使用无缝基因组编辑将点突变引入人类多能干细胞
May 10th, 2020
在这里，我们描述了一种使用基于 piggyBac的供体质粒和Cas9切口酶突变体在人类多能干细胞中进行无缝基因编辑的详细方法。将两点突变引入人胚胎干细胞（hESCs）肝细胞核因子4α（HNF4α）位点的外显子8。
在人类多能干细胞中编辑基因具有挑战性。该协议提供了使用配对 Cas-90 案例与靶向载体结合在这些细胞中进行基因组编辑的详细程序。它可靠且易于遵循。
该方案的主要优点是它是无缝的基因组编辑。两步选择有助于增加靶向细胞，并使基因分型筛选更加高效。在 mTeSR1 培养基中，将人多能干细胞维持在重组层粘连蛋白 21 编码表面上。
细胞应在 1 比 3 分流比后 72 小时达到 70% 至 85% 汇合度。在转染当天，用 300 μL 层粘连蛋白 521 溶液包被 24 孔板的足够孔，并在 37 摄氏度下孵育板至少两个小时。孵育后，轻轻去除包被溶液，并立即向每个孔中加入 300 μL 新鲜 mTeSR1 培养基，并补充有 10 μmolar ROCK 抑制剂。
然后将板放回培养箱中。从培养箱中取出原液人多能干细胞。取出用过的培养基，用 1 毫升无菌 DPBS 洗涤细胞一次。
然后向每个孔中加入 1 毫升温和的细胞解离试剂，并在 37 摄氏度下孵育 6 至 8 分钟以解离细胞。轻轻敲击板以确保细胞可以轻松分离。然后使用 P1000 吸头通过上下移液来提起细胞。
加入 2 毫升含 ROCK 抑制剂的 mTeSR1 培养基以终止解离。将悬浮液充分混合，然后转移到 50 毫升试管中。将细胞以 200 G 离心 3 分钟。
然后去除上清液，将细胞重悬于含 ROCK 抑制剂的 2 mL mTeSR1 培养基中。使用血细胞计数器和台盼蓝对细胞进行计数。对于每个核转染反应，将 800， 000 至 100 万个细胞转移到 1.5 mL 试管中，并以 200 G 离心 3 分钟。
然后小心吸出上清液。将 3 μg 配对的 Cas-9n 单向导 RNA 表达质粒和 5 μg 靶向载体质粒混合到来自人干细胞核转染试剂盒的 100 μL 混合核转染溶液中。还准备 GFP 对照质粒混合物。
用 DNA 混合物重悬细胞，并将其转移到电穿孔比色皿中，确保避免气泡。使用人多能干细胞的优化条件，用核转染装置对细胞进行电穿孔。立即向电穿孔细胞中加入 500 微升新鲜温热的 mTeSR1 培养基，其中补充有 10 微摩尔的 ROCK 抑制剂。
然后将混合物转移到先前制备的 24 孔板的两个孔中。将板放入提供 37% 二氧化碳的 5 摄氏度培养箱中，以使细胞恢复。12 至 16 小时后更换细胞维持培养基，如果细胞建立细胞间接触，则停用 ROCK 抑制剂。
24 至 48 小时后，通过检查对照细胞中的 GFP 表达来检查成核转染效率。在核酸转染后 48 小时，通过在 mTeSR1 培养基中补充 1 μg/mL 嘌呤霉素来开始选择细胞。72 小时后，向培养基中补充 0.5 μg/mL 嘌呤霉素。
如果细胞汇合度低于 30%，则还要用 10 微摩尔 ROCK 抑制剂补充培养基。核转染后 4 至 6 天，将嘌呤霉素抗性细胞以每孔 0.8 个细胞的浓度传代至 10 至 15 个 96 孔板中。确保用 ROCK 抑制剂和嘌呤霉素补充培养基。
将细胞在 37 摄氏度和 10% 二氧化碳下维持 10 至 12 天，以形成单细胞衍生菌落。播种后 7 天加满培养基。标记含有单个菌落的孔，并用新鲜的 mTeSR1 培养基替换培养基，该培养基含有 0.5 μg/mL 嘌呤霉素，但不含 ROCK 抑制剂。
将细胞在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下再培养两天。然后更换含有未分化菌落的孔的培养基。轻轻刮掉菌落，将细胞悬液从一个菌落转移到单独的 96 孔板上的两个新孔中。
一个用于基因分型，一个用于维护。一旦基因分型细胞的汇合度达到 50% 或更高，倾倒用过的培养基并用 DPBS 洗涤细胞一次。用 Bradley 裂解缓冲液裂解细胞，并从每个孔中分离基因组 DNA。
在进行 3 次引物连接 PCR 并对产物进行测序后，保留具有正确基因型的菌落并丢弃其余菌落。在连续嘌呤霉素选择下扩增正确的菌落，并在尽可能早的传代时将其冷冻。该方案用于将两点突变引入肝细胞核因子 4 α 基因的 Exon8 中。
采用基于三引物的 PCR 方法筛选正确靶向的细胞，并进行 Sanger 测序以确认 PCR 结果。去除选择盒后，再次对修饰的区域进行测序，以确认所需点突变的正确引入。选择具有正确基因型的菌落，并在进一步分析之前对细胞进行表征。
编辑后的细胞具有与亲本细胞相同的形态，并表达具有代表性的人多能干细胞标志物，包括转录因子 Nanog 和 Oct4，以及细胞表面标志物 SSEA-4 和 TRA-160。尝试此程序时，请务必记住在选择 puromycin 后的前 24 小时内检查细胞汇合度。必须用 ROCK 抑制剂补充中位数。
如果细胞汇合度低于 30%，则保持细胞继续运行。一旦建立了基因组编辑的多能干细胞系，它们就可以用于研究基因功能或定向分化。这项技术为研究人员研究不同的问题铺平了道路，例如基因的特定功能或遗传疾病的靶向基因校正。
概述
本文介绍了一种使用基于piggyBac的供体质粒和Cas9切削酶突变体在人类多能干细胞中进行无缝基因编辑的详细协议。该方法成功地在人类胚胎干细胞中的HNF4α基因座引入了两个点突变。
关键研究组成部分
科学领域
- 基因编辑
- 干细胞生物学
- 基因组学
背景
- 人类多能干细胞中的基因编辑是复杂的。
- 配对的Cas9切削酶提供了一种可靠的编辑方法。
- 无缝的基因组编辑对于精确修改是有利的。
- 高效的基因分型筛选对于成功编辑至关重要。
研究目的
- 开发一种在人类多能干细胞中进行精确基因编辑的方法。
- 在HNF4α基因中引入特定的突变。
- 提高选择编辑细胞的效率。
所用方法
- 在重组层粘连蛋白表面维持干细胞。
- 用Cas9和靶向载体质粒进行细胞核质转染。
- 使用纯霉素选择来分离成功编辑的细胞。
- 通过基因分型和测序来确认成功编辑。
主要结果
- 成功地在HNF4α基因座引入了两个点突变。
- 编辑后的细胞保持了多能特性。
- 建立了高效的选择和基因分型方法。
- 编辑的细胞表达了关键的多能标记。
结论
- 该协议能够在人类多能干细胞中进行精确的基因编辑。
- 它为研究基因功能和分化提供了基础。
- 未来的应用包括研究特定基因在发育中的角色。
常见问题
Executive Industry Relevance
