Name: 注射的。 stephensi胚胎生成抗药性疟疾的蚊子 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: 学习在Anopheles stephensi蚊子胚胎中进行显微注射以培育抗疟疾转基因蚊子的技术。该方法通过将外源基因注入胚胎，使蚊子对疟原虫产生抗性，为亚洲地区疟疾防控提供新策略。

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显微注射前的准备工作：
<ol>
<li>为蚊子提供血液：若需在周一至周三进行注射，则于前一周的周五让雌蚊吸血；若需在周四和周五注射，则于当周周一让雌蚊吸血。 </li>
<li>使用程序2和等渗缓冲液制备石英玻璃针（见材料部分）。 </li>
<li>胚胎的“产卵管”为常规的黑腹果蝇培养管。在管底放入湿润的棉絮，并用一张湿润的滤纸圆片覆盖其上。 </li>
<li>准备塑料盖玻片：在一端粘贴双面胶带，并修剪胶带，使其与盖玻片边缘对齐，完全覆盖盖玻片末端。 </li>
<li>准备用于脱水的油。 </li>
<li>准备一个含有等渗缓冲液的培养皿，用于转移胚胎以进行孵化。</li>
</ol>
强制产卵的设置：
<ol>
<li>使用吸虫器收集6-10只吸血后的雌蚊，并将其转移至 果蝇 含等渗缓冲液浸润的棉絮和滤纸的培养管。 </li>
<li>将蚊子重新放回昆虫饲养室的黑暗条件下，使其产卵 1 小时 15 分钟。 </li>
<li>让成虫飞入笼中，然后移除带有胚胎的滤纸片。 </li>
<li>在解剖显微镜下对卵进行排列。使用细毛画笔（貂毛，0000号）收集卵团，并转移至预先用等渗缓冲液浸湿的3MM Whatman滤纸方块上。始终保持滤纸湿润，避免卵干燥。用画笔去除卵的外 chorion（exochorion），这有助于卵更好地黏附于胶带。 </li>
<li>使用5号精细镊子或精细毛笔，挑取深灰色的胚胎，并将其排列在用等渗缓冲液润湿的3MM Whatman滤纸方块上，排成一行，共20-30枚胚胎。所有胚胎必须保持相同朝向，因为注射需在胚胎后极进行；胚胎前端略宽于后端。随后，用条状3MM Whatman滤纸从卵列两侧用力按压，吸干卵列周围滤纸上的液体，注意不要触碰胚胎。 </li>
<li>转移卵子时，将带有双面胶（Medicine）的载玻片倒置，轻轻按压卵子。卵子的后端必须非常接近双面胶的边缘。纸张的湿度对此步骤至关重要，若过于湿润则卵子无法粘附。我对胚胎进行干燥处理从 5-10 其次，但干燥时间取决于显微注射室内的湿度和温度。 </li>
<li>干燥处理 对卵子至关重要：脱水过度则胚胎无法孵化；若不脱水，DNA 无法进入胚胎。 </li>
<li>用卤代烃油覆盖干燥的胚胎，以防止进一步脱水。 </li>
</ol>
胚胎显微注射：
良好注射最重要的方面是针头的质量（见注释）。
<ol>
<li>使用微量移液器（Eppendorf #5242 956.003）将待注射的DNA溶液吸入注射针中。所需注射液体积很小，仅需1至2 ml。 </li>
<li>将注射针连接至Eppendorf &nbsp;Transjector，该装置可控制注射时间、注射压力以及反向压力。显微注射在带有移动载物台（Leica）的显微镜下进行，放大倍数为10倍，并配合使用显微操作仪（Leica）。如有需要，可通过堆叠4-5张载玻片来升高显微镜载物台。将承载胚胎的盖玻片置于升高的载物台上。注射时，注射针与胚胎呈150°角，穿刺部位应位于胚胎后极。进行注射时，我保持注射针静止不动，而通过移动显微镜载物台来完成操作。新的注射针尖端通常封闭，在首次注射时会破裂。每次注射间隔，我都会测试所需压力，使少量DNA溶液在油中形成微小液滴以确认通畅。 </li>
<li>当使用新注射针时，我将注射时间设定为0.2–0.9秒，压力设定为1000 hPa。通过调整压力和时间，直至观察到针尖在油中释放出微小液滴为止。反向压力应设置在约100 hPa左右。随着针尖磨损，必须降低注射压力以维持较低的注射体积（约300 hPa）。当针尖变得过大时，会导致大部分胚胎死亡。 </li>
<li>注射完成后，用纸巾吸除油液，将带有胚胎的载玻片盖好，并&nbsp;放入含有等渗缓冲液的培养皿中。将培养皿置于孵育箱内，直至胚胎孵化。胚胎通常在2–6天后开始孵化。将孵化出的幼虫转移至含有少量磨碎鱼食的蒸馏水中培养。</li>
</ol>
注意事项
用于注射的DNA：用于注射的质粒DNA溶液使用无内毒素质粒提取试剂盒（EndoFree plasmid kit）进行提取。将构建质粒与辅助质粒按正确浓度混合，用异丙醇沉淀。沉淀物用70%乙醇洗涤，然后溶于注射缓冲液中。注射前，使用Millex-GV滤柱纯化DNA。
等渗缓冲液：
<table border="1" cellpadding="8">
<tbody>
<tr>
<td>1.68 M NaCl - 88.3 ml 1.68 M NaCl - 2.9 m 1 M Hepes - 10.7 ml 1.12 M CaCl2 - 2.2 ml dH2O - 896 ml</td>
<td>或</td>
<td>5 M NaCl - 29.67 ml 1 M KCl - 4.87 ml 1 M Hepes - 10.7 ml 1.12 M CaCl2 - 2.2 ml dH2O - 952.56 ml</td>
</tr>
</tbody>
</table>
调节至 pH 7.2

