Name: 对于外小泡的使用流式细胞仪分析技术 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: 学习使用流式细胞仪分析外小泡的两种方法：单个检测法和微珠捕获法。本技术可从血液样本中分离并定量分析循环外小泡，适用于神经科学和细胞生物学研究。

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作者感谢血液系统研究所的 Dale Hirschkorn 在流式细胞仪仪器设置方面提供的帮助。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）基金项目 HL095470 和 U01 HL072268 以及美国国防部（DoD）合同 W81XWH-10-1-0023 和 W81XWH-2-0028 资助。

注意：以下实验方案均按照所有机构、国家和国际有关人类福祉的指南进行。所有人体样本均在经机构审查委员会（IRB）批准的方案下进行检测，并获得受试者的知情同意。
1. 方法 A：单个检测法
1.1）血液样本处理/细胞外囊泡（EVs）的分离
<ol>
	<li>将供体/患者的血液抽入两支含有1.5 ml ACD溶液A或其他合适抗凝剂的10 ml玻璃管中，并立即（最迟不超过30分钟）采用以下两步差速离心法进行处理。 
	注：本方案从总共约17 ml血液中可获得约10 ml的血小板贫乏血浆（PPP）。若需要更多或更少的PPP，可相应调整采集的血液管数。</li>
	<li>在&#160;RT&#160;条件下，以1,500 × g离心10分钟，使血浆与白膜层及红细胞分离。小心吸取血浆上清液，以1.2 ml等分量转移至1.5 ml离心管中，注意勿扰动含有白膜层和红细胞的底层沉淀。</li>
	<li>在RT条件下以13,000 × g离心10分钟，以去除血小板及大细胞碎片。小心转移PPP，保留200 µl上清液以避免扰动沉淀物，并将PPP转移至新管中。</li>
	<li>此时可立即使用PPP进行分析，或将其以1.0 ml等分量转移至新的1.5 ml离心管中，在-80 °C保存长达两年，以备后续分析（参见图1A概览）。</li>
	<li>若功能实验需要纯化的EVs，则将6 ml PPP转移至超速离心管中，并加入28 ml经0.2 µm滤膜过滤的磷酸盐缓冲液（PBS）。使用配备摆动转子的超速离心机，在RT条件下以100,000 × g离心60分钟。吸除上清液，将EV沉淀重悬于1.5 ml培养基中。 
	注：为获得最高可重复性，不同供体的血液样本应尽可能保持处理条件一致。EV分离方法的任何差异均可能显著影响所检测EV的数量和类型。</li>
</ol>
1.2）分析样品的制备
注意：从这一步开始，以下步骤说明了一种高通量方案，用于对3个检测组中的12个样本进行14种标志物的分析。然而，此处也可使用其他抗体组合；通过将建议的标志物替换为感兴趣的标志物，该方案可调整用于研究其他细胞外囊泡（EV）群体。
<ol>
	<li>从冷冻柜（若保存于 -80 °C）中取出 12 个样品，在 37 °C 下解冻。</li>
	<li>用移液器反复吹打数次以混匀。从每个样品中取出 320 µl，加入 96 孔板的最上一排孔中。 
	注意：在整个检测过程中，尤其是同时处理多个样品时，使用可调间距的多通道移液器对此步骤及许多其他步骤都非常有帮助。</li>
</ol>
1.3）EV 样品染色
<ol>
	<li>染色前，应过滤所有抗体（Abs），以去除可能引起阳性信号的聚集体。
	<ol>
		<li>将用于各3个检测面板的抗体分别加入多个0.22 µm离心滤管中，使用固定角度单速离心机在室温下以约750 × g离心2分钟，或直至所有抗体混合液完全通过滤膜，且滤膜表面无残留抗体液体。抗体混合液可于冰箱中保存最多两周，每次使用前需重新过滤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向第2行的每个孔中加入适量的过滤后抗体混合液（例如，I组样品每种抗体使用2 µl，因此每孔共加入12 µl过滤后的抗体混合液至第2行）。参考 图1B 有关建议的孔板布局示意图，请参见相关说明。若需运行更多检测面板，请对下方的行重复上述加样操作（此处，向第3行每孔加入8 µl的Panel II混合液，向第4行每孔加入11 µl的Panel III混合液；具体面板信息请参见材料列表）。</li>
	<li>使用多通道移液器，将第1行的PPP样本上下吹打混匀，然后从第1行各孔中转移100 µl至第2行各孔。上下吹打混匀。更换吸头后重复操作，将100 µl样本从第1行转移至第3行和第4行。4 °C孵育30分钟。</li>
</ol>
1.4）洗涤膜小泡样本
<ol>
	<li>从 4 °C 取出 96 孔板，转移至生物安全柜中。使用多通道移液器，向第 6–8 行各孔加入 220 µl PBS（用于冲洗和洗涤含有染色后 PPP 的孔）。</li>
	<li>将每个孔中的内容物使用可调宽度多通道移液器转移至预先标记的离心过滤管中（对于12个样本，每样本3个抗体panel，共需12 × 3 = 36根过滤管）。使用相同的吸头，从洗涤孔行中移除200 µl PBS，并加入刚刚移除PPP的对应孔中。</li>
	<li>上下混匀以冲洗小孔，并将冲洗液转移至先前已加入PPP的相同滤器中。关闭离心滤器的盖子。更换吸头。</li>
	<li>用剩余的染色样品重复此过程，直至所有染色的PPP样品及其冲洗液均转移至离心滤器中。</li>
	<li>将离心过滤器转移至固定角转子离心机中，在室温下以850 × g离心3分钟。 
	注意：确保滤膜顶部无残留液体。离心后，滤膜表面应呈“干燥”状态，无可见的液体层残留。尽管可能性较低，某些富血小板血浆（PPP）样本可能需要更长的离心时间才能有效通过滤膜。</li>
	<li>取出离心过滤管，放回生物安全柜中。使用多通道移液器，将滤膜顶部用 300 µl PBS 重悬。将重悬后的液体转移至预先标记好的管中，立即进行流式细胞术（FCM）分析。 
	注意：为避免样本间的差异，必须保持移液器活塞按压的力度和次数在各样本间一致。理想情况下，应使用已编程设定为上下吸取特定体积液体的电子移液器来完成此操作（例如，280 µl）精确的次数（例如，每个样本重复8次。</li>
</ol>
1.5）细胞仪设置
<ol>
	<li>打开流式细胞术软件。在实验设置之前，使用仪器校准微球对仪器进行日常校准和设置（遵循制造商的说明）。</li>
	<li>如果EV样本已使用多种抗体进行染色，且需同时检测多种荧光染料，则按如下方法计算补偿值：
	<ol>
		<li>向预先标记的试管（每种荧光染料偶联抗体各一管）中加入2滴补偿微珠，并加入推荐量的抗体。另取一管加入2滴阴性补偿微珠，作为未染色补偿对照。</li>
		<li>4 °C孵育30分钟，用PBS洗涤后重悬于400 µl PBS中。</li>
		<li>使用仪器配套的流式细胞仪软件，运行每个补偿管，并调节荧光电压，使每个峰位于约10处4 在5个对数级的量表上进行分析。确保每种荧光染料在其对应的荧光通道中的荧光峰强度最高（最亮），并与所有其他通道相比无溢出；如有必要，再次调整荧光参数的电压。分别运行每个单独染色的补偿管，并每管至少采集5,000个事件。</li>
