由多光谱成像流式细胞仪分析细胞内化纳米粒子和细菌

通过多光谱成像流式细胞术分析纳米颗粒和细菌内化的细胞机制。首先用 cyto klain D 预处理巨噬细胞以抑制肌动蛋白聚合。将纳米颗粒或沙门氏菌添加到巨噬细胞中，单层并孵育。

然后收获、固定和标记巨噬细胞以使用图像流进行分析。具有内化纳米颗粒和/或沙门氏菌的多光谱成像流式细胞仪细胞与具有表面结合纳米颗粒和/或沙门氏菌的细胞区分开来。所得数据表明，沙门氏菌和纳米颗粒都仅被未用细胞 klain 处理的细胞内化。

D 表明内化是肌动蛋白依赖性的。与流式细胞术和共聚焦显微镜等现有方法相比，该技术具有多个优势。首先，它可以高速准确测量不同细胞特征之间的荧光信号强度和空间分辨率。

这种方法可以帮助回答生物材料疫苗和药物递送研究以及大量病原体相互作用研究的关键问题。这包括描述聚酐纳米颗粒和细菌利用的内化途径。一般来说，刚接触这种方法的人经常会遇到困难。

花时间滴定染料以获得最佳荧光信号非常重要。此外，了解软件和创建分析模板需要时间。当我们发现聚氢纳米颗粒在使用显微镜和其他技术时表现出模拟病原体的特性时，我们首先想到了这种方法。

然后，我们想要一个高通量系统来比较沙门氏菌和花粉氢化物纳米颗粒使用的内化过程 在进行测定之前。应收获所有哺乳动物和细菌细胞培养物，并制备纳米颗粒悬浮液。首先使用细胞刮刀收获汇合的 RA W2 64.7 细胞。

使用血细胞计数器确定细胞数量。然后将细胞以 5 倍 10 的密度接种在 24 孔培养皿中，以 0.5 mL/0 mL 的密度接种至每孔的第五个细胞。完成 DMEM，在 37 摄氏度和 5% CO2 培养箱中孵育过夜。

为了制备塔里卡沙门氏菌，在 C-D-M-E-M 中稀释转化沙门氏菌，以获得每 RA W2 64.7 个细胞在 16 x 125 毫米高压灭菌器螺帽玻璃培养管中 100 个感染的复数。接下来，使用灭菌的乳清纸，在 1.5 毫升微量离心管中称出 5 毫克 1% FITC 负载的聚酸酐纳米颗粒，如 rean 同事在其 2009 年的出版物和药物研究中所述。将纳米颗粒加入 0.5 毫升冷磷酸盐缓冲盐水中，并将其置于冰上。

将管子保持在冰上。使用带有微尖的超声波液体处理器以 4 到 6 焦耳的速度对悬浮液进行约 25 秒的超声处理。现在所有需要的细胞和试剂都已准备就绪，可以进行吞噬作用测定。

标记 24 个含有培养的 RA W2 64.7 细胞的孔组织培养板，以准备在第一板上进行测定。以下每个样品将一式三份进行检测，细胞和细胞 D 与纳米颗粒，细胞和 D 与沙门氏菌，培养基与纳米颗粒，仅沙门氏菌，AF 六个 60 染色细胞仅 4 摄氏度对照将在第二个板上进行检测，包括培养基加纳米颗粒和培养基加沙门氏菌在此低温下孵育， 诱导前 1 小时缓慢的细胞过程，例如吞噬作用。将每毫升 5 微克细胞和 D 以及 C-D-M-E-M 添加到适当的孔中，并在 37 摄氏度下孵育细胞。

孵育后，涡旋纳米颗粒悬浮液并向适当的孔中加入 10 微升。然后涡旋沙门氏菌，并以 MOI 为 100 将其添加到适当的孔中。轻敲板子几次以混合。

然后将样品板置于 37 摄氏度，将阴性对照板置于 4 摄氏度下 45 分钟。孵育后，将板放在冰上，用不含钙和镁的冰冷 PBS 洗涤细胞两次，吸出并丢弃旧培养基，以去除未结合的颗粒、沙门氏菌和死亡或分离的细胞。花瓣镁的用途。

在这个阶段，Pre PBS 是必不可少的，因为它有助于细胞从底物上分离要收获细胞，加入 250 微升冰冷的 PBS 并轻轻刮擦孔，将收获的细胞移液到硅化的卡扣帽微量离心管中，并保持在冰上。加入 1 毫升冷洗涤缓冲液洗涤细胞，然后在 4 摄氏度下以 250 倍 G 离心 10 分钟。弃去上清液后，通过在纸上敲击倒置的微量离心管来去除残留的缓冲液。

