通过重组酶介导的盒式交换在重组人多能干细胞的快速高效生成 AAVS1轨迹

该程序的总体目标是使用 flippase、重组酶介导的盒交换方法或 RMCE 在人多能干细胞或人 PSC 的 AAVS1 中进行快速有效的靶向基因组编辑。RMCE 改进了序列对 AAVS1 基因座的靶向插入，这对干细胞生物学非常重要，因为它允许通过过表达或敲低快速测试分子的功能。该技术的主要优点是人类 PSC 细胞系没有随机整合事件，仍然具有多能性，并且可以在短短 15 天内产生正常核型。

该方法为 AAVS1 基因座中的转基因提供了有用的工具，但也可以应用于其他人类允许基因座。首先，在六孔板中，根据标准程序在灭活的小鼠胚胎 fybroblasts 或 iMEF 上或关上培养人 PSC 主细胞系。当细胞达到 60% 至 70% 汇合板时，首先使用 0.1% 明胶溶液包被 12 孔板的必要孔，并在室温下孵育板 5 分钟，从而形成耐药 iMEF。

然后，每孔接种 125， 000 个 iDR4，并与 iMEF 培养基一起孵育培养物过夜。第二天，将人 PSC 培养物与新鲜培养基（包括 10 微摩尔 ROCK 抑制剂）在 37 摄氏度下预孵育 1 小时。同时，将人 ESC 转染溶液和细胞解离剂置于室温下。

根据 nucleofection 条件准备 1 ml nucleofection 电镀培养基。然后，从孔中取出 iDR4 培养基，使用 1 毫升室温 PBS 洗涤细胞并添加核转染接种培养基。将每个电镀培养基样品 500 μL 转移到无菌 1.5 mL试管中，并在 37 摄氏度下储存直至电镀。

要分离单细胞悬液中的人 PSC，请去除培养基，使用室温 PBS 洗涤细胞，并在饲养层或无饲养层 hPSC 培养物中分别添加 1 毫升 0.05% 胰蛋白酶或 Accutase。在 37 摄氏度下孵育培养物。接下来，小心地从培养箱中取出板，不要让细胞分离，吸出解离剂并加入 1 毫升人 PSC 培养基。

通过轻轻冲洗板表面的培养基来解离松散的细胞，同时避免形成泡沫。将细胞收集在干净无菌的 15 或 50 ml 试管中的单细胞悬液中。然后使用 1 毫升 hESC 培养基洗涤细胞并将它们收集在同一管中。

取 50 微升等分试样的细胞悬液进行计数，并在室温下以 300 x g 的速度离心剩余的细胞 5 分钟。在悬浮液离心时，用细胞计数装置对细胞进行计数。去除上清液，使用室温 PBS 轻轻重悬细胞颜色至每毫升 10 至第 6 个细胞。

然后，在每个实验条件下转移 2 毫升以清洁无菌 15 毫升试管并重复离心。当样品旋转时，使用 2.5 μg flippase 质粒在三个干净的 1.5 ml 试管中制备质粒混合物，具有 0：1、2：1 和 2：0 供体 flippase 分子比例。要进行核转染，请从培养箱中取出 iDR4 板和 1.5 mL 装有电镀培养基的试管。

一次一管，在不干扰沉淀的情况下，小心地吸出 PBS，尽可能多地去除缓冲液。使用 100 μL 转染溶液轻轻移液重悬沉淀。然后，将细胞悬液转移到含有质粒混合物的 1.5 ml 试管中，并轻轻混合。

将细胞 DNA 混合物转移到转染机比色皿中，注意不要引入气泡。将比色皿插入 nucleofector 装置中，并运行程序 A13 （用于在饲养层上培养的细胞）或 F16 （用于无饲养层转染）。取出比色皿，使用试剂盒中的一次性移液管在比色皿中轻轻但快速地一次性添加 0.5 mL 电镀介质。

然后，以相同的方式回收体积，并将其滴加在含有 iDR4 和电镀介质的 12 孔板中。将培养皿放在培养箱的架子上，缓慢地来回和左右移动，以均匀分布细胞悬液。更换培养基前，将培养皿孵育 24 小时。

转染后 2 至 3 天，开始筛选。吸出培养基，使用 1 毫升 PBS 洗涤细胞，然后加入每毫升嘌呤霉素 100 纳克的人 ESC 培养基。观察细胞生长并相应地增加嘌呤霉素浓度至最大 250 ng/mL，继续嘌呤霉素选择 7 天。

选择嘌呤霉素 3 至 4 天后，开始使用 0.5 微摩尔非亚尿苷或 FIAU 进行选择。每天更换培养基并保持 FIAU 不超过连续 7 天。选择完成后，大约第 14 至 15 天，将出现抗性 RMCE 菌落并构成新的 RMCE 系。

按照标准程序以 1：2 的比例分裂细胞。当 Key 1 的孔准备好分液时，如视频前面所述，将孔解离以进行表征，形成单细胞悬液，并将细胞收集在 15 毫升试管中。在室温下以 300 x g 离心细胞 5 分钟。

然后，使用 1 毫升 PBS 重悬细胞并将样品一分为二。一种使用细胞过滤器过滤以进行流式细胞术，另一种根据文本方案进行 DNA 分析。用 flippase 重组酶和 tdT RMCE 供体转染后，hPSC 形成均匀分布在 iDR4 MEF 层上的小细胞群，并表达组成型 GFP 和瞬时 tdT。

使用嘌呤霉素的阳性选择有利于 RMCE 供体插入，然后使用 FIAU 的阴性选择仅选择缺乏 TK 的 FRT 介导的重组事件。转染后第 6 天左右，可以鉴定出 RMCE GFP 阴性、tdT 阳性细胞的小簇。如此处所示，仅当同时使用 RMCE 供体和 flippase 时，才存在 GFP 阴性、tdT 阳性的 RMCE 集落，而在没有 flippase 的情况下不会出现 RMCE。在非克隆细胞群中结合新生成的 RMCE 细胞系（即嘌呤霉素和 FIAU 耐药 RMCE 集落）的流式细胞术表征证实，100% 的细胞代表 RMCE GFP 阴性、tdT 阳性表型。

当使用在 hPSC 中没有记录器活性的 RMCE 供体时，100% 的细胞为 GFP 阴性。此处显示的非克隆 RMCE 细胞系的 PCR 表征表明了完整的细胞盒交换，并且所使用的选择程序生成了 RMCE 供体和 flippase 表达载体的随机无积分细胞系。总之，与靶向核酸酶相比，这种 RMCE 方法显著简化了 hPSC 中针对特定位点的基因编辑。

一旦掌握，这项技术可以在 15 天内完成。因此，RMCE 是一种非常快速的基因编辑工具，允许在同基因环境中进行比较研究。使用该程序时，重要的是转染效率高于 30%，并制备合适的核心储存选择试剂。

观看此视频后，您应该对如何在人 PSC 的 AAVS1 位点进行 RMCE 以及如何表征重组细胞系有很好的了解。