Name: 建立基因组编辑的人多能干细胞系:从定位到隔离 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: 学习使用电穿孔和抗生素筛选技术对人多能干细胞进行基因组编辑的方法。本视频演示AAVS1位点靶向编辑、EGFP表达验证及单克隆挑取流程，为干细胞生物学和疾病建模研究提供可靠实验方案。

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本工作获得了脑研究基金会种子基金（BRFSG-2014-02）对Helen Bateup的资助。Dirk Hockemeyer是艾里森医学基金会老龄化新学者，同时获得格伦基金会以及Shurl和Kay Curci基金会的资助。DH还获得了美国国立卫生研究院（NIH）基金1R01CA196884-01的支持。

本手稿中描述的实验程序已通过加州大学伯克利分校干细胞研究监督委员会的审查并获得批准。
1. 准备用于编辑的干细胞
<ol>
	<li>在含有 2.4 × 10 的 6 孔板中培养人多能干细胞（hPSCs）6 经丝裂霉素C处理失活的、在明胶上培养的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）饲养层，每孔细胞数 32. 每孔加入3 ml人胚胎干细胞培养基（hESC培养基）培养hPSCs，并置于37℃ °C 培养箱，含 3% O₂2/5% CO₂2. 
	注意：本实验方案的成功实施无需将人多能干细胞（hPSCs）培养于低氧培养箱中；但需注意，hPSCs在高氧环境中增殖速度更快。2 环境，因此时间和细胞数量应相应调整。还应注意，维持在低氧条件下的hPSCs自发分化率较低 33.
	<ol>
		<li>配制500 ml hESC培养基：将380 ml DMEM/F12、75 ml 胎牛血清（FBS）、25 ml KnockOut 血清替代物（KSR）混合。加入谷氨酰胺（终浓度1 mM）、5 ml 100×非必需氨基酸、青霉素-链霉素（P/S，终浓度100 units/ml）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，终浓度4 ng/ml）和2-巯基乙醇（终浓度5.5 µM）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用玻璃移液管和真空装置吸除全部培养基（3 ml），然后用血清移液管加入 3 ml 温热的 hESC 培养基。每天更换培养基一次，直至 hPSCs 约达到 50% 汇合度（第 -1 天）。</li>
	<li>靶向操作前一天（第 -1 天），更换 hESC 培养基，弃去旧培养基，加入添加了 10 µM Y-27632 的预热 hESC 培养基。</li>
	<li>同样在第 -1 天，从 DR4 小鼠制备一至两块含药物抗性 MEF 饲养层细胞的 6 孔或 10 cm 培养板（2.4 × 106 细胞/孔 34. 
	注意：通常情况下，6 孔板比 10 cm 培养皿更具优势，因其可容纳更多培养基。6 孔板还可确保不同孔中的克隆彼此独立。然而，具体选择 10 cm 培养皿可能更便于挑取克隆，这取决于用于该操作的显微镜条件。</li>
</ol>
2. 多能干细胞的基因编辑
<ol>
	<li>取5 µg的ZFN 1和ZFN 2、TALEN 1和TALEN 2，或15 µg编码CRISPR/Cas9 px330的质粒（图1），用移液器加入1.5 ml离心管中。再向该管中加入30 µg修复质粒。最后加入1×磷酸盐缓冲液（PBS）至总体积为300 µl。 
	注意：质粒应通过中量提取（任何试剂盒均可）制备，浓度至少为300 ng/µl，以确保转染溶液总体积不超过300 µl。无需进行酚/氯仿抽提、质粒线性化，或使用无内毒素质粒提取试剂盒。</li>
	<li>使用玻璃移液管和真空装置吸除hPSCs培养基。每孔加入2 ml预热的1× PBS洗涤细胞。</li>
	<li>立即用玻璃移液管和真空装置吸除PBS。每孔直接加入0.5 ml 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液。将培养板置于培养箱（37 °C/5% CO2/3% O2）中孵育约10分钟，或直至饲养层开始脱离培养皿。</li>
	<li>每孔加入2 ml预热的esWash培养基（470 ml DMEM/F12，25 ml FBS，100 单位/ml 青霉素/链霉素）以终止胰蛋白酶反应。</li>
	<li>确保饲养细胞以片状脱落。将每孔内容物用移液器转移至一个50 ml锥形离心管中，合并所有孔的细胞。使用10 ml血清移液管轻轻吹打混悬细胞。无需将饲养层完全打散；通过轻柔吹打即可使hPSCs从饲养层上脱落。最终细胞悬液体积约为15 ml。</li>
	<li>向离心管中加入25 ml esWash培养基，使总体积达到40 ml。静置1–2分钟，使较大的饲养层碎片沉降至管底。用血清移液管小心吸除上清液（约38 ml），转移至新的50 ml锥形离心管中。</li>
	<li>在190 × g条件下离心5分钟。使用玻璃移液管和真空装置吸除上清液，注意勿扰动细胞沉淀。将细胞重悬于500 µl 1× PBS中，并与先前配制的质粒转染溶液混合。在此步骤进行细胞计数。每轮电穿孔使用500万至1000万个细胞。</li>
	<li>将全部800 µl细胞悬液转移至4 mm电穿孔杯中，置于冰上3–5分钟。使用电穿孔仪的指数衰减程序进行电穿孔，参数设置如下：250 V，500 µF，∞电阻，4 mm电穿孔杯。电穿孔完成后，将电穿孔杯重新放回冰上3分钟。 
	注意：观察电穿孔仪上显示的时间常数。时间常数随细胞数量和DNA纯度变化。在使用上述条件及Gene Pulser II仪器时，成功转染的时间常数通常介于10–14毫秒之间。若时间常数偏离此范围，可能导致电穿孔效率降低。</li>
	<li>将电穿孔后的细胞重悬于18 ml预热的hESC培养基中，培养基中添加10 µM Y-27632。将3 ml单细胞悬液接种至含DR4饲养细胞的6孔板的每一孔中。放回培养箱（37 °C/5% CO2/3% O2）继续培养。</li>
</ol>
3. 阳性克隆的筛选
<ol>
	<li>第2天，使用玻璃移液管和真空装置吸除全部培养基，更换为3 ml添加了10 µM Y-27632的预温hESC培养基。第3天，使用玻璃移液管和真空装置吸除全部培养基，更换为3 ml不含Y-27632的预温hESC培养基。第4天，使用玻璃移液管和真空装置吸除全部培养基，更换为3 ml添加抗生素用于筛选的预温hESC培养基。将培养皿放回培养箱（37 °C/5% CO2/3% O2）。 