		<li>选择“实验”选项卡，然后选择“补偿”，再选择“计算补偿”以将补偿值应用于所有样本。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）电压参数设置为对数尺度，并为每个参数选择流式细胞仪允许的最低阈值（FSC=200，SSC=200）。</li>
	<li>在运行0.22 µm滤膜过滤的PBS管时，调节FSC &amp;#38; SSC 电压调至可排除大部分背景噪声的最高值（即，略低于事件频率超过每秒5个事件的电压阈值。</li>
	<li>接下来，运行含有0.2 µm – 1.0 µm微球的样本管，必要时用PBS稀释。在FCS与SSC散点图中，围绕微球群体绘制门控，以捕获0.2 µm至1.0 µm之间的所有事件。或者，在SSC-H直方图中，绘制门控以包含所有小于1.0 µm微球的事件。</li>
	<li>将流式细胞仪的流速设置为“Lo”（约8-12 µl/min）。使用微球管（或其他含有已知浓度微球的试管），调节流式细胞仪上的流速旋钮，直至事件速率达到约200个事件/秒。所有样本管均需在相同的流速下检测，并在后续实验中使用相同浓度的微球，以确保不同运行之间的流速保持一致。</li>
	<li>用PBS稀释的彩虹荧光微球进行上样。采集5,000个事件。记录FSC、SSC及各荧光通道的平均荧光强度值。利用这些数值调整后续实验的电压，以确保不同实验间的荧光强度保持一致。</li>
</ol>
1.6）样品读取
<ol>
	<li>将流式细胞仪的流速设置为“Lo”（约 8-12 µl/min），每份样本运行时间精确为 1 或 2 分钟。</li>
	<li>第一次读数后，向每份样本中加入 20 µl 10% NP-40，用移液器吹打混匀，再以相同时间（1 或 2 分钟）重新读数，以便在相同时间范围内扣除裂解样本中检测到的阳性事件。 
	注意：必须使用移液器混匀样本，切勿使用涡旋振荡器。根据我们的经验，涡旋可能导致某些抗体自聚集，从而产生模拟细胞外囊泡的阳性信号。</li>
	<li>所有样本读取完成后，将全部 .fcs 文件导出至单独文件，用于后续使用流式细胞术分析软件进行数据分析。</li>
</ol>
1.7）数据分析
<ol>
	<li>打开流式细胞术分析软件。将所有 .fcs 文件导入一个新的实验文件中。</li>
	<li>打开仅含微球的管。在 FSC-A 与 SSC-A 图中，圈选大小介于 0.2 µm 和 1.0 µm 之间的所有微球。此为细胞外囊泡（EV）门控。将其拖动以应用到所有样本。</li>
	<li>使用裂解样本作为阴性对照，在所用的每个荧光通道中，于背景荧光边缘设置门控。将各荧光门控拖入对应未裂解样本的 EV 门控内。 
	注意：此时也可检查双荧光双参数图。若在双阳性象限中出现“火箭”形状（见图8），特别是当这些标志物已知位于无关细胞类型上时，可能提示存在聚集或其他模拟囊泡事件所导致的假象。</li>
	<li>针对每种荧光标志物，用未裂解样本中的事件数减去裂解样本中的事件数。可选地，将该数值除以未裂解样本 EV 门控内的总囊泡数，以获得阳性百分比值。</li>
</ol>
2. 方法 B：磁珠法
2.1）血液样本处理/细胞外囊泡（EVs）的分离
<ol>
	<li>参见方法A（第1.1节）中所述的血液处理方法。</li>
</ol>
2.2）分析样品的制备
<ol>
	<li>如需将乏血小板血浆（PPP）或超速离心获得的细胞外囊泡（EVs）进一步分离为外泌体和微囊泡，请将250 µl PPP或超速离心EVs加入0.22 μm离心过滤器中，置于固定角转子离心机内，于室温下以750 × g离心2分钟。 
	注意：确保滤膜表面无残留液体。离心后，滤膜应呈“干燥”状态，表面无可见液体层。尽管可能性较小，但某些样品可能需要稍长的离心时间，以使液体有效通过滤膜。</li>
	<li>洗涤未包被的6 µm聚苯乙烯微球（例如，阴性AbC磁珠）用RPMI培养基洗涤2次，重悬于2 ml中。每管FACS管中加入6,000个磁珠。在阴性对照管中，仅向磁珠加入400 μl RPMI培养基。在其余各管中，分别加入200 μl PPP或超速离心获得的EVs（或其组分）以及200 μl RPMI培养基。</li>
	<li>用培养基将所有离心管的终体积调整至400 μl，在摇床中于4 °C孵育过夜。</li>
	<li>次日早晨，用 2 ml 培养基洗涤磁珠，吸除上清液。</li>
	<li>在摇床上，4 °C 条件下，用含 5% 牛血清白蛋白（BSA）的培养基（400 μl）封闭 3 小时。</li>
	<li>用2 ml培养基洗涤磁珠。吸除上清后，将沉淀重悬于100 μl培养基中。</li>
</ol>
2.3）EV 样品染色
<ol>
	<li>过滤所有抗体。使用与方法A相同的抗体组合，或者根据需要创建不同的抗体组合，只要其荧光染料彼此兼容即可。</li>
	<li>将单个抗体组合中所有待使用的抗体加入一个0.22 µm的离心过滤管中。使用固定角度的单速离心机离心2分钟，或直至所有抗体混合物完全通过滤膜，且滤膜表面无残留抗体液体。</li>
	<li>向各管中加入适量的过滤后抗体混合液，在4 °C下孵育30分钟。</li>
	<li>用2 ml培养基洗涤磁珠，重悬于400 μl培养基中，并立即（或在同一天内）上流式细胞仪检测。</li>
</ol>
2.4）细胞计数仪设置与样本检测
<ol>
	<li>打开流式细胞术（FCM）软件。在实验设置之前，使用仪器校准微球按照制造商说明完成仪器的日常校准和设置。</li>
	<li>如果细胞外囊泡（EV）样本使用了多种抗体进行染色，并需同时检测多个荧光染料，请按以下步骤计算补偿值：
	<ol>
		<li>向预先标记的试管中各加入2滴补偿微球（每种荧光染料标记的抗体对应一管），并加入推荐量的相应抗体。另取一管加入2滴阴性补偿微球作为未染色补偿对照。4 °C避光孵育30分钟，用PBS洗涤一次，重悬于400 µL PBS中。</li>
		<li>使用FCM软件依次运行各补偿管，调节各荧光通道电压，使每种荧光信号的峰值位于5个数量级对数尺度上的约104位置。确保每种荧光染料在其对应通道的荧光信号强度（亮度）高于其他所有通道；如有必要，可再次调整荧光参数电压。对每根单染补偿管分别采集，每管至少获取5,000个事件。</li>
		<li>选择“Experiment”（实验）选项卡，然后选择“Compensation”（补偿），再选择“Calculate Compensation”（计算补偿），将计算出的补偿值应用于所有样本。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC）的电压参数调整为对数尺度，并将两者的阈值设为流式细胞仪允许的最低值（FSC = 200，SSC = 200）。</li>
	<li>运行样本，对单一群微球设门，采集该门内2,000个事件，并导出.fcs文件。</li>
	<li>使用FCM分析软件打开并分析.fcs文件。对单一群微球设门，计算每种荧光染料的几何平均荧光强度（MFI），并与阴性对照的MFI进行比较。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

