荧光银染:一种在聚丙烯酰胺凝胶中可视化总蛋白的技术

聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质的荧光银染色使用荧光探针来检测和定量蛋白质。

从含有蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶开始，通过电泳分离成条带。浸泡在乙醇和乙酸的固定混合物中，通过使蛋白质变性来防止条带扩散。

清洗凝胶以去除残留的乙酸和乙醇。将凝胶浸入硝酸银染色剂中。银离子与蛋白质中带负电荷的基团强结合。

黑暗中孵化。用超纯水冲洗凝胶以去除未结合的银离子络合物。

将凝胶浸入含有多组分荧光探针 - TPE-4TA 的显影溶液中。该阴离子探针靶向与蛋白质结合的银离子，形成不溶性聚集体，激活探针的荧光特性，从而发出荧光。

由于荧光激活依赖于聚集，因此未结合的探针不会发出任何信号，从而能够在减少背景发射的情况下进行总蛋白染色。

凝胶在黑暗中轻轻搅拌孵育，确保完全荧光发展。将凝胶转移到脱色缓冲液中以去除未结合的探针。最后，对凝胶进行成像以获得波段信号强度。根据标准蛋白质曲线绘制荧光信号强度图，以计算样品中蛋白质的总量。

电泳后，将凝胶浸入轨道振荡器上含有乙醇和乙酸的100毫升溶液中，在室温下孵育两次，每次30分钟，同时以50RPM摇动。接下来，在干净的容器中用超纯水清洗凝胶 3 次，每次清洗持续 10 分钟。

首先，将0.01克硝酸银溶解在10毫升超纯水中，制备浓度为0.1%的储备液。将100微升该储备液加入100毫升超纯水中，制成硝酸银工作溶液。在通风橱中，将凝胶浸入密封玻璃室中的 100 毫升硝酸银工作溶液中。

渍过程中使用铝箔保护凝胶免受光照，并在轨道振荡器上以 50 RPM 摇动的同时孵育 1 小时。之后，在干净的容器中用超纯水清洗凝胶两次，每次清洗使用约 100 毫升水，持续 60 秒。

银浸渍步骤后使用超纯水清洁凝胶，以尽量减少背景染色。

首先，将 50 毫升超纯水加入 3 毫克 TPE-4TA 染料中。对溶液进行超声处理 3 分钟，并在每次超声处理之间加入 5 微升 1 摩尔氢氧化钠溶液，以帮助溶解染料，通常最多三次。然后，在365纳米紫外灯下检查溶液的荧光，确保染料完全溶解。只有弱或非发射溶液表示完全溶解。

要制备荧光显影溶液，请将 10 毫升 TPE-4TA 储备液加入 90 毫升超纯水中。使用 pH 计检查溶液的 pH 值。如果 pH 值超出范围，则使用稀释的氢氧化钠溶液或乙酸将溶液调节至 7 到 9 之间的 pH 值。

接下来，将凝胶转移到装有 100 毫升荧光显影溶液的清洁且可密封的容器中，并确保凝胶完全浸没。密封容器，并盖上盖子以避光。在轨道摇床上以 50 RPM 和室温摇动容器过夜。

凝胶转移到干净的容器中，并在 100 毫升 10% 乙醇中脱污 30 分钟。然后，用超纯水冲洗凝胶 5 分钟。凝胶可以在台式透射照明器上可视化，或在凝胶记录机上以 365 纳米通道或 302 纳米通道进行成像。