使用流式细胞术检测玻连蛋白与细菌表面的结合

取含有流感嗜血杆菌野生型和突变株的流式细胞仪管，f型。

液含有封闭蛋白和玻连蛋白的缓冲液。孵化。

阻断蛋白减少了细菌表面的非特异性相互作用，而玻连蛋白分子与野生型细菌表面的蛋白 H（一种玻连蛋白结合蛋白）结合。在突变菌株中，由于缺乏蛋白 H，玻连蛋白不结合。

离心机。去除未结合的玻连蛋白和封闭蛋白。

添加含有抗玻连蛋白一抗的缓冲液，该抗体与附着在野生型细菌表面的玻连蛋白特异性结合。

接下来，引入荧光团偶联的二抗，与玻连蛋白上的一抗结合，促进玻连蛋白检测。

离心机。去除未结合的二抗。将细菌重悬于缓冲液中。

进行流式细胞术以确定玻连蛋白与细菌表面的结合。

比较野生型和突变毒株的荧光信号。野生型细菌荧光信号的转变证实了玻连蛋白与细菌表面的结合。

为了准备流式细胞术，用含有 250 纳摩尔玻连蛋白的 50 微升封闭缓冲液重悬细菌沉淀。然后，将样品在室温下孵育1小时，不要摇动。孵育后，通过以3,500 x g 离心5分钟来沉淀细菌。然后使用 PBS 和类似的离心步骤洗涤沉淀三次。

洗涤后，将 50 微升原代绵羊抗人玻连蛋白多克隆抗体加入细菌沉淀中，在 PBS/BSA 中以 1 至 100 的稀释度。将悬浮液在室温下孵育1小时。然后，用PBS洗涤细菌3次以去除未结合的抗体。

接下来，向沉淀中加入50微升含有异硫氰酸荧光素的PBS / BSA偶联驴抗绵羊多克隆抗体。在室温下避光孵育1小时。最后，经过三个洗涤步骤后，用300微升PBS重悬细菌沉淀，并通过流式细胞术进行分析。