本文介绍了两种不同的细胞外囊泡（EVs）分离、处理和分析方案，分别采用单颗粒检测法或基于微球的方法。选择最合适的方法并不总是显而易见的，需要充分了解待测样本以及感兴趣的特定亚群。此外，在选择最适宜方法时，还必须考虑用于数据采集的流式细胞仪的灵敏度。通常情况下，并不存在单一最优的实验方案，相反，联合使用多种方法所能提供的信息往往超过任何一种单独方法。理想情况下，应首先评估多种不同的分离与检测技术，从而建立一个定制化的实验流程，充分考虑特定EV亚群研究中所用流式细胞仪的实际性能。其他可选的分离技术包括超速离心、蔗糖密度梯度分离、免疫磁珠分离、色谱法和亲和纯化12，而其他检测方法则包括扫描电子显微镜、透射电子显微镜、原子力显微镜、动态光散射和蛋白质印迹（western blotting）8。通过整合不同的技术手段，本文所介绍的方法可被灵活调整，以构建最适合研究各类目标EV亚群的实验方案。
通常，使用流式细胞术（FCM）对细胞外囊泡（EV）进行单个检测在分析较大EV时效果良好，但随着EV尺寸减小，其检测灵敏度会下降。虽然单个检测在识别较大EV方面...

