phiC31 整合酶介导的定点转基因整合:一种用于位点特异性转基因整合到按蚊载体中的显微注射技术

phiC31整合酶是一种噬菌体衍生的重组酶，可催化转基因（外源基因）的位点特异性重组到宿主基因组中。为了在按蚊宿主中整合转基因，从合适缓冲液中的按蚊胚胎开始。

按蚊基因组经过预先设计，具有用于基因整合的附着位点和用于视觉选择的青色荧光标记物。接下来，将携带所需转基因货物、附着位点、红色荧光标记物和质粒骨架成分的少量供体质粒添加到小瓶中。然后，添加携带基因编码整合酶的最佳体积的辅助质粒。现在，将质粒混合物加载到微量注射器中。

轻轻地将质粒注射到胚胎的后极，即生殖细胞的起源位点，导致细胞质轻微移动。一旦进入胚胎，辅助质粒就开始合成整合酶。

整合酶介导供体质粒和宿主基因组之间的位点特异性重组。因此，来自供体质粒的转基因和红色荧光标记物整合在按蚊基因组的重组附着位点内。此后，将注射的胚胎在生理条件下孵育孵化，间歇旋转。

几天之内，胚胎孵化成幼虫。在荧光显微镜下，具有成功整合基因的按蚊幼虫表达青色荧光（标记宿主基因组）和红色荧光（标记来自供体质粒的转基因）。

使用无内毒素纯化试剂盒纯化供体和辅助质粒。将携带目标转基因的attB标记供体质粒和携带整合酶的辅助质粒结合，以获得终浓度为每微升供体质粒350纳克和每微升150纳克辅助质粒的混合物。

通过在2.5体积的冰冷100%乙醇中加入0.1体积的3摩尔乙酸钠来沉淀DNA。然后，漩涡。白色沉淀物应该立即可见。洗涤沉淀，并将其重悬于注射缓冲液中，以达到每微升500纳克的总终浓度。然后，准备每个 10 至 15 微升的等分试样，并将它们储存在负 20 摄氏度下。

显微注射前 72 小时，从所需的对接线和野生型对应物中给 4 至 7 天大的蚊子喂血。通过以 45 度角瞄准胚胎的后极，在 25 毫摩尔氯化钠中进行冈比亚按蚊胚胎显微注射。

30 度角瞄准后极，在卤化碳油中进行按蚊胚胎显微注射。注射后立即将鸡蛋转移到装满无菌蒸馏水的培养皿中，然后将它们放回昆虫状态。孵化后，每天将 G₀ 幼虫转移到装有盐蒸馏水的托盘中，然后返回蛹。