锌指核酸酶增强基因打靶的人胚胎干细胞

该方案的总体目标是使用定制设计的锌指核酸酶有效地将转基因靶向人胚胎干细胞中的目标位点。扩增人胚胎干细胞或 HSC 以产生足够的材料进行电穿孔，然后消化以产生单细胞。接下来，将编码两个定制设计的锌指核酸酶的 mRNA 与线性化的 EGFP 供体序列共电穿孔到 HSC 中，然后将细胞接种到新鲜的小鼠胚胎、成纤维细胞或 MEF 上。

电穿孔锌指核酸酶将双链断裂引入细胞中 pit X 三个基因座的第一个外显子。然后在 14 至 21 天后的细胞分裂过程中掺入 EFGP 供体序列，其两侧是与 DNA 双联链 Brake 位点序列具有同源性的靶向臂。将 1/3 的单个 HESC 集落传代到基质胶包被的 96 孔板的每个孔中，将另外 2/3 转移到含有新鲜 ME Fs 的 48 孔板的相应孔中。

然后进行 Southern 印迹以确认正确整合。一旦确认阳性克隆，它们就会扩增，然后冷冻以备进一步使用。与现有方法（例如常规同源重组）相比，该技术的主要优点是锌指产生预定的 DNA 双链断裂，这有助于高效靶向转基因以预定人胚胎干细胞中的位点。

虽然这里我们将一个反式基因引入人类干细胞的 pit X 三个基因座，但这种方法可以适用于使用报告细胞系有利的任何其他系统。如随附文件所述，通过扩增人胚胎干细胞或 HSC 进行转染来开始此方案。当菌落达到 60% 至 70% 汇合时，将组织培养板放在解剖显微镜上。

在 2 mil L 移液器的末端使用 21 号针头，通过去除分化的菌落或菌落核心来梳理菌落。接下来洗涤 HESC 菌落，吸出培养基。然后加入 5 mL HBSS 并孵育 2 分钟。

孵育吸出后，HBSS 加入 5 毫升 Accutane，并在 37 摄氏度和 5% CO2 下孵育 10 至 20 分钟，直到在显微镜下观察集落变成单细胞。使用 1 毫升移液器对细胞进行 tri 测量。接下来，加入 10 毫升 HESC 培养基，并使用 40 微米细胞过滤器将其过滤到 15 毫升锥形管中。

要去除任何细胞团块，请以 160 倍重力离心流出 5 分钟。离心 Resus 后，将细胞沉淀悬浮在 5 毫升新鲜 HESC 培养基中，然后再次离心以去除任何残留的 Accutane 溶液。将细胞重悬于含有 10 微摩尔 Y 2 7 6 3 2 的 HESC 培养基中，并将其转移到预涂有明胶的 100 毫米培养皿中，在 37 摄氏度、5% CO2 中孵育至少 30 分钟。

在此期间，MEF 将粘附在明胶涂层培养皿上。孵育后，使用 1 毫升移液器将非粘附的 HE SSC 收集到新鲜的 15 毫升离心管中，并使用血细胞仪测定细胞密度，为电穿孔做准备。将本视频上一节制备的 750 万个 HSC 转移到新的 15 mL 锥形管中，并以 160 倍比重离心 5 分钟。

离心复苏后，将细胞沉淀悬浮在 0.8 毫升冰冷的 0.22 微米过滤 HBSS 中，将溶液转移到无菌的 0.4 厘米电穿孔兽医中。接下来，添加 30 微克 TVH 坑 X 3 个正向靶向。构建 DNA 并用 200 μL 移液管轻轻混匀，在孵育过程中在冰上孵育 5 分钟，在冰上解冻和分装 pit X 三个 ZFN mRNA。

解冻后，将 7.5 μL 转移到 DNA 细胞混合物中，放入电穿孔 Q vet 中，用 200 μL 移液管轻轻混合。按下电镜上的红色按钮转染细胞。然后使用 200 微升移液器将内容物从电穿孔 Q Vet 转移到含有 10 毫升 HESC 培养基的 15 毫升试管中。