细胞外囊泡（EVs）是一类存在于体液中的小型膜源性囊泡，在细胞间通讯中发挥重要作用，并参与调控多种多样的生物学过程。由于EVs体积微小且缺乏明确标记物阳性的离散群体，使用流式细胞术（FCM）对其进行分析一直具有较大挑战性。尽管过去十年中EVs分析方法已取得显著改进，但仍处于持续优化阶段。遗憾的是，目前尚无一种适用于所有情况的通用方案，在选择最合适的分析方法时必须综合考虑多个因素。本文介绍了多种EVs处理技术，以及两种分别基于单颗粒检测或微球捕获策略的EVs分析方案。所述方法有助于消除商业抗体制剂中常见的抗体聚集体，提高信噪比，并以合理方式设门，最大限度减少背景荧光的干扰。第一种方案采用单颗粒检测法，特别适用于高通量临床样本的分析；第二种方案则采用基于微球的方法，用于捕获和检测较小的EVs及外泌体。
细胞外囊泡（EVs），也称为微粒，是一类存在于体液中的小型膜源性囊泡，参与细胞间的通讯，并有助于调控多种生物学过程1。通过表达多种表面标志物和/或直接转移生物活性物质，EVs能够改变受体细胞的功能，在细胞间通讯中发挥激活或抑制作用2–4。临床上，血小板来源的EVs具有显著的抗凝活性5，而其他EVs则被证实参与多种病理生理过程，从促进肿瘤转移6&#160;到抵御疾病均有所涉及7。根据其大小和生成机制的不同，EVs可进一步分为外泌体和微囊泡（MVs）等更小的细胞来源囊泡类别8。尽管目前对于细胞来源囊泡亚群的命名仍存在持续争议8,9，但通常认为外泌体是来源于晚期内体与细胞膜融合所释放的40至100 nm的小型颗粒，而MVs则是通过细胞膜出芽脱落形成的较大颗粒，大小在100至1,000 nm之间10。本文中，“EVs”这一通用术语将用于指代所有细胞释放的细胞外生物囊泡。
从全血中分离细胞外囊泡（EVs）是一个多步骤过程，许多不同的处理变量已被证明会影响EVs的内容，包括储存温度和时间11,12、所使用的抗凝剂/防腐剂13&#160;以及离心方法14。由于需要对这些变量进行标准化，国际血栓与止血学会科学与标准化委员会（ISTH SSC）已提出了关于正确血液处理和EVs分离程序的建议15,16，但研究人员在应采用的最佳方案上尚未达成共识12。然而，大多数研究者均认为，严格控制分析前变量对于获得准确且可重复的数据至关重要。
为了分析细胞外囊泡（EVs），研究人员已采用多种方法，包括透射电子显微镜17、扫描电子显微镜18,19、原子力显微镜、动态光散射20,21&#160;以及蛋白质印迹法（western blotting）22,23。尽管流式细胞术（FCM）因其高通量能力而成为许多研究人员的首选方法9,24–26&#160;，但由于EVs体积微小且缺乏明确的阳性群体，使用FCM对其进行分析一直极具挑战性27–32。与细胞分析相比，EVs的尺寸较小导致：1）每个颗粒表面抗原数量较少，因而产生的荧光信号较弱；2）染色后洗涤步骤的可行性受限，而该步骤对于降低背景荧光至关重要。研究人员普遍面临的问题包括免疫球蛋白聚集体产生的信号27,28以及抗体自身聚集所引发的干扰29。此外，当前许多实验方案所采用的长时间处理过程以及繁琐的洗涤/分离步骤33,34&#160;，需要耗费数天时间才能分析少量样本，因此难以满足高通量应用的需求。部分研究人员完全省略洗涤步骤，导致传统FCM阴性对照（如单荧光减除对照FMO和同型抗体对照）无法有效评估背景荧光水平30。
我们的实验方案针对影响EVs常规FCM分析的三个常见问题：抗体聚集体和其他非囊泡颗粒产生的信号、游离抗体难以去除，以及缺乏可辨识的阳性群体。本文所述技术有助于消除商业试剂中常见的抗体聚集体，提高信噪比，并以合理的方式设门，最大限度减少背景荧光的检测。本文介绍了两种不同的检测方法：第一种方案采用单个颗粒检测法，特别适用于高通量临床样本的分析；第二种方案则采用基于微珠的方法，用于捕获和检测较小的EVs和外泌体。