将微量离心管耙过试管架，以重悬细胞沉淀。要固定细胞，在 PBS 中加入 100 微升 4% 对位甲醛，让细胞静置 15 分钟。在室温下，加入 1 毫升烫金洗涤缓冲液洗涤细胞，然后在 4 摄氏度下以 250 倍 G 离心 10 分钟。

弃去上清液后，像以前一样去除残留缓冲液。然后对 RA W2 64.7 细胞进行染色。对于肌动蛋白，在 6 个 60 分钟内加入 100 μL 含有 Alexa Fluora foid 的烫金洗涤缓冲液，持续 15 分钟。

在室温下，未染色的样品应与 perm、不含 phin 的洗涤缓冲液一起孵育。染色后，再次洗涤并离心细胞，然后将它们重悬于 50 微升含有 1%PFA 的 PBS 中，并将它们储存在 4 摄氏度的黑暗中直至获取。启动、图像流和启动。

在 file （文件） 菜单中激发并初始化液流。选择 load default template（加载默认模板）。在图像库中，查看菜单，选择全部并按运行设置开始成像珠子，如有必要，调整核心跟踪以横向居中图像。

选择明场通道，然后单击 set intensity （设置强度）。等待流速变异系数始终小于 0.2%在辅助选项卡中，单击全部启动以运行校准和测试，并验证所有校准和测试是否已在软件中通过。单击 Load sample（加载样本）。

然后，根据指示，放置包含最亮样品的小瓶。将样品加载器中的所有荧光染料都放入样品中，选择 40 倍放大倍率。一旦确定了仪器设置，就不要在整个实验中更改它们。

通过单击软件中的激光图标打开实验中的每个激光器，并设置激光功率，以便每个荧光染料的最大像素值在 104， 000 个计数之间，如在散点图中测量的那样。要消除不需要的对象的集合，请单击软件中的单元格分类器窗口。然后，要仅收集单元数据，请为明场选择区域下限通道 1，并将值设置为 50 微米，面积小于 50 微米的对象将被视为碎片，不会被采集。

单击此处软件中的相应频道图标，选择要收集的频道。通道 1、2、3、4、5 和 6 在 setup 选项卡下被选中。输入文件编号和目标文件夹。

将 序列号 设置为 1，将要获取的事件数设置为 5， 000。单击 run， acquire 以收集并保存第一个实验数据文件。单击 FLL 并运行下一个实验样品。

重复直到收集完所有实验样品。接下来，要运行控件，请单击 comp settings。这将关闭明场和散射激光，并在 acquire 选项卡下启用所有荧光通道的收集。

将 input （输入） 值更改为 500。然后放置对照管并单击 run。采集以在单染色对照中收集 500 个阳性细胞。

对实验中的每种荧光染料重复此作，以开发补偿基质。获取完所有样本图像后，双击桌面上的想法图标，在单独的分析计算机上启动想法分析软件。双击内部化向导并加载其中一个测试示例 RIF 文件。

弹出窗口将提供加载测试文件的说明。按照说明作，然后单击下一步按钮。接下来，单击 New matrix。

这将启动补偿向导。出现提示时，选择单色控件的数据文件以添加它们。按照说明在向导中单击 Next，直到补偿矩阵文件保存并加载到内部化向导的第 2 步中的框中。

单击下一步并按照说明进行作，直到生成 DAF 文件。通过选择采集过程中使用的图像通道来设置图像显示属性。单击通道 2 用于 FITC，通道 5 用于 AF six 60。

默认情况下，Brightfield 和 side scatter 处于选中状态。选择明场通道 O 1 作为细胞边界和通道 O 2 ，其中收集纳米颗粒或细菌用于内化探针以定义单个细胞群，生成明场面积与所有细胞的明场纵横比的散点图。多个数据文件的高通量分析需要一个模板文件，因此在创建模板文件时仔细定义门至关重要。