<table><tbody><tr><td>注射用石英针</td><td></td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td>外径 1.0 mm，内径 0.70 mm，长度 10 cm，通过毛细管拉制仪将毛细管拉制成尖端细小（3–8 µm）、杆部约 100–300 mm 的微细移液管。</td></tr><tr><td>石英拉针仪</td><td>工具</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-2000</td><td>设置参数：加热-275，拉力-3，速度-38，延迟-250，拉力-141</td></tr><tr><td>内毒素清除质粒提取试剂盒</td><td></td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Millex-GV 滤柱</td><td></td><td></td><td>SLGV RO4 NL</td><td>用于 DNA 纯化</td></tr><tr><td>构建质粒 DNA</td><td></td><td></td><td></td><td>0.5 mg/ml</td></tr><tr><td>辅助质粒</td><td></td><td></td><td></td><td>0.3 mg/ml</td></tr><tr><td>注射缓冲液</td><td>缓冲液</td><td></td><td></td><td>1× 溶液：5 mM KCl，0.1 mM 磷酸钠，pH 6.8</td></tr><tr><td>等渗缓冲液</td><td></td><td></td><td></td><td>参见实验方案部分的配方</td></tr><tr><td>干燥油</td><td></td><td></td><td></td><td>卤代烷油 700 与卤代烷油 27 按 1:1 混合，充分混匀。显微注射前预先配制。</td></tr><tr><td>血液</td><td></td><td></td><td></td><td>用于喂养蚊子</td></tr><tr><td>Anopheles stephensi</td><td>动物</td><td></td><td></td><td>蚊子，雌雄均有。</td></tr><tr><td>果蝇培养管</td><td></td><td></td><td></td><td>用于产卵</td></tr><tr><td>培养皿</td><td></td><td></td><td></td><td>加入等渗缓冲液，用于胚胎孵化</td></tr><tr><td>精细画笔</td><td></td><td></td><td></td><td>貂毛 #0000</td></tr><tr><td>3MM Whatman 滤纸</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>#5 镊子</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>双面胶带</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>微量加样器头</td><td></td><td>Eppendorf</td><td>5242 956.003</td><td></td></tr><tr><td>显微注射仪</td><td></td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td></td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>配备移动载物台和显微操作器，放大倍数设为 10×</td></tr></tbody></table>

显微注射斯氏按蚊胚胎以培育抗疟疾蚊子

Injection of An. stephensi Embryos to Generate Malaria-resistant Mosquitoes

将外源基因导入蚊子基因组需要针对特定蚊种优化的显微注射技术。本视频方案展示了James实验室用于在斯氏按蚊胚胎中显微注射DNA构建体以获得转基因蚊子的方法。内容包括显微注射针的制备、胚胎的收集与处理以及显微注射操作的技术演示。