<table><tbody><tr><td>LSR II 台式流式细胞仪</td><td>BD 生物科学</td><td></td><td>3 激光（20 mW Coherent Sapphire 488 nm 蓝色，25 mW Coherent Vioflame 405 nm 紫色，17 mW JDS Uniphase HeNe 633 nm 红色）</td></tr><tr><td>FACS Diva 软件&amp;nbsp;</td><td>BD 生物科学</td><td></td><td>PC 版本 6.0</td></tr><tr><td>FlowJo 软件&amp;nbsp;</td><td>Treestar US</td><td></td><td>Mac 版本 9.6.1 或 PC 版本 7.6.5</td></tr><tr><td>Sphero Rainbow 荧光微粒</td><td>BD 生物科学</td><td>556298</td><td>用于调节所有通道电压，以保持荧光强度的一致性&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>超彩虹荧光微粒&amp;nbsp;</td><td>Spherotech</td><td>URFP-10-5</td><td>除使用 Megamix-Plus SSC 微球外，还用于确保不同批次间细胞外囊泡设门的一致性</td></tr><tr><td>Megmix-Plus SSC 珠子</td><td>Biocytex</td><td>7803</td><td>用于调节FSC和SSC&amp;nbsp; 维持电压&amp;nbsp; 一致性&amp;nbsp; 每次运行之间。也可用于监测流速并调节流速旋钮，以确保所有运行中使用相同的流速</td></tr><tr><td>AbC Anti-Mouse Bead Kit</td><td>Life Technologies</td><td>A-10344</td><td>用于补偿对照 &amp;以及用于基于微珠方法的阴性AbC微珠</td></tr><tr><td>非离子型去污剂P-40替代物（NP-40）（CAS 9016-45-9）</td><td>圣克鲁斯&amp;nbsp;</td><td>sc-281108</td><td>仅在个体检测方法中用于初始读数后裂解样本，作为阴性对照。可将储备液用PBS按1:10稀释，置于冰箱中保存，最长可保存1个月。</td></tr><tr><td>BD TruCOUNT 管</td><td>BD生物科学</td><td>340334</td><td>在需要绝对EV浓度时使用</td></tr><tr><td>Ultrafree-MC，GV 0.22 &amp;micro;m 离心过滤装置</td><td>Millipore&amp;nbsp;</td><td>UFC30GVNB</td><td>用于对细胞外囊泡进行染色后洗涤和/或根据大小对细胞外囊泡进行分级分离</td></tr><tr><td>ACD-A抗凝全血真空采血管</td><td>BD 生物科学</td><td>364606</td><td></td></tr><tr><td>Facs 管 12x75 聚苯乙烯</td><td>BD 生物科学</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 储液槽，单独包装&amp;nbsp;</td><td>Phenix</td><td>RR-50-1s</td><td></td></tr><tr><td>Green-Pak 移液器吸头 - 10 &amp;micro;l</td><td>Rainin</td><td>GP-L10S</td><td></td></tr><tr><td>Green-Pak 吸头 -200 &amp;micro;l&amp;nbsp;</td><td>Rainin</td><td>GP-L250S</td><td></td></tr><tr><td>绿色-Pak 吸头 - 1,000 &amp;micro;l&amp;nbsp;</td><td>Rainin</td><td>GP-L1000S</td><td></td></tr><tr><td>预灭菌稳定型堆叠 L300 吸头</td><td>Rainin</td><td>SS-L300S</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite&amp;nbsp;XLS 8 通道 LTS&amp;nbsp;可调节的&amp;nbsp;间隔区&amp;nbsp;</td><td>Rainin</td><td>LA8-300XLS</td><td></td></tr><tr><td>96孔组织培养板</td><td>E&amp;amp;K Scientific</td><td>EK-20180</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640培养基（不含Hepes）</td><td>加州大学旧金山分校细胞培养中心</td><td>CCFAE001</td><td>用于基于微珠检测方法的培养基</td></tr><tr><td>Dulbecco 磷酸盐缓冲液 D-PBS，无钙镁，0.2 &amp;micro;m 过滤</td><td>加州大学旧金山分校细胞培养中心</td><td>CCFAL003</td><td></td></tr><tr><td>超速离心管，薄壁，超透明</td><td>贝克曼库尔特公司</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>第 I 面板</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD3 PerCP-Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>344808</td><td>2 &amp;micro;l</td></tr><tr><td>CD14 APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>301820</td><td>2 &amp;micro;l</td></tr><tr><td>CD16 V450</td><td>BD Biosciences</td><td>560474</td><td>2 &amp;micro;l</td></tr><tr><td>CD28 FITC</td><td>biolegend</td><td>302906</td><td>2 &amp;micro;l</td></tr><tr><td>CD152 APC</td><td>BD 生物科学</td><td>555855</td><td>2 &amp;micro;l</td></tr><tr><td>CD19 A700</td><td>Biolegend</td><td>302226</td><td>2 &amp;micro;l</td></tr><tr><td>第二部分</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD41a PerCP-Cy5.5</td><td>BD 生物科学</td><td>340930</td><td>2 &amp;micro;l</td></tr><tr><td>CD62L APC</td><td>Biolegend</td><td>304810</td><td>2 &amp;micro;l</td></tr><tr><td>CD108 PE&amp;nbsp;</td><td>BD 生物科学</td><td>552830</td><td>2 &amp;micro;l</td></tr><tr><td>CD235a FITC</td><td>biolegend</td><td>349104</td><td>2 &amp;micro;l</td></tr><tr><td>第三部分</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD11b PE-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>301322</td><td>2 &amp;micro;l</td></tr><tr><td>CD62p APC</td><td>Biolegend</td><td>304910</td><td>2 &amp;micro;l</td></tr><tr><td>CD66b PE&amp;nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>305106</td><td>2 &amp;micro;l</td></tr><tr><td>CD15 FITC</td><td>exalpha</td><td>X1496M</td><td>5 &amp;micro;l</td></tr><tr><td>CD9 PE</td><td>Biolegend</td><td>555372</td><td></td></tr><tr><td>CD63 APC</td><td>Biolegend</td><td>353008</td><td></td></tr><tr><td>APC-Cy7 小鼠 IgG2a &amp;kappa;</td><td>Biolegend</td><td>400230</td><td></td></tr></tbody></table>

