0 次观看 • 3:05 分钟 • July 8th, 2025
取含有野生型和突变株的流式细胞仪管 流感嗜血杆菌 流感嗜血杆菌,类型 f.
用移液器吸取含有阻断蛋白和玻璃连接蛋白的缓冲液。孵育。
封闭蛋白可减少细菌表面的非特异性相互作用,而玻璃粘连蛋白分子则结合于野生型细菌表面的玻璃粘连蛋白结合蛋白H上。在突变菌株中,由于缺乏蛋白H,玻璃粘连蛋白无法结合。
离心。去除未结合的玻璃连接蛋白和封闭蛋白。
加入含有抗连蛋白一抗的缓冲液,该抗体可特异性结合于野生型细菌表面附着的连蛋白。
接下来,加入荧光标记的二抗,该抗体可结合在连结素上的初代抗体,从而促进连结素的检测。
离心。去除未结合的二抗。用缓冲液重悬细菌。
通过流式细胞术检测细菌表面的玻璃连接蛋白结合情况。
比较野生型和突变株的荧光信号。野生型细菌中荧光信号的偏移表明玻连蛋白与细菌表面结合。
为进行流式细胞术,用含有250纳摩尔纤连蛋白的50微升封闭缓冲液重悬细菌沉淀。然后在室温下静置孵育1小时,不振荡。孵育结束后,在3,500 × g 离心5分钟,使细菌沉淀。随后使用PBS洗涤沉淀,重复三次,每次均采用相同的离心步骤。
洗涤后,将50微升以PBS/BSA按1:100稀释的一抗——羊抗人连环蛋白多克隆抗体加入细菌沉淀中,在室温下孵育1小时。随后用PBS洗涤细菌三次,以去除未结合的抗体。
接下来,向沉淀中加入50 µL含异硫氰酸荧光素标记的驴抗羊多克隆抗体的PBS/BSA溶液,在室温避光孵育1小时。最后,经过三次洗涤步骤后,用300 µL PBS重悬细菌沉淀,并进行流式细胞术分析。
本研究利用流式细胞术检测玻璃粘连蛋白与野生型及突变型流感嗜血杆菌f型菌株的结合情况。野生型菌株中存在蛋白H,可介导玻璃粘连蛋白的结合,而突变型菌株则缺乏这种相互作用。
通过流式细胞术对玻璃粘连蛋白与细菌表面结合进行定量检测,能够在分子水平上精确研究宿主与病原体之间的相互作用。该方法有助于抗感染药物研发项目中早期靶点验证和作用机制的风险评估。对蛋白质-配体相互作用的可靠测量,可为候选分子筛选及转化医学研究提供可靠的预测依据。
这种基于流式细胞术的检测方法可融入抗感染药物研发从发现到临床前研究的连续流程中。
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最后更新:29 八月 2026