显微注射针制备，胚胎收集，胚胎处理，显微注射，外源基因导入，斯氏按蚊，转基因蚊子

斯氏按蚊是分布在印度及整个亚洲的疟疾传播媒介。本视频展示了对该蚊种进行显微注射的技术，通过导入可使蚊子对疟疾产生抗性的外源基因。本视频所展示的大部分方法同样适用于其他蚊种的显微注射技术。

将外源基因导入蚊子基因组需要针对特定目标物种定制的显微注射技术。这……

每15秒，世界上就有一名儿童死于疟疾。在这里，詹姆斯实验室正致力于培育无法传播疟原虫的法国按蚊。我叫TIUs，目前在美国加利福尼亚大学欧文分校分子生物学与生物化学系的Anthony James实验室工作。今天我将向您展示如何制作转基因的斯蒂文斯氏眼。我们开展这项研究的目的是使疟疾媒介蚊子对疟原虫产生抗性，从而无法携带疟疾寄生虫。目前，我已准备好一个含有等渗缓冲液的小瓶，用于让蚊子在其中产卵。我将使用这个吸虫器吸取蚊子并放入小瓶中。然后将这个小瓶放入30摄氏度的培养箱中，在杯中放置约一小时。现在我们将拉制显微注射针。这些是石英材质的针，我们必须使用非常精细的尖端。因此，我们需要使用这种拉针仪。我们采用 Suter Instruments 公司的拉针仪，以及 SU Instruments 公司提供的精细针具。现在取出蚊子，将这些卵放入培养皿中，培养皿内已放置一张用等渗缓冲液浸湿的滤纸，目的是在注射期间保持胚胎湿润。滤纸上的液体量非常关键：既不能让卵漂浮起来，也不能让其变干。现在，我将把胚胎从卵纸转移到另一张已浸透等渗缓冲液的3毫米沃特曼滤纸上。这样做的目的是在进行显微注射前排列胚胎时去除绒毛膜。接下来，我将去除卵子表面这层银色的绒毛膜。我用刷子轻轻刷去它们。因此，上方的胚胎仍带有绒毛膜，具有银色光泽的部分。下方的胚胎在哪儿？我已经成功取出了Corian，顶部的这个可能会在胶带上滑动，而底部的则会粘住。这在进行不对称操作时非常重要。现在我正在对齐胚胎。胚胎的前端较大，我将其放置在右侧。左侧是较细的后端，我将在此处注射胚胎。我尝试将它们并排放置，以便相互支撑，保持位置稳定。通常我会将大约10个样本排成一行。现在我已经排好了一行胚胎，接下来会将它们转移到盖玻片上。在盖玻片上。我使用假发胶带使其固定。完成后，我会用另一张滤纸吸干胚胎所在位置的滤纸，将胚胎转移到盖玻片上，并在加油前静置干燥30秒。现在我们已将胚胎排列整齐，并置于油下。在显微镜载物台上，我们将使用这种特殊的微生物图案微量移液头，将混有食用染料的 DNA 注入，并将该液体注入端口的针头中。现在我们已经填充了针头，并将其重新安装到微量注射仪上。现在我们已准备好进行显微注射。现在我移动针头以将其调至清晰，以便能够清晰地观察其焦点。完成这一步后，我移动配重针，并将胚胎移入视野，同时对胚胎进行聚焦。当这些操作完成后，我再次调整针头位置，直至其定位准确，然后继续处理我的胚胎。当针头穿过油层时，视野会变得模糊，需要再次进行调节。这就是鲨鱼，没错，就是鲨鱼蜱。现在我准备进行注射。可以看到，我用针头接触了胚胎，通过这种方式使针尖断裂，可以看到有小液滴渗出，这将被注入胚胎中。因此，这里进行注射，然后将针头抽出。每次注射完一个胚胎后，我都会检查针尖是否有一小滴液体渗出。正如您所见，我需要为每个胚胎重新调整位置，以确保达到最佳角度。现在这个胚胎出现了渗漏。如您所见，当我第二次将样品注入油中时，气泡变得非常大，因此我需要重新调整显微注射器的压力。现在显微注射已经完成，我们将把胚胎从显微镜下转移到已加入等渗缓冲液的培养皿中。我会擦去盖玻片上的油，并将其切成小片，放入培养皿中。现在我们将它们留在这里，直至当天结束，并保持室温。然后将其转移至昆虫培养室。今天我向大家演示了如何注射史蒂文森氏菌（Steven side），以制备瞬时转基因蚊子。现在我们只需等待幼虫全部孵化。待其发育至成虫后，它们将进行交配。此后，无论它们是否为重组个体，我们都需等待三周才能开始筛选。