	注意：所用抗生素的种类取决于修复模板中包含的抗性盒。在使用WIBR#3 hPSCs（NIH注册号0079）时，已成功使用0.5 µg/ml嘌呤霉素、70 µg/ml G418（遗传霉素）和35 µg/ml潮霉素。筛选所需的抗生素浓度应通过实验确定，即确定在约一周内能够杀死野生型细胞的最低抗生素浓度。</li>
	<li>第5至12天，每天更换培养基，每次用添加抗生素的预温hESC培养基替换旧培养基。 
	注意：预期会出现大量细胞死亡。单个克隆通常在第8至10天左右变得明显。连续筛选12至14天后，可改用不含抗生素的常规hESC培养基。如果细胞密度较高或细胞死亡较慢，应避免培养基酸化，在筛选的最初几天可能需要增加培养基体积（最多4–5 ml）。</li>
</ol>
4. 挑选选定的菌落（第12-14天）
<ol>
	<li>在第12至14天观察克隆。在解剖显微镜下观察适合挑选的克隆，确保其中不含开始分化的细胞。克隆的直径应约为800–1,200 µm。若克隆在第12天前即达到此大小，建议立即进行挑选。 
	注意：对于每项靶向实验，应挑选足够数量的克隆，以确保分离出目标基因型。例如，使用AAV-CAGGS-EGFP修复模板对AAVS1位点进行编辑时，整合效率通常较高，仅需挑选12–24个克隆即可获得约5–10个杂合靶向克隆。其他靶向实验可能需要挑选更多克隆（表1）。正确靶向事件的频率取决于多种因素，包括SSN诱导双链断裂（DSB）的效率、插入片段的大小以及筛选策略。本文所述针对AAVS1位点的基因捕获方法中，筛选标记仅在正确整合至靶位点时表达，从而减少了获得正确靶向克隆所需的克隆数量。</li>
	<li>在挑选前一天，准备含MEF细胞的12孔板（每板2.4 × 106个细胞，每孔用于接种一个挑选的克隆）。</li>
	<li>在挑选当天，使用玻璃移液管和真空装置从12孔MEF板中吸除全部培养基，并更换为1 ml hESC培养基。同时，在当天更换将用于挑选的6孔板中的hESC培养基。</li>
	<li>拉制玻璃移液管，用于将单个克隆从饲养层机械解离。将移液管置于生物安全柜内的本生灯上，加热扩大部分直至玻璃变软。迅速移离火焰并拉断移液管，形成尖锐的角状末端。在距离弯曲轴约2 cm处折断尖端，留下狭窄通道。将通道末端在火焰中灼烧1–2秒以进行抛光。 
	注意：也可选择使用p20移液器吸头进行克隆挑选，但钝头可能使更多细胞从克隆中脱落进入培养基，从而降低培养的单克隆性，并可能污染后续挑选的样本。</li>
	<li>组装挑选装置：取一个p1000滤芯移液吸头，将其窄端连接吸球，宽端插入已拉制的玻璃移液管。</li>
	<li>将待挑选的hPSC 6孔板置于生物安全柜内安装的解剖显微镜载物台上。挤压挑选装置的吸球，轻柔地将单个克隆切割成10–20个大小均等的片段，注意避免将碎片释放到培养基中。通过释放吸球将切割后的hPSC片段吸入移液管中。转移过程中尽量减少带入的培养基量。</li>
	<li>将单个克隆转移至12孔MEF板的一个孔中，再次挤压吸球，直接将已切割的克隆释放至孔内。对每个孔进行标记，以便唯一识别由单个细胞衍生的克隆。根据需要重复此操作，每次更换新的玻璃移液管。 
	注意：克隆挑选可能需要一定练习才能掌握。建议实验人员在尝试分离靶向克隆前，先在对照细胞上进行练习。</li>
	<li>将12孔板放回培养箱（37 °C/3% O2/5% CO2），先轻轻摇动培养板，以避免细胞在各孔中央聚集。</li>
	<li>次日及之后每日，使用玻璃移液管和真空装置吸除全部培养基，并更换为1.5 ml预温的hESC培养基，直至细胞汇合度达到约50%（通常需要10–12天）。</li>
	<li>10–12天后，从每个孔中挑选1–2个克隆，转移至新的12孔MEF板，并重复步骤4.1–4.8，以建立复制板。</li>
	<li>从原始MEF板各孔中剩余的克隆提取DNA（见下文）。
	<ol>
		<li>使用玻璃移液管和真空装置吸除所有孔中的培养基。每孔加入1 ml 1× PBS洗涤细胞。用玻璃移液管和真空装置吸除PBS。每孔加入250 µl细胞裂解缓冲液（终浓度为H2O中含10 mM Tris HCl、5 mM EDTA、0.2% SDS、200 mM NaCl、0.08 mg/ml蛋白酶K）。将板置于培养箱（37 °C/3% O2/5% CO2）中过夜孵育。</li>
		<li>次日，将各孔内容物转移至各自的1.5 ml离心管中。每管加入250 µl异丙醇以沉淀DNA。剧烈震荡试管，应可见白色沉淀物。</li>
		<li>将各管在台式离心机中以13,000 rpm离心3分钟。离心后倾去上清至液体废液缸中，应有少量DNA沉淀附着于管底。每管加入250 µl 70%乙醇洗涤DNA沉淀。剧烈震荡。再次以13,000 rpm离心3分钟。</li>
		<li>离心后倾去上清至液体废液缸中，应有少量DNA沉淀附着于管底。用移液管吸除残留上清，确保管内无液体残留。将离心管敞口置于实验台干燥5–10分钟。干燥后，将DNA重悬于250 µl TE缓冲液中。置于37 °C孵育6小时，使DNA充分溶解。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用预先优化的PCR或Southern印迹方法对每个样本进行基因型鉴定。 
	注意：对于使用AAV-CAGGS-EGFP修复模板靶向AAVS1位点的实验，Southern印迹方法详见Hockemeyer et al., 2009 4。完整的Southern印迹实验方案可参见Southern, 2006 35。对于同一实验的多重PCR基因分型，引物序列和反应条件见表2 36。</li>
	<li>丢弃未正确靶向的孔，对正确靶向的细胞继续每日更换hESC培养基。当细胞汇合度约为50%时进行冻存，冻存步骤见下文。
	<ol>
		<li>冻存前一天更换hESC培养基，弃去旧培养基，加入含10 µM Y-27632的预温hESC培养基。</li>
		<li>冻存当天，为每块将要冻存的12孔板中的每个孔分别在两个15 ml锥形管中配制0.5 ml溶液A和0.5 ml溶液B。将溶液置于冰上。溶液A：50% hESC培养基 + 50% FBS；溶液B：80% FBS + 20%二甲基亚砜（DMSO）。</li>
		<li>在冻存前将hPSC克隆解离为单细胞。参照步骤2.2–2.8操作，按比例调整体积。将细胞沉淀完全重悬于0.5 ml溶液A中。</li>
		<li>向细胞悬液中加入0.5 ml溶液B，上下吹打使细胞悬液均匀。将总体积（约1 ml）转移至2 ml冻存管中，拧紧管盖。</li>
		<li>将冻存管置于-80 °C冰箱中过夜。冻存次日，将冻存管从-80 °C冰箱中取出，立即转入液氮罐中进行长期保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益。