使用流式细胞术分析细胞外囊泡的技术

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

细胞外囊泡（EVs）是一类存在于体液中的小型膜源性囊泡，在细胞间通讯中发挥重要作用，并参与调控多种多样的生物学过程。由于EVs体积微小，且缺乏明确表达目标标志物的离散群体，使用流式细胞术（FCM）对其进行分析一直极具挑战性。尽管过去十年中EVs分析方法已显著改进，但仍处于持续优化阶段。遗憾的是，目前尚不存在适用于所有情况的通用方案，在选择最合适的分析方法时需综合考虑多个因素。本文介绍了多种EVs处理技术，以及两种分别基于单颗粒检测和微球捕获法的EVs分析方案。所述方法有助于去除商业抗体制剂中常见的抗体聚集体，提高信噪比，并以合理的方式设门，最大限度减少背景荧光的干扰。第一种方案采用单颗粒检测方法，特别适用于高通量临床样本的分析；第二种方案则采用基于微球的方法，用于捕获和检测较小的EVs及外泌体。

图1 概述了使用基于微球的方法或单颗粒检测方法分离和检测细胞外囊泡（EVs）的整体处理流程。利用流式细胞术（FCM）对EVs进行单颗粒检测适用于分析较大的EVs，但大多数流式细胞仪无法对小至外泌体的颗粒进行单颗粒检测。基于微球的方法可实现对小型EVs的检测，但该方法存在若干局限性，如表1所述。通常，当需要将EVs用于功能学实验时，推荐采用超速离心法（可选是否结合蔗糖梯度分离步骤）进行EVs的分离。超速离心可去除血清蛋白及其他可溶性污染物等杂质，这些杂质可能影响功能实验的结果。然而，超速离心耗时较长，且可能改变EVs的数量和质量12。
两种检测方法的预期结果如图2-3所示。在单个检测方法中，裂解对照样本（图2底行）用于设定相应未裂解样本（图2顶行）的设门范围。大多数事件应位于EV门内。当两种待比较的标志物通常不在同一细胞上共存时，象限设门不应显示双阳性事件。在图2</strong...

