对于外小泡的使用流式细胞仪分析技术

该程序的总体目标是通过两种不同的方法分离和分析血液中的细胞外囊泡循环。对于单个细胞外囊泡检测方法。首先从血液样本中分离出血小板差血浆或 PPP。

然后用目标荧光染料偶联抗体对 PPP 进行染色。对于基于磁珠的检测方法，将细胞外囊泡与磁珠孵育，然后用相关的荧光染料偶联抗体对磁珠结合的囊泡进行染色。最终，可以通过流式细胞术分析样品来确定循环细胞外囊泡含量。

与电子显微镜或磁珠分离等现有方法相比，该技术的主要优点是速度更快，并且可以评估总细胞外 escal 群体，而不是局限于特定的亚群。通常，刚接触这种方法的个体会很挣扎，因为这种方法的成功需要严格遵守所证明的作和细胞仪设置参数 为了产生具有最小日常变化的高质量数据，首先离心全血样品以将血浆与 Buffy 外壳和红细胞分离。接下来，将 1.2 毫升血浆上清液等分试样转移到 1.5 毫升离心管中，注意不要干扰含有血沉棕黄层和红细胞的底层，然后再次离心上清液以去除任何血小板和大细胞碎片。

在离心结束时，小心地将除最后 200 微升 PPP 样品外的所有样品转移到新试管中，注意不要干扰沉淀。然后将血浆上下混合数次，并将每个样品的 320 微升转移到 96 孔板的顶行。为了对样品进行染色，将三个面板的目标抗体混合到单独的零点 22 微米离心过滤管中，然后使用固定角度的单速离心机

当所有抗体都通过过滤器后，如图所示，向 96 孔板的每个孔中加入适量的混合物。接下来，使用多通道移液器混合 PPP 样品，然后将每个样品的 100 微升转移到第二行的抗体中。然后再次混合样品，更换吸头，并根据需要将 100 μL 样品转移到接下来的两排抗体中。

对于实验。将板在 4 摄氏度下孵育 30 分钟，每孔 220 微升 PBS，在生物安全柜内排 6 到 8 排。然后使用宽度可调的多通道移液器，将每个孔的内容物转移到相应的离心过滤管中，而无需更换吸头。

使用来自其中一个洗涤行的 200 微升 PBS 冲洗刚刚从中取出样品的孔。然后将冲洗液转移到先前添加 PPP 样品的相同过滤器中，并关闭离心过滤器。将所有染色的 PPP 样品连同冲洗液一起转移后，在固定转子离心机中

旋转后，确保过滤器顶部没有液体残留。然后将过滤器的顶部重悬于 300 μL PBS 中，并将重悬的内容物转移到预先标记的试管中，以便立即进行流式细胞分析。使用离心过滤器清洗染色样品，可增强背景标志物信号和阳性标志物信号之间的分离。

然而，需要注意的是，一些较小的细胞外囊泡（包括外泌体）可能会通过过滤器的门丢失。要分析样品，首先，将前向和侧向散射电压参数设置为对数刻度，并为每个参数选择细胞仪允许的最低阈值。然后，在运行零点 22 微米的试管时，过滤后的 PBS 将这些电压调整到排除大部分背景噪声的最高值。接下来，运行一根包含一微米及更小珠子混合物的试管，并在正向并排散点图中围绕珠子群绘制一个门，以捕获一微米珠子下的所有事件。

现在将流式细胞仪流速设置为较低，并使用磁珠将流式细胞仪上的流速刻度盘调整到所需的事件速率。然后，使用一管在 PBS 中稀释的彩虹荧光粒子获取 5， 000 个事件，记录前向散射、侧向散射和每个颜色通道的值的平均强度。设置完所有参数后，将每个样品运行一到两分钟。完成每个试管的第一次读数后，将 20 微升 10% MP 40 混合到每个样品中，并在相同的时间内重新读取试管，以减去在裂解样品中检测到的阳性事件在相同的时间内。

为了通过基于珠子的捕获来检测细胞外囊泡，首先用 RPMI 培养基洗涤未包被的 6 微米聚苯乙烯珠子两次，然后用 2 毫升相同的 Resus 洗涤。接下来，将 6， 000 个珠子添加到阴性对照管的每个新传真管中，以 400 微升的培养基添加到所有其他试管中，以 200 微升的 PPP 或超速离心细胞外囊泡，以及 200 微升的培养基。将每管中的最终体积调整至 400 微升。

使用更多媒体。将试管在 4 摄氏度下在摇床上孵育过夜。第二天早上，用 2 毫升培养基清洗珠子。

吸出上清液，并在 4 摄氏度的摇床上用 400 μL 5% 牛血清白蛋白阻断任何非特异性结合 3 小时。三小时后，在另外 2 毫升培养基中洗涤微珠，并将沉淀重悬于 100 微升新鲜培养基中。现在过滤抗体，向每个试管中加入适当体积的过滤抗体混合物，然后在 4 摄氏度下 30 分钟后，在另外 2 毫升培养基中洗涤微珠。

这次将沉淀重悬于 400 微升培养基中，并立即通过流式细胞术分析样品，将前向内部散射参数调整到流式细胞仪允许的最低阈值，如刚才所示。最后，对单重态珠群进行设门，每个样品获取 2000 个事件。基于单个和基于微珠的检测方法都可用于检测 PPP 样品中细胞外囊泡的存在，如以下点图所示。对于单个检测分析，裂解对照用于为相应的未列出样品设置门。

大多数事件应位于细胞外囊泡门内。例如，在此图中，这些 bi 参数图显示了对标志物 CD 1 0 8 A 和 CD 2 35 A 的检测，这是已知在细胞上共存的两种红细胞标志物。正如预期的那样，细胞外囊泡上超过一半的阳性事件对两种标志物都是阳性的，而在这些参数图中，使用基于磁珠的检测方法，已知不共存于细胞上的两个标志物的细胞外囊泡表达表现出不同的独立阳性群体。

阳性和阴性群体之间不存在分离，事件出现在双阳性象限中，即使它们通常不在同一细胞类型上发现，因为两种类型的细胞外囊泡都会与单个珠子结合。因此，最好使用与阴性对照数据重叠的直方图来分析来自该方法的数据，与对照相比，一旦掌握，在微珠状样品中观察到标记物表达的明显变化。该技术可用于在三到四个小时内使用单个检测方法分析带有 3 组抗体的 12 个血液样本，如果作得当，则通过微珠法在一天半内分析。

在尝试此程序时，重要的是要记住每个样品的处理保持一致，确保在每次实验开始时正确调整细胞仪流速和荧光强度，以匹配前一天的实验设置，尤其是在多天运行多个样品时。