通过AAVS1位点的重组酶介导的盒式交换快速高效地生成重组人多能干细胞

本实验的主要目标是利用重组酶介导的盒式交换（RMCE）方法，通过翻转酶系统在人多能干细胞（human PSCs）的AAVS1位点进行快速、高效的靶向基因组编辑。RMCE可提高外源序列在AAVS1位点的靶向插入效率，在干细胞生物学研究中具有重要意义，因其可通过过表达或基因敲低手段快速验证分子功能。该技术的主要优势在于，仅需15天即可获得无随机整合事件、仍保持多能性且核型正常的hPSC细胞系。

该方法为在AAVS1位点进行转基因提供了有用的工具，也可应用于其他人源许可位点。首先，将人多能干细胞（PSC）主细胞系在六孔板中，按照标准操作培养于灭活的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）或iMEFs上或去除iMEFs后进行培养。当细胞融合度达到60%至70%时，通过使用0.1%明胶溶液包被12孔板中所需孔板，并在室温下孵育5分钟，随后接种耐药性iMEFs。

然后，每孔接种125,000个iDR4细胞，并用iMEF培养基过夜培养。次日，在37摄氏度条件下，用含有10微摩尔ROCK抑制剂的新鲜培养基预孵育人多能干细胞（PSC）培养物1小时。同时，将人胚胎干细胞（ESC）转染溶液和细胞解离试剂恢复至室温。

每种电转染条件准备一毫升核转染铺板培养基。然后，从孔中移除iDR4培养基，用一毫升室温PBS洗涤细胞，并加入核转染铺板培养基。将每份样品500微升的铺板培养基转移至无菌的1.5毫升离心管中，置于37摄氏度保存，直至进行铺板。

为了将人多能干细胞（PSCs）解离为单细胞悬液，先移除培养基，用室温的PBS洗涤细胞，然后分别向饲养层或无饲养层的hPSC培养物中加入1毫升0.05%胰蛋白酶或Accutase。将培养物在37摄氏度孵育。随后，小心地从孵箱中取出培养板，在细胞尚未解离前，吸除消化试剂，并加入1毫升人多能干细胞培养基。

通过轻柔地将培养基冲洗培养板表面来分离松散的细胞，同时避免产生气泡。将细胞收集至干净无菌的15或50毫升离心管中，形成单细胞悬液。然后用1毫升hESC培养基洗涤细胞，并收集至同一管中。

取50 µL细胞悬液用于计数，将剩余细胞在室温下以300 × g离心5分钟。在细胞悬液离心的同时，使用细胞计数仪进行细胞计数。弃去上清液，加入室温的PBS，轻轻重悬细胞沉淀，使细胞浓度为10⁶ 个细胞/毫升。

然后，将每个实验条件下两毫升样品转移至洁净的无菌15毫升离心管中，并重复离心操作。在样品离心的同时，用三个洁净的1.5毫升离心管配制质粒混合物，分别使用0:1、2:1和2:0的供体质粒与Flippase的分子比，每管中含2.5微克Flippase质粒。为进行核转染，从培养箱中取出iDR4培养板以及含有铺板培养基的1.5毫升离心管。

一次取一支离心管，小心吸取上清 PBS，尽量去除缓冲液，切勿扰动管底沉淀。加入 100 微升转染溶液，轻轻吹打使沉淀重悬。随后，将细胞悬液转移至含有质粒混合物的 1.5 毫升离心管中，轻轻混匀。

将细胞DNA混合物转移至电转杯中，注意避免产生气泡。将电转杯插入核转染仪中，对饲养层培养的细胞运行程序A13，或对无饲养层的细胞运行程序F16。取出电转杯后，使用试剂盒中的一次性转移移液管，轻柔但迅速地一次性加入0.5毫升铺板培养基。

然后，以相同方式回收体积，并将细胞悬液逐滴加入含有 iDR4 和铺板培养基的 12 孔板中。将培养皿放入培养箱的架子上，缓慢前后左右移动，使细胞悬液均匀分布。更换培养基前，先将培养皿孵育 24 小时。

转染后两到三天开始筛选。吸除培养基，用1毫升PBS洗涤细胞，然后加入含100纳克/毫升嘌呤霉素的人胚胎干细胞培养基。观察细胞生长情况，并根据需要逐步提高嘌呤霉素浓度，最高至250纳克/毫升，持续进行嘌呤霉素筛选七天。

在嘌呤霉素筛选3至4天后，开始使用0.5微摩尔的氟代尿苷（fialuridine）或FIAU进行筛选。每天更换培养基，FIAU处理持续时间不得超过连续7天。筛选完成后，约第14至15天，将出现具有抗性的RMCE克隆，即构成新的RMCE细胞系。

按照标准操作程序以1:2的比例对细胞进行传代。当关键步骤1中的孔板准备传代时，将用于表征的孔中的细胞按此前视频中所述方法解离为单细胞悬液，并收集至15毫升离心管中。在室温下以300 × g离心5分钟，沉淀细胞。

然后，使用一毫升 PBS 重悬细胞，并将样品分为两份。一份通过细胞滤网过滤后用于流式细胞术分析，另一份根据文本方案用于 DNA 分析。在转染 flippase 重组酶和 tdT RMCE 供体质粒后，hPSCs 在 iDR4 MEF 层上形成均匀分布的小细胞簇，并表达组成型 GFP 和瞬时 tdT。

使用嘌呤霉素进行阳性筛选有利于RMCE供体质粒的插入，随后使用FIAU进行阴性筛选，以获得仅由FRT介导且不含有TK基因的重组事件。转染后约第六天，可观察到少量RMCE GFP阴性、tdT阳性细胞的小簇。如本实验所示，仅在同时使用RMCE供体质粒和Flippase的情况下，才会出现GFP阴性、tdT阳性的RMCE克隆；而在缺乏Flippase的情况下则不会发生RMCE。通过对新建立的RMCE细胞系（即嘌呤霉素和FIAU抗性的RMCE克隆）进行流式细胞术分析，并将其混合为非单克隆细胞群体，结果证实其中100%的细胞均表现为RMCE GFP阴性、tdT阳性的表型。

当使用在hPSC中无记录活性的RMCE供体时，100%的细胞GFP呈阴性。此处展示的非克隆性RMCE细胞系的PCR鉴定结果表明，已实现完整的盒式交换，并且所用筛选程序可产生无随机整合的细胞系，即RMCE供体和表达Flippase的载体均未发生随机整合。总之，与靶向核酸酶相比，该RMCE方法显著简化了hPSC在特定基因座上的基因编辑。

一旦掌握，该技术可在15天内完成。因此，RMCE是一种非常快速的基因编辑工具，能够在同基因背景下实现比较研究。使用该程序时，重要的是要确保转染效率高于30%，并预先进行适当的核心储存筛选剂处理。

观看本视频后，您应能够充分掌握如何在人多能干细胞（PSCs）的AAVS1位点进行RMCE操作，以及如何对重组细胞系进行表征。