小分子结合蛋白的鉴定在天然细胞环境由活细胞光亲和标记

该程序的总体目标是通过使用光亲和探针鉴定小分子的结合蛋白，该探针可以与活细胞中的靶标结合，从而允许随后分离和鉴定靶标。该方法可用于阐明药物或其他小分子的分子作用机制。该技术的主要优点是靶蛋白的结合和共价标记发生在天然细胞环境中，消除了细胞裂解时破坏天然蛋白质结构和结合条件的风险。

通过为所需样品数量准备无菌 6 cm 细胞培养皿来开始此程序。通常，每个处理条件使用一皿细胞。为该演示准备三个细胞培养皿，仅用 DMSO 阴性对照，标记 D，仅探针处理，标记 P，和探针加竞争对手，标记 C.To 每个培养皿中，在 4 毫升培养基中加入 350 万个 HEK 293 T 细胞。

将细胞孵育过夜。在处理细胞之前，将所需的药物预分装到 1.5 毫升微量离心管中。对于竞争对手的预处理，向两根试管中的每根试管中加入 4 微升 DMSO，在一根试管中加入 4 微升 10 毫摩尔的竞争者。

对于探针处理，将 16 微升 DMSO 添加到一根管中，并将 16 微升 15 微摩尔光亲和探针添加到两管中。将细胞培养皿放入细胞培养罩中，以添加预先分装的药物。从竞争处理皿中吸出 1 毫升培养基，将其转移到包含预先等分的竞争者的微量离心管中，然后将药物重悬于培养基中。

将培养基和药物混合物轻轻滴加回培养皿中。以相同的方式，将 DMSO 添加到阴性对照皿和探针皿中。将培养皿放回培养箱中 30 分钟。

30 分钟后，将菜肴放回培养罩并调暗灯光。将预先等分的 DMSO 添加到阴性对照培养皿中，并将探针添加到探针和竞争培养皿中。将培养皿放回培养箱中 1 小时。

一小时后，将盘子放在冰上。用 5 毫升冰冷的 PBS 轻轻洗涤每个培养皿中的细胞，以去除多余的探针。用 4 毫升冰冷的 PBS 重新覆盖细胞。

将一皿细胞放在冰袋顶部的紫外灯下 3 厘米处，以尽量减少灯管的热量，然后照射 3 分钟。取出盘子，放在冰上。以这种方式照射所有样品。

照射所有样品后，从细胞中吸出 PBS，并向每个培养皿中加入 200 微升含蛋白酶抑制剂的冰冷 PBS。使用橡胶刮刀将细胞从培养皿中取出，并转移到冰上预先标记的微量离心管中。向每个样品中加入 SDS 至终浓度为 0.4%通过对悬浮液进行 10 次脉冲超声处理，在冰上孵育 1 分钟，然后再超声处理 10 次脉冲来裂解细胞。

将样品放在设置为 95 摄氏度的加热块上煮沸 5 分钟，以完成细胞裂解并使所有蛋白质变性。如文本方案所述，在测量每个样品中的蛋白质浓度后，根据需要添加 PBS PH 8.5 加 0.4%SDS，将蛋白质浓度标准化为 2.5 毫克/毫升。要开始此程序，请将上一段制备的每种细胞裂解物转移 40 μL 到新的微量离心管中。

按此顺序添加以下试剂：0.2 μL 叠氮化面粉、0.58 μL TCEP 和 3.38 μL TBTA。涡旋混合。加入 1.14 μL 硫酸铜五水合物开始反应。

短暂涡旋并在室温下避光孵育 30 分钟。加入 50 μL 2X SDS 样品缓冲液以淬灭反应。在 SDS-PAGE 凝胶上运行样品，当染料前沿到达凝胶末端时，继续运行凝胶 5 分钟，以确保所有多余的未反应面粉叠氮化物已完全离开凝胶。

洗去所有多余的面粉叠氮化物后，将凝胶放在玻璃板上，并根据制造商的说明使用荧光凝胶扫描仪扫描凝胶。对于生物素标签的附着，在蛋白质标准化后使用最大量的细胞裂解物，以使所有样品具有相同的体积。通过将每个样品添加到新试管中来预清除裂解物，该试管含有 50 μL 预洗的高容量链霉亲和素琼脂糖珠。

在 4 摄氏度下旋转孵育 1 小时。通过离心使珠子沉淀。将上清液除去到冰上的新微量离心管中，并丢弃珠子。

每 500 μL 裂解物添加以下试剂：1.38 μL 生物素叠氮化物、5.5 μL TCEP 和 32.5 μL TBTA。涡旋混合。每 500 微升裂解物加入 11 微升五水合硫酸铜，并短暂涡旋。

在室温下孵育 30 分钟。加入 4 体积的丙酮样品，冷却至 20 °C，涡旋样品，并在 80 °C 下孵育过夜，以完全沉淀蛋白质并去除未反应的生物素叠氮化物。第二天，将样品在 4 摄氏度下以 17， 000 x g 离心 15 分钟，以沉淀出的蛋白质。

完全吸出上清液，向每个样品中加入 150 微升 PBS PH 7.4 和 1%SDS，并通过超声处理重新溶解蛋白质。向每个样品中加入 600 μL PBS，将 SDS 浓度稀释至 0.2%，然后将样品加入含有 30 μL 预洗高容量链霉亲和素琼脂糖珠的新试管中。在 4 摄氏度下旋转孵育 1 小时。

1 小时后，以 1000 x g 的离心速度离心 3 分钟，使微珠沉淀。吸出并丢弃含有未结合蛋白质的上清液。向微珠中加入 1 mL 洗涤缓冲液，并在室温下旋转孵育 5 分钟。

离心，弃去上清液，再次用洗涤缓冲液洗涤。最后一次洗涤后，从磁珠中完全吸出洗涤缓冲液，并加入 30 μL 2X SDS 样品缓冲液。在 95 摄氏度的加热块中孵育 5 分钟，以从珠子中释放蛋白质。

室温下以 13000 x g 的离心力离心磁珠 1 分钟。小心地移液含有微珠上蛋白质的样品缓冲液，用于 SDS-PAGE。用荧光标签标记后蛋白质的可视化由该荧光扫描凝胶说明。

主要的特异性结合蛋白条带约为 35 道尔顿，仅存在于探针泳道中，并被过量的母体化合物竞争走掉。在生物素下拉后通过银染观察到相同的 35 道尔顿条带，随后通过质谱鉴定为膜蛋白 VDAC1。使用 VDAC1 的特异性抗体进一步验证了该蛋白质的身份。

信号存在于探针泳道中，而在竞争泳道中则减弱。包括起始组分，可确保抗体有效，并且可以在裂解物中检测到目标蛋白。pulldown 样品分子量的轻微增加是由于探针连接不当。

说明了未正确执行协议中某些步骤的后果。过量的面粉叠氮化物去除不完全，导致荧光扫描凝胶底部出现大的黑色弥散条带，而裂解物的预清除和/或珠子的洗涤不足，导致银染凝胶具有非常高的背景染色。从开始到结束，Pulldown 实验需要 2 到 3 天才能完成。

通过质谱或蛋白质印迹分离和鉴定靶蛋白后，应进行进一步的靶标特异性验证实验，以评估靶标与药物诱导表型的相关性。