基因编辑人类多能干细胞系的建立：从靶向到分离

本实验的总体目标是利用现代基因组编辑技术对人类多能干细胞进行遗传改造。尽管该方法可加深对干细胞生物学的理解，还可用于在基因明确的背景下促进人类疾病建模。通常，初次接触该技术的研究人员需要经过多次克隆分离练习才能熟练掌握。

该方法的可视化演示至关重要，因为菌落的识别与挑选可能较为困难。首先，在六孔板中培养人多能干细胞，培养基为hESC培养基，六孔板内含经丝裂霉素C处理的失活小鼠胚胎成纤维细胞，或在明胶上生长的MEF饲养层细胞。自接种后每一天，直至hPSCs达到50%汇合度，均使用玻璃移液管和真空装置将培养基全部移除。

每孔加入三毫升温热的 hESC 培养基。在靶向操作前一天，移除 hESC 培养基，并加入新鲜预热的、添加 10 微摩尔 Y-27632 的 hESC 培养基。同时，准备一至两块来自 DR4 小鼠的耐药性 MEF 饲养层细胞六孔板。

在靶向当天，通过移液将五微克锌指核酸酶表达质粒1和2、TALON 1和2表达质粒，或十五微克编码CRISPR Cas9 px330的质粒加入至一个1.5毫升离心管中。加入30微克修复型供体质粒，然后加入足量的1×磷酸盐缓冲液，使总体积达到300微升。在显微镜下观察细胞，确保细胞融合度达到50%。

接下来，使用玻璃移液管和真空装置吸除hPFC培养板中的培养基，然后用2毫升预热的1×PBS洗涤细胞。吸除PBS后，直接向细胞中加入0.5毫升0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液。将培养板置于组织培养孵箱中约10分钟，或直至饲养层细胞开始从培养板表面脱落。

孵育结束后，向每孔加入2毫升温热的ES洗涤培养基以终止胰蛋白酶反应。收集每孔中的细胞，确保饲养层细胞以单层形式脱落。将每孔的内容物转移至同一个50毫升锥形管中，合并所有孔的细胞，并使用10毫升血清移液管反复吹打重悬细胞。

加入ES洗涤培养基，使细胞悬液总体积达到40毫升。静置1至2分钟，使较大的饲养层细胞团块沉降至管底，然后用血清移液管吸除上清液，转移至一个新的50毫升锥形离心管中。将细胞悬液在190 × g条件下离心5分钟，随后用移液管小心吸除上清液，注意不要扰动管底的细胞沉淀。

将细胞重悬于500微升1× PBS中。将重悬的细胞与先前配制的质粒转染溶液混合。用移液器将细胞和转染混合物加入4毫米电穿孔杯中，置于冰上孵育3至5分钟。

将电穿孔系统的指数衰减程序参数设置为250伏、500微法、无限电阻和4毫米比色杯。对细胞进行电穿孔，然后将比色杯放回冰上静置3分钟。用18毫升预热的hESC培养基重悬电穿孔后的细胞，培养基中添加10微摩尔Y-27632。

在显微镜下观察 DR4 MEF 细胞。将三毫升单细胞悬液接种至含有 DR4 饲养层细胞的六孔板的每个孔中，然后放回培养箱。接种后第三天，更换细胞培养基，使用不含 Y-27632 的 hESC 培养基。

第四天，将未添加补充物的培养基更换为含有适当筛选抗生素的培养基，此处使用嘌呤霉素。在挑取克隆的前一天，为每个待挑取的克隆准备一块12孔板的MEF饲养层细胞。

接种后第12天，在解剖显微镜下观察培养板。挑选直径在800至1,200微米之间、适合挑取的克隆。确保这些克隆中不含有开始分化的细胞，例如此处所示的克隆。

同时，确保细胞正在表达GFP。在挑选当天，在显微镜下检查MEF细胞，以确认其状态健康。吸除MEF饲养细胞培养板中的所有培养基，并加入一毫升hESC培养基。

同时，更换将要进行挑取操作的六孔 hPSC 培养板中的 hESC 培养基。接着，拉制用于挑取克隆的玻璃毛细吸管。挑取克隆时，首先将 hPFC 培养板置于生物安全柜内解剖显微镜的载物台上，通过将玻璃毛细吸管末端插入吸球中，组装好挑取装置。

确定待挑选的菌落，将拉制的玻璃移液管尖端置于菌落上方。然后，挤压挑取装置的吸球，轻柔地将单个菌落切割成10至20个大小均一的小块。接着，通过释放吸球将切割后的菌落小块吸入移液管中。

转移时尽量吸取少量培养基。挤压吸头，将已破碎的菌落直接转入含MEF饲养层细胞的12孔板中的一个孔内。对每个孔进行标记，以便唯一识别由单细胞衍生的克隆。

更换玻璃移液管，并对下一个菌落重复上述操作。将培养板放回培养箱，并轻轻摇动培养板以分散孔中的细胞。第二天，移除全部培养基，加入1.5 mL温热的hESC培养基。

重复操作10至12天，直至细胞汇合度达到50%。10至12天后，在显微镜下观察hESCs。从每个孔中挑选1至2个克隆，转移至新的12孔MEF饲养细胞板中，以制备复制板。

从原始培养板中每个孔的剩余菌落中提取DNA，用于PCR或Southern印迹基因分型。Weber实验室的三种人类胚胎干细胞系利用位点特异性核酸酶和修复模板，靶向AAVS1位点，引入EFFP报告基因和嘌呤霉素抗性表达盒。这些代表性图像显示了分别使用锌指核酸酶、TALENs和CRISPR/Cas9编辑的细胞克隆。

这些具有代表性的PCR基因分型结果展示了使用锌指核酸酶、TALENs和CRISPR/Cas9技术获得的非靶向、杂合型和纯合型靶向克隆，同时包括野生型对照。该表格显示了本实验中每种位点特异性核酸酶在AAVS1位点经PCR验证的整合情况，并与先前实验中经Southern印迹验证的正确单一位点整合结果进行了比较。CRISPR-Cas9获得了最多正确靶向的克隆，而TALEN平台则获得了最多纯合靶向的克隆。

一旦掌握，该技术需要约三到五小时的动手操作时间，通常在开始实验后约三周内即可获得基因编辑的细胞。使用该技术时，务必注意安全，并始终采用无菌操作技术。在完成基因操作后，可通过将干细胞分化为其他细胞类型（如神经元）来观察其对其他类型细胞的影响。

本实验方案的建立为研究人员利用基因组编辑技术在人类多能干细胞中构建体外疾病模型铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分掌握在人类多能干细胞中进行基因组编辑的方法。