injection-an-stephensi-embryos-to-generate-malaria-resistant

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

注射的。 stephensi胚胎生成抗药性疟疾的蚊子

反向遗传学方法已被证明在确定蚊子对媒介传播病原体抗性相关基因方面极为有效。本视频协议展示了James实验室采用的一种将dsRNA注射到携带登革热病毒的埃及伊蚊雌蚊中的方法。视频中演示了注射针头的校准、注射装置的操作，以及将dsRNA注入蚊子胸部的技术。...

将dsRNA注射入雌性埃及伊蚊成蚊

在本视频中，Nijole Jasinskiene 演示了用于创制转基因埃及伊蚊（Aedes...

埃及伊蚊胚胎显微注射获得转基因蚊子

在这次访谈中，George Dimopoulos...

构建抗疟疾与登革热的改良蚊子：鉴定冈比亚按蚊与埃及伊蚊中赋予抗性的基因

通过将两种基因型不同的寄生虫喂给蚊子，可实现啮齿类疟原虫的遗传杂交。在允许蚊子叮咬感染小鼠后，从小鼠血液中分离并克隆重组子代。本视频展示了如何对Plasmodium...

啮齿类疟原虫遗传杂交实验方案

在本视频中，我们通过显微注射展示了在Anopheles胚胎中利用phiC31介导的位点特异性外源基因整合技术。该方法有助于将目的基因导入宿主系统，用于科研与工业应用。...

phiC31整合酶介导的定点转基因整合：一种用于将转基因特异性整合至基因组位点的显微注射技术 按蚊属 载体

在本视频中，我们通过胚胎显微注射技术，将基因驱动载体导入冈比亚按蚊（Anopheles...

蚊虫胚胎显微注射：一种将外源DNA递送至胚胎卵黄的技术 Anopheles gambiae 生成生殖系突变

CRISPR/Cas9 越来越多地被用于在非模式生物中鉴定基因功能。本实验方案描述了如何从制备显微注射混合物、获取并注射蚊子胚胎，到饲养、杂交和筛选注射后的蚊子及其后代以获得目标突变，从而建立致倦库蚊（Culex...

使用 CRISPR/Cas9 技术制备并注射 Culex 蚊胚胎以产生无效突变

该方案描述了如何在基因组中实现定点修饰 按蚊属 疟疾蚊子使用 φC31 系统。所描述的修饰包括基因组中转基因盒的整合与置换...

定点 φC31介导的整合与盒式交换 按蚊属 疟疾的传播媒介

显微注射技术对于将外源基因导入蚊子基因组至关重要。本方案介绍了James实验室用于向Anopheles...

Anopheles gambiae 胚胎的显微注射方法

疟疾通过子孢子阶段的接种传播 疟原虫 通过感染的蚊子传播。转基因 疟原虫 使我们能够更深入地理解疟疾的生物学特性，并直接推动了疟疾疫苗的研发工作。在此，我们描述了一种简化的转基因制备方法 疟原虫伯氏疟原虫...

生成基因修饰的Plasmodium berghei子孢子

本文介绍了一种利用CRISPR-Cas9技术通过胚胎显微注射对蚊子A.

利用 CRISPR-Cas9 对埃及伊蚊 Aedes aegypti 进行基因组编辑

学习在Anopheles stephensi蚊子胚胎中进行显微注射以培育抗疟疾转基因蚊子的技术。该方法通过将外源基因注入胚胎，使蚊子对疟原虫产生抗性，为亚洲地区疟疾防控提供新策略。

显微注射斯氏按蚊胚胎以培育抗疟疾蚊子

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