本文介绍的分离基因编辑人多能干细胞均一细胞群的方法，是一种用于生成仅在靶向位点存在差异的同基因型人多能干细胞（hPSC）细胞系的强大策略。这些细胞是研究人类细胞分化与发育机制的理想体系，也可用于在受控的遗传背景下理解单基因疾病的病理生理学。如本文所示，可采用三种独立的序列特异性核酸酶（SSN）设计策略（ZFNs、TALENs 和 CRISPR/Cas9）实现 AAVS1 位点的靶向整合。每种方法均有其优缺点。ZFNs 以及在一定程度上 TALENs 的潜在优势在于其设计灵活性，允许通过迭代工程优化单个核酸酶的 DNA 结合结构域42。这种核酸酶的优化可能使 ZFNs 和 TALENs 的特异性超过 CRISPR/Cas9 系统所能达到的水平。此类高选择性在需要高度靶向特异性的临床应用中可能尤为重要。CRISPR/Cas9 系统的主要优势在于其操作简便。尽管 TALEN 和 ZFN 的构建试剂盒已向公众提供（例如，通过 Addgene 21），但基于 CRISPR/Cas9 的 SSN 构建显著更为简便，因为唯一需要定制的部分仅为一段 20 个碱基对的寡核苷酸（使用 px330 质粒设计时14）。这种简便性对于希望将基因组编辑技术纳入研究工作的实验室而言具有显著优势。
存在多种替代的转染技术，包括核转染43，可用于构建基因编辑的hPSC细胞系；然而，电穿孔已被证明具有一致性和成本效益4,5,25。核转染可直接将Cas9-向导RNA核糖核蛋白复合物导入细胞核，从而提高序列特异性核酸酶（SSN）的编辑效率和保真度44。在MEF饲养层上培养hPSC是一种稳健且经济的方法，可维持hPSC处于多能状态，同时避免过度分化。此外，该方法便于分离遗传背景完全相同的克隆。 alternatively，也可在无MEF饲养层的条件下培养hPSC，但这些培养体系的成本通常高于饲养层依赖型培养。此外，整个流程具有可扩展性，能够在平行编辑实验中分离极为罕见的编辑事件，或同时生成多个不同的细胞系。
本文所述方案具有良好的稳健性，但仍有若干关键步骤会影响获得正确编辑克隆的效率。该方法最关键的要素是使用高质量的MEF以及具有药物抗性的DR4 MEF。单个hPSC的存活较为困难，低质量的MEF会阻碍未分化hPSC细胞系的分离。其次，使用Y-27632对于促进单细胞存活至关重要，同时可避免对核型异常的细胞产生选择性压力45。第三，挑选间距良好的克隆集落可确保所获得细胞系的遗传均一性。最后，制备玻璃移液管时应使其开口足够小，以便将集落打散成多个小片段，从而确保在新孔中长出多个集落。这使得可以在培养中保留一个用于后续基因型鉴定的原始集落板，同时挑选间距合适的亚克隆用于制作复制板。本方案中较具挑战性的步骤是手动拉制玻璃移液管，建议提前进行练习。需要注意的是，目前存在多种无需使用玻璃移液管的克隆挑选技术。实验人员可自行选择最适合自身操作习惯的方法。
本方案存在一些局限性，但可通过简单的修改加以克服。若实验仅旨在破坏目标位点而不进行修复，或修复模板中不含筛选标记盒，则必须采用其他方法来富集已编辑的细胞。需要注意的是，在缺乏筛选条件的情况下，为获得阳性克隆所需挑选的菌落数量将显著增加。提高效率的一种策略是共转染一个不整合的、表达荧光蛋白的质粒。在细胞恢复培养两天后，可通过荧光激活细胞分选技术（fluorescence-activated cell sorting）根据荧光信号阳性对靶向细胞进行分选，并重新接种29。该过程可富集通过电穿孔转染了质粒的细胞，从而提高细胞内同时发生基因编辑事件的概率。
本文所述技术可扩展用于多个向导RNA，以同时靶向多个位点14,46,47。已有多种实验方案被建立，可用于将人多能干细胞（hPSCs）分化为不同类型的细胞，从而在感兴趣的细胞类型中进行各种遗传操作30。总体而言，我们证明了无论选择何种序列特异性核酸酶（SSN），在hPSCs中均具有高效的基因组编辑潜力。我们建议，该技术可被进一步优化，用于创建在任意基因组位点经过基因编辑的同基因型hPSC细胞系。

