使用流式细胞术分析细胞外囊泡的技术

本实验的总体目标是通过两种不同方法分离并分析血液中外泌体的循环。针对单个外泌体的检测方法，首先从血液样本中分离出血小板贫浆（platelet poor plasma, PPP）。

随后，使用目标荧光染料偶联抗体对血小板贫浆（PPP）进行染色。对于基于微球的检测方法，先将细胞外囊泡与微球孵育，然后使用相应的荧光染料偶联抗体对结合在微球上的囊泡进行染色。最终，通过流式细胞术分析样本，即可确定循环中细胞外囊泡的含量。

与电子显微镜或磁珠分离等现有方法相比，该技术的主要优势在于速度更快，并且能够评估完整的细胞外囊泡群体，而不局限于特定的亚群。通常，初次接触该方法的研究人员可能会遇到困难，因为该方法的成功依赖于严格遵循所展示的操作步骤和流式细胞仪的设置参数，以获得高质量的数据并尽量减少日间差异。首先，离心全血样本，以分离血浆、白膜层和红细胞。接着，小心吸取1.2毫升血浆上清液，转移至1.5毫升离心管中，注意避免扰动含有白膜层和红细胞的底层沉淀。然后再次离心上清液，以去除任何血小板和较大的细胞碎片。

离心结束后，小心地将PPP样本中除最后200微升以外的全部液体转移至新管中，注意不要扰动沉淀物。随后将血浆上下混匀数次，并将每份样本中的320微升转移至96孔板的最上一排。为染色样本，将每个三联检测面板中感兴趣的抗体分别加入单独的0.22微米离心滤管中，使用固定角度转子的单速离心机离心收集抗体。

当所有抗体完全通过滤膜后，按照图中所示，将适量混合液加入96孔板的每个孔中。接着，使用多通道移液器混匀PPP样本，然后将每份样本各100 µL转移至第二行的抗体中。再次混匀样本，更换枪头后，根据需要将每份样本各100 µL转移至接下来的两行抗体孔中。

进行实验。在生物安全柜内，向第6至第8行的每个孔中加入220微升PBS，30分钟后将培养板置于4摄氏度下孵育。然后使用可调间距的多通道移液器，将每孔中的溶液转移至对应的离心过滤管中，移液过程中不更换枪头。

使用来自其中一个洗涤行的 200 微升 PBS，冲洗刚刚移除样本的孔。然后将洗涤液转移至之前已加入 PPP 样本的相同滤膜中，并关闭离心滤器。待所有染色的 PPP 样本及其洗涤液全部转移后，在固定转子离心机中离心样品。

离心后，确保滤膜表面无残留液体。随后将滤膜顶部用 300 µL PBS 重悬，并将重悬液转移至预先标记的试管中，立即进行流式细胞术分析。使用离心滤膜洗涤染色样本可增强背景信号与阳性标记信号之间的分离效果。

需要注意的是，一些较小的细胞外囊泡（包括外泌体）可能会穿过滤膜的孔径而丢失。为分析样品，首先将前向散射和侧向散射的电压参数设置为对数刻度，并为每个参数选择流式细胞仪允许的最低阈值。然后，在运行含有0.22微米过滤PBS的样品管时，将这些电压调整至能够排除大部分背景噪声的最高值。接下来，运行含有混合微球（1微米及更小）的样品管，并在前向散射与侧向散射图中围绕微球群体绘制门控，以捕获所有小于1微米微球的事件。

现在将流式细胞仪的流速调至低速，并使用微珠调整流式细胞仪上的流速旋钮至所需的事件速率。然后使用一管用 PBS 稀释的彩虹荧光微粒，采集 5,000 个事件，记录前向散射、侧向散射以及每个荧光通道信号的平均强度值。当所有参数设置完成后，每份样本精确运行一至两分钟。在每管样本完成第一次读数后，向每管中加入 20 微升 10% MP-40，混匀，再以相同时间重新读取各管样本，以便在相同时间内扣除溶血样本中检测到的阳性事件。

通过基于微珠的捕获方法检测细胞外囊泡时，首先用 RPMI 培养基清洗未包被的六微米聚苯乙烯微珠两次，随后将其重悬于两毫升相同培养基中。接着，将 6,000 个微珠分装至各新的离心管中：阴性对照管中加入 400 微升培养基，其余各管根据需要加入 200 微升 PPP 或经超速离心获得的细胞外囊泡，以及 200 微升培养基。最后将每管的终体积调整至 400 微升。

加入更多培养基。将试管置于摇床上，在4°C下孵育过夜。次日早晨，用两毫升培养基洗涤磁珠。

吸去上清液，加入400微升5%牛血清白蛋白，以封闭非特异性结合，在4摄氏度下置于摇床上孵育3小时。3小时后，用2毫升培养基洗涤磁珠，并将沉淀重悬于100微升新鲜培养基中。随后过滤抗体，将适量过滤后的抗体混合液加入各管中，4摄氏度孵育30分钟后，再用2毫升培养基洗涤磁珠。

此时，将沉淀重悬于400微升培养基中，并立即通过流式细胞术分析样品，将前向散射参数调整至流式细胞仪允许的最低阈值，如前所示。最后，圈选单细胞微珠群体，并每样本采集2000个事件。个体检测法和微珠介导的检测法均可用于检测PPP样品中外泌体的存在，如这些散点图所示。在个体检测实验中，裂解对照用于设定相应未裂解样品的圈门范围。

大多数事件应位于细胞外囊泡门控范围内。例如，在本图中，这些双参数图显示了标志物 CD108A 和 CD235A 的检测结果，这两种标志物是已知共存于细胞上的红细胞标志物。正如预期，超过一半的细胞外囊泡阳性事件同时对这两种标志物呈阳性；而在这些双参数图中，使用基于微球的检测方法，对两种已知不在细胞上共存的标志物的细胞外囊泡表达则显示出明显分离的阳性群体。

阳性与阴性群体之间无明显分离，事件出现在双阳性象限中，即使由于两种类型的细胞外囊泡均会结合至同一微球上，这些事件通常不会出现在同一种细胞类型上。因此，该方法的数据最好通过叠加阴性对照数据的直方图进行分析，与对照组相比，包被微球的样本中可观察到标记物表达的明显偏移。一旦掌握，该技术可用于分析12个血液样本，使用三种抗体组合，采用单个检测方法可在三到四小时内完成，而采用微球法若操作得当，则可在一天半内完成。

在进行该实验操作时，重要的是要始终如一地处理每个样本，并确保在每次实验开始时，正确调整流式细胞仪的流速和荧光强度，以与前一日的实验条件保持一致，尤其是在连续多日处理多个样本时。