后，约第14至15天，将出现具有抗性的RMCE克隆，即构成新的RMCE细胞系。按照标准操作程序以1:2的比例对细胞进行传代。当关键步骤1中的孔板准备传代时，将用于表征的孔中的细胞按此前视频中所述方法解离为单细胞悬液，并收集至15毫升离心管中。在室温下以300 × g离心5分钟，沉淀细胞。然后，使用一毫升 PBS 重悬细胞，并将样品分为两份。一份通过细胞滤网过滤后用于流式细胞术分析，另一份根据文本方案用于 DNA 分析。在转染 flippase 重组酶和 tdT RMCE 供体质粒后，hPSCs 在 iDR4 MEF 层上形成均匀分布的小细胞簇，并表达组成型 GFP 和瞬时 tdT。使用嘌呤霉素进行阳性筛选有利于RMCE供体质粒的插入，随后使用FIAU进行阴性筛选，以获得仅由FRT介导且不含有TK基因的重组事件。转染后约第六天，可观察到少量RMCE GFP阴性、tdT阳性细胞的小簇。如本实验所示，仅在同时使用RMCE供体质粒和Flippase的情况下，才会出现GFP阴性、tdT阳性的RMCE克隆；而在缺乏Flippase的情况下则不会发生RMCE。通过对新建立的RMCE细胞系（即嘌呤霉素和FIAU抗性的RMCE克隆）进行流式细胞术分析，并将其混合为非单克隆细胞群体，结果证实其中100%的细胞均表现为RMCE GFP阴性、tdT阳性的表型。当使用在hPSC中无记录活性的RMCE供体时，100%的细胞GFP呈阴性。此处展示的非克隆性RMCE细胞系的PCR鉴定结果表明，已实现完整的盒式交换，并且所用筛选程序可产生无随机整合的细胞系，即RMCE供体和表达Flippase的载体均未发生随机整合。总之，与靶向核酸酶相比，该RMCE方法显著简化了hPSC在特定基因座上的基因编辑。一旦掌握，该技术可在15天内完成。因此，RMCE是一种非常快速的基因编辑工具，能够在同基因背景下实现比较研究。使用该程序时，重要的是要确保转染效率高于30%，并预先进行适当的核心储存筛选剂处理。观看本视频后，您应能够充分掌握如何在人多能干细胞（PSCs）的AAVS1位点进行RMCE操作，以及如何对重组细胞系进行表征。

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