基因组编辑技术正在迅速发展成为分子生物学和细胞生物学的标准工具1。人类多能干细胞（hPSCs）的基因工程尤其受到关注，因为hPSCs是遗传背景完整的人类原代细胞的可自我更新来源。hPSCs可被分化为多种细胞类型，用于疾病建模或作为移植治疗的细胞来源2,3。本文展示了一种实验方案，该方案结合三种不同类型的位点特异性核酸酶（SSNs）与内源性DNA修复机制，实现报告基因构建体在AAVS1位点的靶向整合。在将SSNs转染至hPSCs后，我们展示了如何分离携带报告基因的同基因型细胞群体。
利用序列特异性核酸酶（SSN）对基因组（特别是多能干细胞基因组）进行操作并非新近现象，早在数年前即已证实锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活样效应因子核酸酶（TALENs）可用于基因编辑4-10。然而，随着化脓性链球菌（S. pyogenes）CRISPR/Cas9技术的出现11-13，基因编辑已变得广泛可及14。所有SSN均能在特定靶位点引入双链DNA断裂（DSB）1,4,5,11，随后由细胞内源性修复机制通过非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）进行修复15。NHEJ易出错，可能引入移码突变，导致基因功能丧失；而HDR则可通过共转染携带修复模板的SSN实现新序列的插入。尽管促进基因编辑的DNA修复基本原理在各类SSN之间大致相同，但不同平台之间仍存在一些差异。de novo设计ZFN具有较高的灵活性和核酸酶优化潜力16，但利用公开的组装文库和筛选工具设计单个ZFN可能耗时较长。一旦确定ZFN介导靶向的目标位点，即可使用在线工具ZiFit设计ZFN配对序列17。设计完成后，可通过多轮质粒克隆实现ZFN的模块化组装18。此外，目前也有多种商业化的、经过预验证的ZFN可供使用19。TALE核酸酶也可借助在线工具和公开可用的组件进行设计17,20。例如，可通过FLASH组装方法21或基于PCR的分级Golden Gate组装方法22，从五个TALE重复单元组成的模块快速构建TALEN。CRISPR/Cas9在SSN设计上的简便性以及构建速度的提升，使基因组编辑成为一种广泛应用的工具。CRISPR/Cas9依赖短引导RNA的靶向机制还允许在一个载体中多重表达多个引导RNA，以同时靶向多个位点14。设计用于基因编辑的Cas9仅需在目标位点附近识别一个前间隔序列邻近基序（PAM；对于S. pyogenes Cas9为NGG三核苷酸）即可。通过将对应于PAM上游20个碱基的寡核苷酸插入px330质粒14，即可在一步克隆中完成载体构建。除S. pyogenes Cas9外，来源于N. meningitidis（NmCas9）且识别5′-NNNNGATT-3′（PAM）的Cas9也被证明可在人多能干细胞（hPSCs）中实现高效的基因编辑23。
除了SSN设计难易程度的差异外，每种平台还具有特定的性质。例如，ZFNs和TALENs利用FokI核酸酶结构域，产生一个四核苷酸5'突出端24，而Cas9则被认为主要产生平末端的双链断裂（DSBs）。ZFNs、TALENs和Cas9在蛋白质稳定性、与靶DNA的结合-解离速率以及DNA扫描模式方面均存在差异，这些差异理论上可能导致编辑结果出现细微差别1。尽管仍需进一步研究以全面理解这些差异所带来的影响，本文所述的实验方案在所有三种平台上均表现出高度稳健性，可便捷地用于生成基因修饰的人多能干细胞（hPSCs）。
无论选择哪种SSN，电穿孔都是一种将SSN和同源修复模板转染到hPSC中的可靠方法25。经抗生素抗性筛选后存活的克隆数量取决于位点特异性参数和编辑策略（例如，转基因插入片段的大小和筛选方式）。本方案通常可获得约150–400个单细胞来源的克隆。
使用本方案在AAVS1位点进行基因编辑此前已被用于验证SSNs的有效性4,5。AAV-CAGGS-EGFP修复模板采用基因捕获策略，以位点特异性的方式赋予嘌呤霉素抗性。简言之，该修复模板在无启动子的嘌呤霉素抗性表达盒上游包含一个剪接受体位点。当正确整合至AAVS1位点PPP1R12C基因的第一个内含子中时，抗性表达盒可由该编辑基因的启动子驱动表达。该特定AAVS1检测方法的稳健性使我们能够比较每种SSN平台的编辑效率。
利用序列特异性核酸酶（SSNs）进行基因编辑具有强大的功能，理论上能够破坏和/或改变任意基因。将该策略应用于人多能干细胞（hPSCs）可提供高度的灵活性，因为hPSCs随后可被分化为多种人类细胞类型，例如神经元26、肝细胞27和心肌细胞28。此外，使用患者来源的诱导性多能干细胞可在个体特异性的遗传背景下修复或引入已知的致病突变29，从而建立一个利用患者自身细胞研究疾病机制和测试治疗手段的平台30。总之，在hPSCs中进行基因编辑是一种高效且灵活的方法，可用于研究人类发育与疾病的基礎生物学机制31。

