通过活细胞光亲和标记在天然细胞环境中鉴定小分子结合蛋白

本实验的总体目标是利用光亲和探针鉴定小分子的结合蛋白。该探针可在活细胞内与其靶标结合，从而实现后续对靶标的分离与鉴定。该方法可用于阐明药物或其他小分子的作用分子机制。该技术的主要优势在于，靶蛋白的结合及共价标记过程均发生在天然的细胞环境中，避免了细胞裂解可能造成的天然蛋白结构和结合状态的破坏。

开始本实验前，准备若干无菌的6厘米细胞培养皿，培养皿数量根据所需样本数量而定。通常每个处理条件使用一个培养皿。本次演示将准备三个培养皿，分别为仅含DMSO的阴性对照组，标记为D；仅含探针处理组，标记为P；以及探针加竞争物处理组，标记为C。向每个培养皿中加入4毫升培养基，其中含有350万个HEK 293 T细胞。

将细胞孵育过夜。在处理细胞前，将所需药物预先分装至1.5毫升微量离心管中。进行竞争剂预处理时，向两支管中各加入4微升DMSO，向其中一支管中加入4微升10毫摩尔的竞争剂。

进行探针处理时，向一个离心管中加入16微升DMSO，向另外两个离心管中各加入16微升15微摩尔的光亲和探针。将细胞培养皿移至细胞培养超净台中，用于加入预先分装的药物。从竞争处理组的培养皿中吸出1毫升培养基，转移至含有预先分装竞争物的微量离心管中，并在培养基中重悬药物。

将培养基与药物混合液轻轻滴加回培养皿中。以同样方式，向阴性对照组培养皿和探针组培养皿中加入DMSO。将培养皿放回培养箱中孵育30分钟。

30分钟后，将培养皿移回培养操作台并调暗灯光。向阴性对照培养皿中加入预先分装的DMSO，向探针组和竞争组培养皿中加入探针。将培养皿放回培养箱中孵育1小时。

一小时后，将培养皿置于冰上。用五毫升预冷的 PBS 轻柔洗涤每个培养皿中的细胞，以去除多余的探针。再用四毫升预冷的 PBS 重新覆盖细胞。

将细胞培养皿置于冰袋上，使培养皿中心位于紫外灯下方3厘米处，以最大限度减少灯源产生的热量，照射3分钟。取出培养皿并放回冰上。以此方式照射所有样品。

所有样品照射后，吸去细胞中的 PBS，每皿加入 200 微升含蛋白酶抑制剂的预冷 PBS。用橡胶刮刀将细胞从培养皿上刮下，并转移至预先标记的预冷微量离心管中。向每个样品中加入 SDS，使其终浓度为 0.4%。通过超声处理裂解细胞：超声 10 次脉冲，冰上孵育 1 分钟，再超声 10 次脉冲。

将样品置于设定为95摄氏度的加热块上煮沸5分钟，以完成细胞裂解并使所有蛋白质变性。按照文本方案所述，测定每个样品的蛋白浓度后，通过添加PBS（pH 8.5）加0.4% SDS，将蛋白浓度归一化至2.5毫克/毫升。开始此操作时，将上一环节制备的每种细胞裂解液各40微升转移至新的微量离心管中。

按以下顺序加入试剂：0.2 µL 氟叠氮、0.58 µL TCEP 和 3.38 µL TBTA。涡旋混匀。加入 1.14 µL 五水硫酸铜以启动反应。

短暂涡旋混匀，避光、室温孵育30分钟。加入50微升2×SDS上样缓冲液以终止反应。将样品在SDS-PAGE凝胶上电泳，当染料前沿到达凝胶底部时，继续电泳5分钟，以确保所有未反应的叠氮荧光染料完全跑出凝胶。

洗去所有过量的氟化叠氮后，将凝胶置于玻璃板上，根据制造商的说明，使用荧光凝胶扫描仪扫描凝胶。如需连接生物素标签，请在蛋白质标准化后使用最大量的细胞裂解液，使所有样品体积相同。通过将每个样品加入含有50 µL预清洗的高容量链霉亲和素琼脂糖微珠的新离心管中，对裂解液进行预清除处理。

4°C 条件下旋转孵育一小时。通过离心收集珠粒。将上清液转移至冰上预冷的新微量离心管中，弃去珠粒。

每 500 微升裂解液中，加入以下试剂：1.38 微升生物素叠氮化物（biotin-azide）、5.5 微升三(2-羧乙基)膦（TCEP）和 32.5 微升三(苯并三唑-1-基)胺（TBTA）。涡旋混匀。每 500 微升裂解液中再加入 11 微升五水合硫酸铜，短暂涡旋。

室温孵育30分钟。加入4倍体积预冷至20 °C的丙酮，涡旋混匀样品，然后在80 °C下孵育过夜，以充分沉淀蛋白质并去除未反应的生物素叠氮化物。次日，在4 °C条件下以17,000 × g离心15分钟，使沉淀的蛋白质形成沉淀颗粒。

完全吸弃上清液，向每个样品中加入150 µL pH 7.4的PBS和1% SDS，并通过超声处理重新溶解蛋白质。向每个样品中加入600 µL PBS，将SDS浓度稀释至0.2%，然后将样品加入含有30 µL预清洗的高容量链霉亲和素琼脂糖微珠的新离心管中。在4°C条件下旋转孵育一小时。

孵育一小时后，于1000 × g离心3分钟，使磁珠沉淀。吸除并弃去上清液，其中含有未结合的蛋白质。向磁珠中加入1毫升洗涤缓冲液，室温下旋转孵育5分钟。

离心，弃去上清液，再次用洗涤缓冲液洗涤。最后一次洗涤后，彻底吸除磁珠中的洗涤缓冲液，加入30微升2×SDS上样缓冲液。在95摄氏度的金属浴中孵育5分钟，以使蛋白质从磁珠上释放。

在室温下以13000 × g离心 beads 一分钟。小心用移液器吸取含有蛋白质的上清液，用于SDS-PAGE。蛋白质经荧光标记后，通过荧光扫描凝胶可观察到蛋白质的成像结果。

在约35千道尔顿处出现的主要特异性结合蛋白条带仅存在于探针泳道中，并可被过量的母体化合物竞争消除。在生物素下拉实验后，通过银染也观察到相同的35千道尔顿条带，并经质谱鉴定为膜蛋白VDAC1。此外，使用针对VDAC1的特异性抗体进一步验证了该蛋白的身份。

在探针泳道中可观察到信号，而在竞争泳道中信号减弱。加入输入组分可确保抗体有效，并且目标蛋白可在裂解液中被检测到。下拉样品分子量的轻微增加是由于探针共价连接所致。

未正确执行方案中某些步骤的后果如下所示。若未能完全去除过量的叠氮化物，会导致荧光扫描凝胶底部出现大片黑色污迹；而裂解液预清除不充分或珠子洗涤不充分，则会导致银染凝胶背景染色非常高。从开始到结束，下拉实验需要两到三天才能完成。

在通过质谱或蛋白质印迹法分离并鉴定目标蛋白后，应进行进一步的靶点特异性验证实验，以评估该靶点与药物诱导表型的相关性。