建立基因组编辑的人多能干细胞系:从定位到隔离

该程序的总体目标是使用现代基因组编辑技术对人类多能干细胞进行基因工程改造。虽然该程序可以提供对干细胞生物学的见解，但它也可以应用于促进在基因定义的环境中进行人类疾病建模。一般来说，刚接触这种方法的个体在熟练之前需要练习分离菌落。

这种方法的目视演示是必不可少的，因为识别和挑选菌落可能很困难。首先在含有丝裂霉素 C 灭活小鼠胚胎成纤维细胞或在明胶上生长的 MEF 饲养层细胞的六孔板上的 hESC 培养基中培养人多能干细胞。铺板后每天，直到 hPSC 达到 50% 汇合度，使用玻璃移液器并真空除去整个体积的培养基。

每孔更换为 3 毫升温热的 hESC 培养基。靶向前一天，去除 hESC 培养基并加入新鲜的预热 hESC 培养基，并补充有 10 微摩尔 Y-27632。此外，从 DR4 小鼠制备一到两个耐药 MEF 饲养层细胞的六孔板。

在靶向当天，通过将 5 微克锌指核酸酶表达质粒 1 和 2、TALON 1 和 2 表达质粒或 15 微克编码质粒的 CRISPR cas9 px330 移液到一个点 5 毫升的管中来制备横剖溶液。加入 30 μg 修复的供体质粒，然后加入足够的 1x 磷酸盐缓冲盐水，使体积达到 300 μL。在显微镜下检查细胞以确保 50% 汇合。

接下来，使用玻璃移液器并真空从 hPFC 板中取出培养基，然后用 2 毫升温热的 1x PBS 洗涤细胞。吸出 PBS 后，将零点 5 毫的 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液直接添加到细胞上。放入组织培养箱中约 10 分钟，或直到饲养层开始从培养板上抬起。

孵育后，向每个孔中加入 2 mL 温热的 ES 洗涤培养基以终止胰蛋白酶反应。从每个孔中收集细胞，确保饲养层细胞以片状脱落。将每个孔的内容物移液到单个 50 mL 锥形管中，合并所有孔，并使用 10 mL 血清移液管研磨细胞。

添加 ES 洗涤培养基，使细胞悬液达到 40 mL。等待 1 到 2 分钟，让大饲养层块沉淀在试管底部，然后使用血清移液管去除上清液，并沉积到新的 50 mL 锥形管中。以 190 g 离心细胞悬液 5 分钟后，吸出上清液，不要干扰细胞调色板。

细胞重悬于 500 微升 1x PBS 中。将重悬的细胞与先前制备的血浆横断面溶液混合。将细胞和转染混合物移液到 4 mm 电穿孔比色皿中，置于冰上 3 至 5 分钟。

将电穿孔系统上指数程序的参数设置为 250 伏、500 微法、无限电阻和 4 毫米比色皿尺寸。对细胞进行电穿孔，然后将比色皿放回冰上 3 分钟。将电穿孔细胞重悬于 18 毫升温热的 hESC 培养基中，补充有 10 微摩尔 Y-27632。

在显微镜下检查 DR4 MEF。将 3 mL 单细胞悬液接种到含有 DR4 饲养层细胞的 6 孔板的每个孔中，然后放回培养箱中。接种后第 3 天，更换不含 Y-27632 的细胞 hESC 培养基上的培养基。

第 4 天，用含有适当选择抗生素的培养基替换未补充的培养基。这里使用嘌呤霉素。在菌落挑选前一天，为每个要挑选的菌落准备一块 12 孔板的 MEF 饲养层细胞。

接种后第 12 天，在解剖显微镜下检查板。识别直径为 800 至 1， 200 微米的菌落，这些菌落可随时进行挑取。确保这些菌落不包含开始分化的细胞，如此处所示的细胞。

此外，确保细胞表达 GFP。采摘当天，在显微镜下检查 MEF，以确保它们健康。从 MEF 饲养层细胞板中取出所有培养基，并更换为 1 mL hESC 培养基。

此外，更改要挑取的六孔 hPSC 板上的 hESC 培养基。接下来，拉动玻璃移液器以拾取菌落。要挑选菌落，首先将板 hPFC 放在组织培养罩中的解剖显微镜载物台上，通过将玻璃移液器端放入吸球来组装拾取装置。

确定要挑取的菌落，并将拉动的玻璃移液管的尖端放在菌落上。然后，压缩采摘装置的球茎，轻轻切除并切开，将单个菌落切成 10 到 20 个大小相等的块。接下来，通过释放球茎将切除的菌落碎片吸入移液管中。

传输时，请尽量少带走介质。压缩球状细胞，将现在破损的集落直接转移到 12 孔 MEF 饲养层细胞板的一个孔中。标记每个孔，以便对单细胞衍生克隆进行唯一鉴定。

更换玻璃移液器并对下一个菌落重复该过程。将板放回培养箱中，轻轻摇动板以分散孔中的细胞。第二天，取出全体积的培养基，并用 1 点 5 mL 的温热 hESC 培养基替换。

重复 10 至 12 天，直到细胞达到 50% 汇合。10 到 12 天后，检查范围内下的 hESC。从每个孔中挑选 1 到 2 个克隆，并转移到新的 12 孔 MEF 饲养层细胞板中以生成复制板。

从原始板每个孔中的剩余菌落中提取 DNA，用于通过 PCR 或 Southern 印迹进行基因分型。Weber：使用位点特异性核酸酶和修复模板靶向 AAVS1 基因座，以引入 EFFP 报告基因和嘌呤霉素抗性盒。这些代表性图像显示了用锌指核酸酶、TALEN 和 CRISPR/Cas9 编辑的菌落。

这些代表性的 PCR 基因分型结果显示了使用锌指核酸酶、TALEN 和 CRISPR/Cas9 以及野生型对照的无靶标、杂合子和纯合子靶向克隆。下表显示了本实验中每个位点特异性核酸酶在 AAVS1 基因座处经 PCR 验证的整合，与之前实验中经 Southern Blot 验证的适当单次整合相比。CRISPR-Cas9 产生最正确的靶向克隆，而 TALEN 平台具有最多的纯合靶向克隆。

掌握后，这项技术大约需要 3 到 5 个小时的动手作时间，您可以在开始实验后大约三周内获得编辑过的细胞。使用这种技术，安全工作并始终使用无菌技术非常重要。在基因作之后，您可以了解它如何通过使用干细胞分化为其他细胞类型（例如神经元）来影响其他类型的细胞。

该方案的开发为研究人员在人类多能干细胞中使用基因组编辑建立体外疾病模型铺平了道路。看完这个视频，你应该对如何在人类多能干细胞中进行基因组编辑有了很好的了解。