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>11320082</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（HI）</td><td>Life Technologies</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>无血清培养基（Knockout Serum）</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>碱性成纤维细胞生长因子</td><td>Life Technologies</td><td>PHG0261</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素双抗（Pen/Strep）</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>谷氨酰胺（Glutamine）</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>MEM 非必需氨基酸（MEM NEAA）</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇（2-mercaptoethanol）</td><td>Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Calbiochem</td><td>688000</td><td></td></tr><tr><td>6 孔板</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>12 孔板</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>4 mm 电穿孔比色皿</td><td>Bio-rad</td><td>165-2081</td><td></td></tr><tr><td>X-cel 基因脉冲仪 II</td><td>Bio-rad</td><td>165-2661</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>10&amp;times; 磷酸盐缓冲液（PBS）pH7.4&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>嘌呤霉素（Puromycin）</td><td>Life Technologies</td><td>A11138-02</td><td></td></tr><tr><td>带滤芯移液管（Pasteur pipettes, plugged）</td><td>VWR</td><td>14672-412</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5941</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶K（Proteinase-K）</td><td>Life Technologies</td><td>AM2544</td><td></td></tr><tr><td>乙醇（Ethanol）</td><td>VWR</td><td>TX89125-172SFU</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇（Isopropyl Alcohol）</td><td>VWR</td><td>MK303216</td><td></td></tr><tr><td>TE 缓冲液（TE Buffer）</td><td>Life Technologies</td><td>12090-015</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>1.8 ml 冻存管</td><td>ThermoScientific</td><td>377267</td><td></td></tr></tbody></table>

基因编辑人类多能干细胞系的建立：从靶向到分离

Establishment of Genome-edited Human Pluripotent Stem Cell Lines: From Targeting to Isolation

对人类多能干细胞（hPSCs）进行基因组编辑，为研究人类发育过程及疾病病理生理机制提供了具有遗传可控性和临床相关性的研究平台。通过使用位点特异性核酸酶（SSNs）进行基因组编辑，可在遗传背景基本一致的条件下，快速获得携带特定遗传改变的新hPSC细胞系。锌指核酸酶（ZFNs）、转录激活样效应因子核酸酶（TALENs）以及成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/Cas9是目前最常用的几种SSNs。这些核酸酶均通过在基因组特定位点引入双链DNA断裂，从而促进特定基因组位点的精确基因编辑。SSN介导的基因组编辑利用细胞内源性的两种DNA修复机制——非同源末端连接（NHEJ）和同源定向修复（HDR），可在双链断裂位点处引入插入/缺失突变，或借助同源修复模板对基因组进行修饰。通过电穿孔法将SSNs和包含荧光报告基因及抗生素抗性元件等转基因的修复模板高效转染至hPSCs中。电穿孔后，可通过抗生素筛选富集成功整合修复载体的hPSCs。通过机械法分离hPSC克隆，并通过基因型鉴定确认目标位点的正确整合，从而获得靶向正确且遗传均一的细胞系。本方案的有效性通过在人类多能&#160;干细胞中利用上述三种SSN技术平台，将EGFP和嘌咯霉素抗性表达框整合至AAVS1安全位点加以验证。