使用流式细胞术（FCM）检测细胞外囊泡（EVs）的方法有多种。在确定最合适的检测方法时，应考虑多个方面。本文介绍了两种检测EVs的方案，分别采用单颗粒检测法或基于微球的方法。

细胞外囊泡（EVs）是一类存在于体液中的小型膜源性囊泡，在细胞间通讯中发挥重要作用，并有助于……

本实验的总体目标是通过两种不同方法分离并分析血液中外泌体的循环。针对单个外泌体的检测方法，首先从血液样本中分离出血小板贫浆（platelet poor plasma, PPP）。随后，使用目标荧光染料偶联抗体对血小板贫浆（PPP）进行染色。对于基于微球的检测方法，先将细胞外囊泡与微球孵育，然后使用相应的荧光染料偶联抗体对结合在微球上的囊泡进行染色。最终，通过流式细胞术分析样本，即可确定循环中细胞外囊泡的含量。与电子显微镜或磁珠分离等现有方法相比，该技术的主要优势在于速度更快，并且能够评估完整的细胞外囊泡群体，而不局限于特定的亚群。通常，初次接触该方法的研究人员可能会遇到困难，因为该方法的成功依赖于严格遵循所展示的操作步骤和流式细胞仪的设置参数，以获得高质量的数据并尽量减少日间差异。首先，离心全血样本，以分离血浆、白膜层和红细胞。接着，小心吸取1.2毫升血浆上清液，转移至1.5毫升离心管中，注意避免扰动含有白膜层和红细胞的底层沉淀。然后再次离心上清液，以去除任何血小板和较大的细胞碎片。离心结束后，小心地将PPP样本中除最后200微升以外的全部液体转移至新管中，注意不要扰动沉淀物。随后将血浆上下混匀数次，并将每份样本中的320微升转移至96孔板的最上一排。为染色样本，将每个三联检测面板中感兴趣的抗体分别加入单独的0.22微米离心滤管中，使用固定角度转子的单速离心机离心收集抗体。当所有抗体完全通过滤膜后，按照图中所示，将适量混合液加入96孔板的每个孔中。接着，使用多通道移液器混匀PPP样本，然后将每份样本各100 µL转移至第二行的抗体中。再次混匀样本，更换枪头后，根据需要将每份样本各100 µL转移至接下来的两行抗体孔中。进行实验。在生物安全柜内，向第6至第8行的每个孔中加入220微升PBS，30分钟后将培养板置于4摄氏度下孵育。然后使用可调间距的多通道移液器，将每孔中的溶液转移至对应的离心过滤管中，移液过程中不更换枪头。使用来自其中一个洗涤行的 200 微升 PBS，冲洗刚刚移除样本的孔。然后将洗涤液转移至之前已加入 PPP 样本的相同滤膜中，并关闭离心滤器。待所有染色的 PPP 样本及其洗涤液全部转移后，在固定转子离心机中离心样品。离心后，确保滤膜表面无残留液体。随后将滤膜顶部用 300 µL PBS 重悬，并将重悬液转移至预先标记的试管中，立即进行流式细胞术分析。使用离心滤膜洗涤染色样本可增强背景信号与阳性标记信号之间的分离效果。需要注意的是，一些较小的细胞外囊泡（包括外泌体）可能会穿过滤膜的孔径而丢失。为分析样品，首先将前向散射和侧向散射的电压参数设置为对数刻度，并为每个参数选择流式细胞仪允许的最低阈值。然后，在运行含有0.22微米过滤PBS的样品管时，将这些电压调整至能够排除大部分背景噪声的最高值。接下来，运行含有混合微球（1微米及更小）的样品管，并在前向散射与侧向散射图中围绕微球群体绘制门控，以捕获所有小于1微米微球的事件。现在将流式细胞仪的流速调至低速，并使用微珠调整流式细胞仪上的流速旋钮至所需的事件速率。然后使用一管用 PBS 稀释的彩虹荧光微粒，采集 5,000 个事件，记录前向散射、侧向散射以及每个荧光通道信号的平均强度值。当所有参数设置完成后，每份样本精确运行一至两分钟。在每管样本完成第一次读数后，向每管中加入 20 微升 10% MP-40，混匀，再以相同时间重新读取各管样本，以便在相同时间内扣除溶血样本中检测到的阳性事件。通过基于微珠的捕获方法检测细胞外囊泡时，首先用 RPMI 培养基清洗未包被的六微米聚苯乙烯微珠两次，随后将其重悬于两毫升相同培养基中。接着，将 6,000 个微珠分装至各新的离心管中：阴性对照管中加入 400 微升培养基，其余各管根据需要加入 200 微升 PPP 或经超速离心获得的细胞外囊泡，以及 200 微升培养基。最后将每管的终体积调整至 400 微升。加入更多培养基。将试管置于摇床上，在4°C下孵育过夜。次日早晨，用两毫升培养基洗涤磁珠。吸去上清液，加入400微升5%牛血清白蛋白，以封闭非特异性结合，在4摄氏度下置于摇床上孵育3小时。3小时后，用2毫升培养基洗涤磁珠，并将沉淀重悬于100微升新鲜培养基中。随后过滤抗体，将适量过滤后的抗体混合液加入各管中，4摄氏度孵育30分钟后，再用2毫升培养基洗涤磁珠。此时，将沉淀重悬于400微升培养基中，并立即通过流式细胞术分析样品，将前向散射参数调整至流式细胞仪允许的最低阈值，如前所示。最后，圈选单细胞微珠群体，并每样本采集2000个事件。个体检测法和微珠介导的检测法均可用于检测PPP样品中外泌体的存在，如这些散点图所示。在个体检测实验中，裂解对照用于设定相应未裂解样品的圈门范围。大多数事件应位于细胞外囊泡门控范围内。例如，在本图中，这些双参数图显示了标志物 CD108A 和 CD235A 的检测结果，这两种标志物是已知共存于细胞上的红细胞标志物。正如预期，超过一半的细胞外囊泡阳性事件同时对这两种标志物呈阳性；而在这些双参数图中，使用基于微球的检测方法，对两种已知不在细胞上共存的标志物的细胞外囊泡表达则显示出明显分离的阳性群体。阳性与阴性群体之间无明显分离，事件出现在双阳性象限中，即使由于两种类型的细胞外囊泡均会结合至同一微球上，这些事件通常不会出现在同一种细胞类型上。因此，该方法的数据最好通过叠加阴性对照数据的直方图进行分析，与对照组相比，包被微球的样本中可观察到标记物表达的明显偏移。一旦掌握，该技术可用于分析12个血液样本，使用三种抗体组合，采用单个检测方法可在三到四小时内完成，而采用微球法若操作得当，则可在一天半内完成。在进行该实验操作时，重要的是要始终如一地处理每个样本，并确保在每次实验开始时，正确调整流式细胞仪的流速和荧光强度，以与前一日的实验条件保持一致，尤其是在连续多日处理多个样本时。