每个点表示单个单元格图像的值。单击单个。在图形中选择该特定单元格的图像。

接下来，在单元格周围绘制一个门，其面积和纵横比对应于单个单元格事件。单个单元格的纵横比为圆角 1 和双峰。纵横比约为 0.5。

单击多个细胞以区分包含单个细胞的区域与双联细胞或碎片的区域。生成明场渐变根的直方图是指明场图像的平方。点击 下一步 按钮。

然后，在 population 选项卡下，选择 bin 选项以显示选定的 bin。单击分箱以确定单元格和最佳焦点的位置。开始并绘制一个线条区域以步态聚焦的单元格。

梯度 RMS 越高，聚焦越好，除非有其他染色剂需要设门，否则跳过下一步。将生成 x 轴上通道 2 的强度与 Y 轴上通道 2 的最大像素的新散点图。单击点并查看图像，以帮助确定在纳米颗粒或细菌呈阳性的细胞周围绘制的区域。

内部化特征的直方图由一个从零开始的区域生成，应通过观察图像进行调整。内化特征是细胞内部强度与整个细胞强度的比率。它被缩放，使得在值为零时，强度的一半在内部。

该向导创建了每个单元的一个区域，该区域通过制作一个使用的掩码来指定内部，该单元图像输入用于查找单元表面，并将其侵蚀了四个像素。请注意，必要时，可以针对不同的单元格类型手动调整此蒙版，方法是先在明场图像上创建一个对象蒙版，然后用或多或少的像素来侵蚀它。内部化特征是使用软件中的算法基于这个侵蚀对象掩码计算的。

此功能使我们能够区分大部分荧光信号在掩模边界内的内化颗粒和细菌与表面结合的颗粒和细菌，这些颗粒和细菌的大部分荧光信号在掩模边界之外，如本例所示，创建一个具有新内化特征的新直方图基于侵蚀的物体掩模。通过在选定的 bin 模式下查看图像，在内部化单元格上绘制一个区域以设门。将门设置为 0.3.Here。

分数低于 0.3 的细胞被视为表面结合颗粒阳性细胞。要消除具有背景标记的细胞并识别特定的内化纳米颗粒或细菌，请从分析菜单中选择特征。单击 analysis 菜单。

然后单击旁边的 Spot 计数功能，将平均 Spot 计数添加到统计报告中。在 reports 菜单中，单击 reports 图标。然后定义统计报告，然后添加列，然后选择适当的细胞群。

单击 确定。内化向导会自动将统计数据添加到此报告中，以将数据文件保存为模板文件，用于所有实验文件的批量分析。单击 file 菜单并选择 Save as template.

模板文件。具有扩展名 .AST 以分析 idea 软件中的多个数据文件。单击工具并选择批处理数据文件并输入所有 RIF 文件。

在相应部分添加补偿矩阵文件和模板文件，以提交批处理进行处理，单击 提交。在处理步骤之后，将分析所有 RAF 文件，并为每个单独的 Raw 文件生成 DAF 文件。生成包含所有样品统计数据的最终报告，以比较肌动蛋白抑制和低温对沙门氏菌和纳米颗粒吞噬作用的影响。

RA W2 64.7 细胞在 37 摄氏度下在培养基中孵育，无论是否含有细胞 Klain D，或在 4 摄氏度的培养基中孵育。温度和肌动蛋白作都减少了纳米颗粒和沙门氏菌的内化。然而，在 cyto 和 D 中孵育细胞会增加具有表面结合纳米颗粒的细胞百分比，同时降低具有表面结合沙门氏菌的细胞百分比。

表面结合纳米颗粒阳性的细胞百分比从 37 摄氏度时的约 8% 增加到细胞和 D 或 4 摄氏度处理后的 35% 以上。相比之下，具有表面结合沙门氏菌的细胞百分比从 35% 降低到 15%在细胞和 D 处理后，RA W2 64.7 细胞与沙门氏菌在 4 摄氏度下孵育，内化减少，表面结合细菌的数量没有明显增加与 37 摄氏度对照相比。总之，这些数据表明，沙门氏菌和纳米颗粒被需要肌动蛋白的类似细胞过程内化，并且与温度有关。

此外，数据表明沙门氏菌与巨噬细胞的持续附着需要肌动蛋白聚合。看完这个视频，你应该对如何通过多光谱成像流式细胞术来 ex 纳米颗粒和细菌的细胞内化有一个很好的了解。在尝试此程序时，重要的是要记住抑制剂具有细胞毒性。

因此，需要事先进行细胞毒性分析实验以确定要使用的最佳浓度。不要忘记，与沙门氏菌一起工作可能是危险的预防措施，例如在执行此程序时应注意佩戴适当的个人防护设备并避免产生气溶胶。