本文展示了一种适用于三种不同SSN平台的实验方案，用于构建基因编辑的hPSC细胞系。我们利用已发表的ZFNs4、TALENs5和CRISPR/Cas9s37，针对WIBR#3人胚胎干细胞的AAVS1位点，使用一种修复模板进行靶向编辑，该模板可引入EGFP报告基因和嘌呤霉素抗性表达盒4。
我们将人多能干细胞（hPSCs）培养在小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）上，采用一种既经济高效又可放大的细胞培养流程，用于维持和扩增未分化的hPSCs（图2）。若细胞培养时间超过必要时长，则可能导致分化程度增加，从而减少被转染的多能细胞数量，进而降低获得正确靶向的hPSC克隆数量。
我们对每种SSN平台分别电穿孔转染5.0 × 106个细胞，并将每种靶向处理的细胞接种至一块含有DR4 MEFs的6孔板中。经过筛选后，每种平台均获得了EGFP阳性克隆（图3），以及未靶向、纯合靶向和杂合靶向克隆的混合物（图4A,B；表3）。在本实验所采用的条件下，AAVS1 TALEN产生的EGFP阳性克隆数量最多。本实验所用的修复模板包含位于EGFP报告基因和嘌呤霉素抗性表达盒上游的剪接受体位点。采用这种“基因捕获”策略（图1），该构建体应插入AAVS1位点的第一个内含子中，并利用内源性启动子驱动嘌呤霉素抗性表达盒的表达。由于修复模板中缺乏驱动嘌呤霉素抗性基因表达的启动子，因此在发生随机整合的情况下可阻止该基因的表达。
因此，我们预期所有嘌呤霉素抗性克隆均会在AAVS1位点发生靶向整合。需要注意的是，部分克隆在AAVS1位点存在异常整合，这些异常整合可通过使用内部探针的Southern印迹检测到，但大多数PCR策略无法检出（图1；图4C）4。这类整合事件很可能是由异源靶向事件导致供体质粒发生多次插入所致4。我们从每次SSN实验中挑选了24个菌落，发现所有平台均具有很高的靶向效率，且彼此间差异极小。通过PCR分析，CRISPR/Cas9系统产生的正确靶向克隆最多，而TALEN平台获得的纯合靶向克隆最多（表3）。
<img alt="AAVS1 位点示意图；基因编辑、TALEN、ZFN、PCR 引物、DNA 修复、CRISPR-Cas9 方法。" src="/files/ftp_upload/53583/53583fig1highres.jpg" width="700" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. 使用 AAV-CAGGS-EGFP 修复模板进行基因编辑的 AAVS1 位点示意图。 修改自 Hockemeyer et al., 2009。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53583/53583fig1highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="hPSC 克隆分化；显微镜图像；未分化与部分分化细胞。" src="/files/ftp_upload/53583/53583fig2highres.jpg" width="700" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. WIBR#3 细胞的克隆。 WIBR#3 人胚胎干细胞在靶向操作前的代表性明场图像。注意理想克隆（左）中缺乏分化现象，并且与饲养层有清晰分离，而相比之下非理想克隆（右）则不具备这些特征。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53583/53583fig2highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="基因编辑比较；ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9。相位与EGFP显微镜图像分析。" src="/files/ftp_upload/53583/53583fig3highres.jpg" width="700" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. EGFP阳性的WIBR#3细胞。 使用在AAVS1位点携带EGFP表达修复模板的WIBR#3细胞的代表性图像。展示了经ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas9编辑的代表性克隆的图像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53583/53583fig3highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="基因编辑结果；比较 TALEN、ZFN 和 Cas9 方法的凝胶电泳和印迹分析。" src="/files/ftp_upload/53583/53583fig4highres.jpg" width="700" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. 用于确认正确靶向的基因分型策略。（A）代表性 PCR 基因分型结果，显示三种 SSN 平台中未靶向、杂合子和纯合子靶向克隆。WT CTL = 野生型对照。（B）代表性 Southern 印迹结果，使用 3' 外部探针检测到一个杂合子靶向克隆和一个纯合子靶向克隆。片段大小：WT-6.5 kb，编辑后-6.9 kb。（C）代表性 Southern 印迹结果，显示一个正确编辑的克隆和一个具有非随机双整合的杂合子克隆。片段大小：正确编辑-6.9 kb，异常额外整合-5 kb。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53583/53583fig4highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>研究</td>
			<td>靶向基因</td>
			<td>平台</td>
			<td>修复模板类型</td>
			<td>筛选克隆数</td>
			<td>靶向效率</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sexton et al., 2014</td>
			<td>TPP1</td>
			<td>ZFN</td>
			<td>GFP-Puro</td>
			<td>未报告</td>
			<td>未报告</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sexton et al., 2014</td>
			<td>TERT</td>
			<td>ZFN</td>
			<td>Hygromycin</td>
			<td>未报告</td>
			<td>未报告</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hockemeyer et al., 2009</td>
			<td>POU5F1</td>
			<td>ZFN</td>
			<td>GFP-Puro</td>
			<td>31</td>
			<td>39.0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hockemeyer et al., 2009</td>
			<td>PITX3</td>
			<td>ZFN</td>
			<td>GFP-Puro</td>
			<td>74</td>
			<td>14.9%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hockemeyer et al., 2011</td>
			<td>POU5F1</td>
			<td>TALEN</td>
			<td>GFP-Puro</td>
			<td>68</td>
			<td>91.0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hockemeyer et al., 2011</td>
			<td>PITX3</td>
			<td>TALEN</td>
			<td>GFP-Puro</td>
			<td>96</td>
			<td>13.0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Merkle et al., 2015</td>
			<td>VASA</td>
			<td>Cas9</td>
			<td>Reporter-Geneticin</td>
			<td>139</td>
			<td>94.0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Merkle et al., 2015</td>
			<td>CRH</td>
			<td>Cas9</td>
			<td>Reporter-Geneticin</td>
			<td>30</td>
			<td>93.0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Merkle et al., 2015</td>
			<td>HCRT</td>
			<td>Cas9</td>
			<td>Reporter-Geneticin</td>
			<td>154</td>
			<td>92.0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Merkle et al., 2015</td>
			<td>HMX2</td>
			<td>Cas9</td>
			<td>Reporter-Geneticin</td>
			<td>11</td>
			<td>45.0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forster et al., 2014</td>
			<td>LRG5-Nterm</td>
			<td>ZFN</td>
			<td>GFP-Puro</td>
			<td>未报告</td>
			<td>30.0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forster et al., 2014</td>
			<td>LRG5-Cterm</td>
			<td>ZFN</td>
			<td>GFP-Puro</td>
			<td>未报告</td>
			<td>14.0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soldner et al., 2011</td>
			<td>SNCA</td>
			<td>ZFN</td>
			<td>Puro</td>
			<td>96</td>
			<td>1.0%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

表1. 使用本方法靶向的其他基因的描述，以及来自先前已发表研究的相应靶向效率。 4,5,38-41
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>位点</td>
			<td>序列</td>
			<td>备注</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAVS1-F 引物</td>
			<td>CTCTAACGCTGCCGTCTCTC</td>
			<td>PCR 条件：Tm = 57 °C，35 个循环</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAVS1-WT-R 引物</td>
			<td>GCTTCTCCTCTTGGGAAGTG</td>
			<td>野生型条带：1273 bp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAVS1-Targeted-R 引物</td>
			<td>CGTCACCGCATGTTAGAAGA</td>
			<td>靶向条带：992 bp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T2-Cas9-guide</td>
			<td>GGGCCACTAGGGACAGGAT</td>
			<td>引自 Mali et al., 2013</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAVS1-ZFN-Right</td>
			<td>TAGGGACAGGAT</td>
			<td>引自 Hockemeyer et al., 2009</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAVS1-ZFN-Left</td>
			<td>TGGGGTGTCACC</td>
			<td>引自 Hockemeyer et al., 2009</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAVS1-TALEN-Right</td>
			<td>TCCTAACCACTGTCTTT</td>
			<td>引自 Hockemeyer et al., 2011</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAVS1-TALEN-Left</td>
			<td>CCCCTCCACCCCACAGT</td>
			<td>引自 Hockemeyer et al., 2011</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2. 引物及SSN靶向序列列表。
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>靶向构建体</td>
			<td>EGFP+ 菌落数量</td>
			<td>经PCR验证的靶向筛选克隆</td>
			<td>既往报道的正确靶向效率（通过Southern印迹）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZFN</td>
			<td>150</td>
			<td>86.9% (73.9% 杂合 / 13.0% 纯合)</td>
			<td>56% (50% 杂合 / 6% 纯合)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TALEN</td>
			<td>412</td>
			<td>91.3% (47.8% 杂合 / 39.1% 纯合)</td>
			<td>未见报道</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CRISPR-Cas9</td>
			<td>235</td>
			<td>95.7% (69.5% 杂合 / 26.3% 纯合)</td>
			<td>未见报道</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3. EGFP阳性及经TALEN、ZFN和CRISPR/Cas9靶向的人类干细胞克隆数量的比较。 本实验中通过PCR验证的AAVS1位点整合结果与先前实验中通过Southern印迹验证的正确单拷贝整合结果进行了比较4,5。

