Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing

在人类多能干细胞中编辑基因具有挑战性。该协议提供了使用配对 Cas-90 案例与靶向载体结合在这些细胞中进行基因组编辑的详细程序。它可靠且易于遵循。

该方案的主要优点是它是无缝的基因组编辑。两步选择有助于增加靶向细胞，并使基因分型筛选更加高效。在 mTeSR1 培养基中，将人多能干细胞维持在重组层粘连蛋白 21 编码表面上。

细胞应在 1 比 3 分流比后 72 小时达到 70% 至 85% 汇合度。在转染当天，用 300 μL 层粘连蛋白 521 溶液包被 24 孔板的足够孔，并在 37 摄氏度下孵育板至少两个小时。孵育后，轻轻去除包被溶液，并立即向每个孔中加入 300 μL 新鲜 mTeSR1 培养基，并补充有 10 μmolar ROCK 抑制剂。

然后将板放回培养箱中。从培养箱中取出原液人多能干细胞。取出用过的培养基，用 1 毫升无菌 DPBS 洗涤细胞一次。

然后向每个孔中加入 1 毫升温和的细胞解离试剂，并在 37 摄氏度下孵育 6 至 8 分钟以解离细胞。轻轻敲击板以确保细胞可以轻松分离。然后使用 P1000 吸头通过上下移液来提起细胞。

加入 2 毫升含 ROCK 抑制剂的 mTeSR1 培养基以终止解离。将悬浮液充分混合，然后转移到 50 毫升试管中。将细胞以 200 G 离心 3 分钟。

然后去除上清液，将细胞重悬于含 ROCK 抑制剂的 2 mL mTeSR1 培养基中。使用血细胞计数器和台盼蓝对细胞进行计数。对于每个核转染反应，将 800， 000 至 100 万个细胞转移到 1.5 mL 试管中，并以 200 G 离心 3 分钟。

然后小心吸出上清液。将 3 μg 配对的 Cas-9n 单向导 RNA 表达质粒和 5 μg 靶向载体质粒混合到来自人干细胞核转染试剂盒的 100 μL 混合核转染溶液中。还准备 GFP 对照质粒混合物。

用 DNA 混合物重悬细胞，并将其转移到电穿孔比色皿中，确保避免气泡。使用人多能干细胞的优化条件，用核转染装置对细胞进行电穿孔。立即向电穿孔细胞中加入 500 微升新鲜温热的 mTeSR1 培养基，其中补充有 10 微摩尔的 ROCK 抑制剂。

然后将混合物转移到先前制备的 24 孔板的两个孔中。将板放入提供 37% 二氧化碳的 5 摄氏度培养箱中，以使细胞恢复。12 至 16 小时后更换细胞维持培养基，如果细胞建立细胞间接触，则停用 ROCK 抑制剂。

24 至 48 小时后，通过检查对照细胞中的 GFP 表达来检查成核转染效率。在核酸转染后 48 小时，通过在 mTeSR1 培养基中补充 1 μg/mL 嘌呤霉素来开始选择细胞。72 小时后，向培养基中补充 0.5 μg/mL 嘌呤霉素。

如果细胞汇合度低于 30%，则还要用 10 微摩尔 ROCK 抑制剂补充培养基。核转染后 4 至 6 天，将嘌呤霉素抗性细胞以每孔 0.8 个细胞的浓度传代至 10 至 15 个 96 孔板中。确保用 ROCK 抑制剂和嘌呤霉素补充培养基。

将细胞在 37 摄氏度和 10% 二氧化碳下维持 10 至 12 天，以形成单细胞衍生菌落。播种后 7 天加满培养基。标记含有单个菌落的孔，并用新鲜的 mTeSR1 培养基替换培养基，该培养基含有 0.5 μg/mL 嘌呤霉素，但不含 ROCK 抑制剂。

将细胞在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下再培养两天。然后更换含有未分化菌落的孔的培养基。轻轻刮掉菌落，将细胞悬液从一个菌落转移到单独的 96 孔板上的两个新孔中。

一个用于基因分型，一个用于维护。一旦基因分型细胞的汇合度达到 50% 或更高，倾倒用过的培养基并用 DPBS 洗涤细胞一次。用 Bradley 裂解缓冲液裂解细胞，并从每个孔中分离基因组 DNA。

在进行 3 次引物连接 PCR 并对产物进行测序后，保留具有正确基因型的菌落并丢弃其余菌落。在连续嘌呤霉素选择下扩增正确的菌落，并在尽可能早的传代时将其冷冻。该方案用于将两点突变引入肝细胞核因子 4 α 基因的 Exon8 中。

采用基于三引物的 PCR 方法筛选正确靶向的细胞，并进行 Sanger 测序以确认 PCR 结果。去除选择盒后，再次对修饰的区域进行测序，以确认所需点突变的正确引入。选择具有正确基因型的菌落，并在进一步分析之前对细胞进行表征。

编辑后的细胞具有与亲本细胞相同的形态，并表达具有代表性的人多能干细胞标志物，包括转录因子 Nanog 和 Oct4，以及细胞表面标志物 SSEA-4 和 TRA-160。尝试此程序时，请务必记住在选择 puromycin 后的前 24 小时内检查细胞汇合度。必须用 ROCK 抑制剂补充中位数。

如果细胞汇合度低于 30%，则保持细胞继续运行。一旦建立了基因组编辑的多能干细胞系，它们就可以用于研究基因功能或定向分化。这项技术为研究人员研究不同的问题铺平了道路，例如基因的特定功能或遗传疾病的靶向基因校正。