用 200 μL HESC 培养基洗涤 Q VET 两次，并将洗涤液收集在同一 15 mL试管中。从裂解的细胞中去除由DNA和蛋白质组成的粘液状碎片。以 160 倍重力离心 5 分钟。

旋转后，吸出上清液并轻轻敲击细胞沉淀，以松开 30 毫升的 Reese 花费。补充有 RH FGF 2 和 10 微摩尔 Y 2 7 6 3 2 的 M-E-F-C-M，并铺在三个含有 MEF 的 100 毫米培养皿上。在 37 摄氏度、5%CO2、95%O2 下孵育。

第二天每天更换培养基，仅在 HESC 培养基中抽出 Y 2 76 32 和总细胞。两到三天后，此时 HES CS 应达到 50% 至 70% 汇合。开始抗生素选择。

通过每天在每个霉菌素培养基中加入新鲜的 HESC 来保持选择。大约 7 天后，如果不使用抗生素耐药性 MEF，应该可以看到小菌落。MEF 可以通过每平方厘米额外添加 1 乘以 10 个第四个细胞来补充。

选择后 14 至 21 天，当菌落直径达到约 1 毫米时。通过向 3 96 的每个孔中加入 75 微升基质胶或凝胶 TRE 来准备用于扩增和筛选的板。孔板还制备 3 个 48 孔板的 MEF，每平方厘米 10 至第四个细胞，第二天在 37 摄氏度、5%CO2 下孵育两组板过夜。

在 2 毫升移液器的末端使用 21 号针头，通过切割网格将 HESC 菌落解剖成 16 至 25 块。接下来，从 96 孔板中吸出基质胶，并用补充有 R hf、GF 2 和 per mycin 的 CM MEF 培养基替换它。用 HBSS 洗涤 48 孔板中的 MEF，然后使用 200 微升移液管添加含有每个霉素的 HESC 培养基。

轻轻地将解剖的集落的三分之一转移到 48 孔板中进行扩增。将解剖集落的另外三分之二转移到相应的 90 孔板中，该板含有补充的 C-M-M-E-F 培养基。这个过程最困难的方面是菌落碎片的转移。

我们建议您事先练习转移和解剖彩色作品。通过每天更换补充抗生素的培养基来维护两个板。一旦板汇合，膨胀直到 96 孔板 100% 汇合。

倒置从板中去除所有培养基，然后吸干到纸巾上。在 Resus 将 DNA 悬浮在 TE 或 TO 0.1 E 中后，按照随附文件所述继续制备用于 PCR 的基因组 DNA.如随附文件所述，使用扩展长模板 PCR 系统进行 PCR，在通过电泳筛选阳性克隆后，每 10 微升 PCR 反应使用 1 至 2 微升重悬 DNA，并通过 Southern 印迹确认。一旦确认阳性克隆，继续进行传代培养并冷冻剩余的菌落片段以设计 PIT X 3。

报告细胞系 hecs。与定制设计的 pit X 三个锌指对和 pit X 三个 EGFB 特异性 DNA 供体载体共同混合，如本视频文章所述，在 PERY 和选择之后，通过基因组 PCR 筛选检测到阳性 HESC 克隆，如图所示。有许多阳性克隆，如 9 84 个碱基对处的条带所示。

然后使用 5 和 3 特异性探针对这些 PCR 阳性克隆进行 Southern blot 杂交。该图显示了线性化靶向载体的示意图以及此处 5 个和 3 个外部探针的位置。显示了野生型和靶向等位基因的 5 和 3 Southern 印迹。

野生型泳道中的单个条带表示两个相同的等位基因，在将转基因正确靶向 pit x 三个基因座后，观察到两个条带。一个对应于正确靶向的等位基因，另一个对应于野生型等位基因。一旦掌握，这种方法可以在两到三个月内完成。

观看此视频后，您应该对如何使用锌指核酸酶靶向人干细胞，以及如何使用 PCR 和 Southern blot 策略筛选正确靶向的 cl 有很好的了解。