人类多能干细胞（hPSCs）的基因组编辑可以快速高效地完成。本文展示了一种可靠的实验方案，以编辑AAVS1安全港位点以表达EGFP并引入抗生素抗性为例，对hPSCs进行基因工程改造。

人类多能干细胞（hPSCs）的基因组编辑提供了一个具有遗传可控性和临床相关性的平台，可用于研究人类……

本实验的总体目标是利用现代基因组编辑技术对人类多能干细胞进行遗传改造。尽管该方法可为干细胞生物学研究提供见解，也可用于在基因明确的体系中建立人类疾病模型。通常，初次接触该技术的研究人员需要经过多次实践，才能熟练掌握克隆的分离操作。该方法的可视化演示至关重要，因为菌落的识别与挑选可能较为困难。首先，在六孔板中培养人多能干细胞，培养基为hESC培养基，六孔板内含经丝裂霉素C处理的失活小鼠胚胎成纤维细胞，或称在明胶上培养的MEF饲养层细胞。自接种后每一天，直至hPSCs达到50%融合度，均使用玻璃移液管和真空装置将培养基全部移除。每孔加入三毫升温热的 hESC 培养基。靶向操作前一天，移除 hESC 培养基，并加入新鲜预热的、添加 10 微摩尔 Y-27632 的 hESC 培养基。同时，准备一至两块来自 DR4 小鼠的耐药性 MEF 饲养层细胞六孔板。在靶向当天，通过移液将五微克锌指核酸酶表达质粒1和2、TALON 1和2表达质粒，或15微克编码CRISPR cas9 px330的质粒加入至一个1.5毫升离心管中。加入30微克修复型供体质粒，然后加入足量1×磷酸盐缓冲液，使总体积达到300微升。在显微镜下观察细胞，确保细胞融合度达到50%。接下来，使用玻璃移液管和真空装置吸除hPFC培养板中的培养基，然后用2毫升预热的1×PBS洗涤细胞。吸除PBS后，直接向细胞中加入0.5毫升0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液。将培养板放入组织培养孵箱中孵育约10分钟，或直至饲养层细胞开始从培养板表面脱离。 孵育结束后，向每孔加入2毫升预热的ES洗涤培养基以终止胰蛋白酶反应。收集每孔中的细胞，确保饲养层细胞以单层形式脱落。将每孔中的内容物用移液器转移至一个50毫升的锥形离心管中，合并所有孔的细胞，并使用10毫升血清移液管反复吹打混匀细胞。加入 ES 洗涤培养基，使细胞悬液总体积达到 40 毫升。静置 1 至 2 分钟，使较大的饲养层细胞团块沉降至管底，然后用血清移液管小心吸出上清液，转移至新的 50 毫升锥形离心管中。将细胞悬液在 190 ×g 条件下离心 5 分钟后，用移液管吸除上清液，注意不要扰动细胞沉淀。将细胞重悬于500 µL的1× PBS中。将重悬的细胞与先前制备的转染溶液混合。用移液器将细胞和转染混合物加入4 mm电穿孔比色皿中，置于冰上孵育3至5分钟。将电穿孔系统的指数衰减程序参数设置为250伏、500微法、无限电阻和4毫米比色皿。对细胞进行电穿孔，然后将比色皿放回冰上静置3分钟。用18毫升预热的hESC培养基重悬电穿孔后的细胞，培养基中需添加10微摩尔Y-27632。在显微镜下观察 DR4 MEFs。将三毫升单细胞悬液接种至含有 DR4 饲养层细胞的六孔板的每个孔中，然后放回培养箱。接种后第三天，更换细胞培养基，使用不含 Y-27632 的 hESC 培养基。第四天，将未添加补充物的培养基更换为含有适当筛选抗生素的培养基，此处使用嘌呤霉素。在挑取克隆的前一天，为每个待挑取的克隆准备一块12孔板的MEF饲养层细胞。接种后第12天，在解剖显微镜下观察培养板。挑选直径为800至1,200微米的克隆进行挑取。确保这些克隆中不含有开始分化的细胞，例如此处所示的克隆。同时，确保细胞正在表达 GFP。在挑选当天，在显微镜下检查 MEF，以确保其状态健康。吸出 MEF 饲养层细胞培养板中的所有培养基，并更换为一毫升 hESC 培养基。同时，更换将要进行挑取操作的六孔 hPSC 培养板中的 hESC 培养基。接着，拉制用于挑取克隆的玻璃毛细管。挑取克隆时，首先将 hPFC 培养板放置在生物安全柜内解剖显微镜的载物台上，然后将玻璃毛细管的一端插入吸球中，组装成挑取装置。确定待挑选的菌落，并将拉制的玻璃移液管尖端置于菌落上方。然后，挤压挑取装置的吸球，轻柔地将单个菌落切割成10至20个大小相等的小块。接着，通过释放吸球，将切割下的菌落小块吸入移液管中。转移时尽量减少培养基的量。挤压吸头球，将已分散的菌落直接转入含MEF饲养层细胞的12孔板中的一个孔内。对每个孔进行标记，以便唯一识别由单细胞衍生的克隆。更换玻璃移液管，并对下一个菌落重复上述操作。将培养板放回培养箱，轻轻摇动培养板以使孔中的细胞分散均匀。第二天，吸出全部培养基，更换为 1.5 毫升预温的 hESC 培养基。重复操作10至12天，直至细胞汇合度达到50%。10至12天后，在显微镜下观察hESC，从每个孔中挑选1至2个克隆，转移至新的12孔MEF饲养层细胞培养板，以制备复制板。从原始培养板中每个孔的剩余菌落中提取DNA，用于PCR或Southern印迹法进行基因分型。Weber Three人类胚胎干细胞利用位点特异性核酸酶和修复模板，在AAVS1位点进行靶向修饰，以引入一个EFFP报告基因和一个嘌呤霉素抗性盒。这些代表性图像显示了使用锌指核酸酶、TALENs和CRISPR/Cas9编辑的菌落。这些具有代表性的 PCR 基因分型结果展示了使用锌指核酸酶、TALEN 和 CRISPR/Cas9 获得的非靶向、杂合靶向和纯合靶向克隆，以及野生型对照。该表格显示了本实验中各位点特异性核酸酶在 AAVS1 位点的 PCR 验证整合情况，并与先前实验中经 Southern 印迹验证的正确单一位点整合结果进行了比较。CRISPR-Cas9 获得正确靶向克隆的比例最高，而 TALEN 平台获得的纯合靶向克隆数量最多。一旦掌握该技术，实际操作时间约为三到五小时，从开始实验起大约三周即可获得基因编辑的细胞。使用该技术时，必须注意安全操作，并始终采用无菌技术。在完成基因操作后，可通过干细胞向其他细胞类型（如神经元）的分化，来观察其对其他类型细胞的影响。本实验方案的建立为研究人员利用基因组编辑技术在人类多能干细胞中构建体外疾病模型铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分理解如何在人类多能干细胞中进行基因组编辑。