Seamless genome editing in human pluripotent stem cells enables precise interrogation of gene function and disease modeling at the earliest stages of drug discovery. The protocol's efficiency and reliability in introducing point mutations at the HNF4α locus support high-confidence target validation and mechanistic de-risking. This capability strengthens translational continuity from discovery biology to preclinical research, directly impacting portfolio prioritization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise introduction of disease-relevant mutations for functional genomics studies.
- Supports robust target validation by generating isogenic cell lines with defined genetic alterations.
- Facilitates mechanistic de-risking by allowing direct assessment of gene function in human cellular contexts.
- Improves predictive confidence for downstream therapeutic hypothesis testing.
Screening & Assay Development
- Provides validated, genetically defined cell systems for assay development and compound screening.
- Ensures reproducibility and standardization through seamless editing and rigorous genotyping.
- Enables quantitative readouts by confirming precise genomic modifications via PCR and sequencing.
- Supports scalable generation of cell lines for high-throughput screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns engineered cell models with disease-relevant genotypes for translational biomarker studies.
- Maintains pluripotency and differentiation potential, supporting continuity into preclinical validation.
- Reduces biological risk by confirming genetic and phenotypic fidelity of edited lines.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on validated genetic models.
Pipeline & Workflow Integration
This genome editing protocol integrates at the interface of early discovery and preclinical model development, enabling seamless transition from target validation to disease modeling.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling targeted gene modification.
- Screening: Delivers reproducible, genetically defined cell lines for assay readiness and quantitative evaluation.
- Analytics: Provides robust genotyping and sequencing outputs for confident comparison of edited versus parental lines.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical research by generating models with disease-relevant mutations.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for generating custom-edited pluripotent stem cell lines across multiple targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes genome editing workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of genetically validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell culture, nucleofection, and molecular genotyping.
- Needs access to electroporation devices, high-quality plasmids, and sequencing infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization for cell handling and selection protocols.
- Adaptation may be needed for different gene targets or cell line backgrounds.
- Cell viability and confluency must be closely monitored during selection and expansion phases.