techniques-for-analysis-extracellular-vesicles-using-flow

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

对于外小泡的使用流式细胞仪分析技术

本视频展示了利用荧光标记的捕获抗体-磁性纳米颗粒偶联物进行细胞外囊泡的免疫捕获。该过程包括复合物的形成、使用荧光标记的检测抗体进行染色、磁分离以及流式细胞术分析，以实现抗原表征。...

外泌体的免疫捕获与流式细胞术抗原表征

利用与识别表面抗原的抗体偶联的15...

利用流式病毒术分析病毒颗粒与细胞外囊泡的抗原谱

在本实验方案中，我们描述了从人全血中快速分离细胞外囊泡并通过基于荧光的纳米颗粒追踪分析对特定标志物进行表征的完整流程。所展示的结果具有高度可重复性，且该方法可调整用于细胞培养上清液的分析。...

基于纳米颗粒示踪分析的单个细胞外囊泡在人血中快速荧光表征

本方案描述了一种可重复的方法，专为使用细胞培养上清液检测小细胞外囊泡（EV）表面表位而设计。该方法利用与识别表面抗原CD9、CD63和CD81的抗体偶联的磁珠，对EV进行特异性免疫沉淀。本方法已针对后续的流式细胞术分析进行了优化。...

细胞条件培养基中外泌体的流式细胞术分析

最新一代的细胞外囊泡（EV）表征工具能够同时对单个EV的多个参数进行分析。纳米流式细胞术可对大于45...

单个细胞外囊泡跨膜蛋白的纳米流式检测表征

本方案通过优化空气喷雾喷嘴尺寸、鞘液压力、样品流压力、电压、增益和触发阈值等参数，提供了一种快速且基于尺寸特异性的外泌体小细胞外囊泡分离方法。...

优化流式细胞分选参数以实现小细胞外囊泡的高通量分离与纯化

在此，我们介绍一种简便的实验方案，可实现 体外...

利用流式细胞术追踪miRNA向细胞外囊泡的释放

本文展示了从人体受试者的生物液体（如泪液和唾液）中收集的细胞外囊泡（EVs）的表征方法。该方法所使用的扫描仪能够检测仅1...

表征生物体液中的细胞外囊泡

本文介绍了一种从小鼠睾丸中高效获取高纯度且具有活性的减数分裂细胞组分的方法，该方法结合了优化的细胞解离方案与荧光激活细胞分选技术（FACS）。此方法利用了不同减数分裂阶段细胞在DNA含量和细胞核密度上的差异。...

流式细胞术纯化小鼠减数分裂细胞

成功使用细胞示踪染料来监测免疫细胞功能和增殖涉及多个关键步骤。我们描述了以下方法：1）使用膜染料获得明亮、均一且可重复的标记；2）选择荧光染料及数据采集条件；3）选择基于染料稀释的细胞增殖定量模型。...

优化的细胞分裂监测染色与增殖建模方法——基于细胞示踪染料

学习使用流式细胞仪分析外小泡的两种方法：单个检测法和微珠捕获法。本技术可从血液样本中分离并定量分析循环外小泡，适用于神经科学和细胞生物学研究。

使用流式细胞术分析细胞外囊泡的技术

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