establishment-genome-edited-human-pluripotent-stem-cell-lines-from

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

建立基因组编辑的人多能干细胞系：从定位到隔离

我们介绍一种利用编码Oct3/4、Sox2、Klf4和c-myc（OSKM）的逆转录病毒载体，将人类体细胞高效重编程为人类诱导性多能干细胞（hiPSC），并通过Tra-1-81抗体活细胞染色鉴定正确重编程的hiPSC的实验方案。...

从成人成纤维细胞重编程获得的人诱导性多能干细胞克隆的筛选与分离

本视频展示了一种基于锌指核酸酶的人类多能干细胞（hPSCs）基因组编辑技术。由于hPSCs具有分化为多种细胞类型的潜力，该技术有助于以患者特异性的方式开展体外病理学和药理学研究。...

基于锌指核酸酶的基因组编辑：利用双链同源依赖性修复机制在人类多能干细胞中修饰基因组的技术

报告基因细胞系提供了一种在异质性细胞群体中可视化、追踪和分离目标细胞的方法。 然而，利用传统同源重组技术在人胚胎干细胞中进行基因靶向的效率极低。本文中，我们描述了利用锌指核酸酶增强的同源重组技术，将EGFP靶向整合至中枢神经系统中脑特异性转录因子PITX3位点的方法。...

锌指核酸酶增强的人类胚胎干细胞基因靶向

我们描述了一种基于慢病毒的重编程方法，用于获得无外源因子的人类诱导性多能干细胞，并在疑似临床级条件下进行表征和转化。...

无外源基因人诱导性多能干细胞系的建立与表征及其向明确临床级条件的转化

通过TALEN介导的基因编辑技术对安全港AAVS1位点进行操作，可在人诱导多能干细胞（iPSCs）中实现高效的外源基因插入。本实验方案详细描述了为TALEN系统和供体质粒递送而准备iPSCs、转染iPSCs，以及筛选和分离iPSC单克隆细胞系的操作步骤，以实现绿色荧光蛋白（GFP）基因的靶向整合，从而构建报告细胞系。...

人类诱导性多能干细胞中利用TALEN技术将GFP基因靶向AAVS1安全位点的转染、筛选与克隆挑取

在此，我们报告一种基于RMCE的快速高效基因编辑方法 AAVS1 人类多能干细胞（hPSCs）的基因座，该系统较以往描述的系统有所改进。利用此技术，可快速、可靠地生成同基因型细胞系，从而开展恰当的比较研究，推动以转基因介导的科研工作 hPSCs.

通过AAVS1位点的重组酶介导的盒式交换快速高效地生成重组人多能干细胞

本文描述了利用iCRISPR平台生成人多能干细胞（hPSC）突变细胞系以及将hPSC分化为葡萄糖响应性β样细胞的实验方案。将基因组编辑技术与hPSC定向分化相结合，为系统分析谱系决定因子在人类发育和疾病进展中的作用提供了强有力的平台。...

利用基因组编辑和hPSC定向分化探究人类胰腺发育中的谱系决定因子

本文介绍了一种利用CRISPR/Cas9技术在人诱导性多能干细胞中对内源性表达的蛋白质进行荧光标记的实验方案。通过荧光激活细胞分选富集可能经过编辑的细胞，并建立单克隆细胞系。...

利用CRISPR/Cas9在人类诱导多能干细胞中进行内源性蛋白标记

本方案提供了一种利用CRISPR-CAS9在人类多能干细胞中实现特定杂合或纯合核苷酸改变的方法。...

利用CRISPR-Cas9在人类多能干细胞中产生特定基因组修饰

本文介绍了一种利用基于piggyBac的供体质粒和Cas9切口酶突变体，在人类多能干细胞中实现无缝基因编辑的详细方法。在人类胚胎干细胞（hESCs）中，将两个点突变引入肝细胞核因子4α（HNF4α）基因座的第8号外显子。...

利用无缝基因组编辑技术在人类多能干细胞中引入点突变

本方法描述了利用高效慢病毒介导的基因递送系统，在稳定表达靶向L2HGDH基因的sgRNA的人胚胎干细胞（hESC）系H9中，构建CRISPR介导的基因敲除。...

CRISPR-Cas9 介导的无饲养层培养条件下人多能干细胞基因敲除

学习使用电穿孔和抗生素筛选技术对人多能干细胞进行基因组编辑的方法。本视频演示AAVS1位点靶向编辑、EGFP表达验证及单克隆挑取流程，为干细胞生物学和疾病建模研究提供可靠实验方案。

基因编辑人类多能干细胞系的建立：从靶向到分离

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