结核分枝杆菌感染后人单核细胞来源的M1和M2极化细胞的制备及流式细胞术分析

本方案提供了一种基于绿色荧光蛋白标记的结核分枝杆菌（Mtb）在不同巨噬细胞亚群中的可视化和深度表征，利用十色流式细胞术追踪人单核细胞来源细胞的免疫极化状态。该方法可高效、可重复地研究M1或M2极化巨噬细胞对Mtb感染的应答，包括感染前后细胞表型与功能的评估。为从人供体的血沉棕黄层中分离外周血单个核细胞（PBMC），请使用移液器沿50毫升离心管管壁缓慢将15毫升血沉棕黄层血液叠加于15毫升密度梯度介质之上，随后通过离心实现细胞分离。

使用无菌巴斯德吸管移除上层血浆，并小心地将单个核细胞层转移至新的 50 毫升离心管中。向细胞中加入无血清 RPMI 培养基，使最终体积达到 50 毫升，轻轻倒置离心管数次后进行离心。然后将细胞重悬于 20 毫升无血清培养基中用于计数。

为启动巨噬细胞分化，将细胞稀释至每毫升无血清培养基中含5×10⁶个细胞的浓度，并将2毫升细胞接种至6孔板的各个孔中。将培养板置于细胞培养箱中孵育2至3小时，使细胞贴附于孔底。孵育结束后，每孔用1毫升无血清培养基洗涤3次，随后每孔加入2毫升完全RPMI培养基，并分别补充50纳克/毫升的GM-CSF（用于M1型分化）或50纳克/毫升的M-CSF（用于M2型分化），作用于已贴壁的细胞。

极化诱导三天后，小心地将每孔上清液更换为一毫升添加了适当生长因子的新鲜完全培养基。培养第六天，在经 GM-CSF 处理的孔中加入 50 纳克/毫升的干扰素 γ 和 10 纳克/毫升的 LPS，在经 M-CSF 处理的孔中加入 20 纳克/毫升的 IL-4。定期通过光学显微镜观察单核细胞来源的细胞培养物的形态，以确保较小的单核细胞正在分化为较大的类似巨噬细胞的细胞。

在生物安全三级设施中，取1毫升解冻的结核分枝杆菌（Mtb）菌液，与9毫升TB完全培养基混合于一个50毫升带滤帽的离心管中，在细胞培养箱中孵育24小时。次日，通过离心收集细菌，并将菌体沉淀重悬于新的50毫升带滤帽离心管中的15至20毫升新鲜TB完全培养基中，然后将细菌重新放回细胞培养箱继续培养。培养7至10天后，用35至40毫升无菌洗涤缓冲液洗涤细菌两次，每次洗涤后均进行离心；第二次洗涤后，将细菌沉淀重悬于1毫升无血清RPMI培养基中。

向细菌中加入另外九毫升无血清 RPMI 培养基，在生物安全二级柜内的水浴超声仪中于 37 摄氏度条件下对细菌超声处理五分钟。随后，在生物安全柜内的分光光度计中，测定一毫升细菌悬液在 600 纳米波长处的光密度。为感染单核细胞来源的细胞，将细菌用无血清培养基稀释至浓度为每毫升 5 × 10⁶ 菌落形成单位，然后将六孔细胞培养板中每孔的上清液更换为一毫升新鲜无血清培养基和一毫升细菌悬液，以达到感染复数为 5 的条件。

在细胞培养箱中孵育四小时后，每次用一毫升无菌洗涤缓冲液洗涤每个孔，共洗涤三次，每次洗涤后轻轻倾斜培养板，以彻底清除各孔角落中的缓冲液。然后将感染结核分枝杆菌（Mtb）的单核细胞来源细胞重悬于两毫升不含抗生素的完全培养基中。为进行流式细胞术染色，将感染的细胞与每孔含0.5毫摩尔EDTA的一毫升FACS缓冲液共同孵育，孵育时间至少为30分钟。

孵育结束后，用移液器轻轻吹打收集脱落的细胞，并将细胞转移至带螺口盖的微量离心管中进行离心。用约 50 µL 荧光染料标记的人源抗体混合物及所需的活力染料重悬细胞，在 4 °C 避光孵育 30 分钟。洗涤后，加入 200 µL 新鲜配制的固定缓冲液，在室温下避光固定 30 分钟。

固定和洗涤后，将细胞重悬于 400 微升 FACS 缓冲液中，并将细胞转移至 1 毫升微量离心管中。为分析细胞，使用补偿微珠对混合抗体中每种荧光染料偶联抗体的荧光信号进行补偿，并使用未染色细胞设定阴性细胞群体的设门范围。然后每样本至少采集 50,000 个细胞。

M1和M2型单核细胞来源的细胞在感染结核分枝杆菌（Mtb）后均表现出颗粒度增高和细胞体积减小的垂直偏移。在感染复数为5的条件下，与未感染的M0细胞相比，感染Mtb的M1和M2细胞也显示出增强的细胞死亡。值得注意的是，感染4小时后，M2细胞中的Mtb GFP表达显著高于M1细胞。

未感染的M1和M2细胞可分别通过其CD64和CD86或CD200受体与CD163的共表达进行表征。感染结核分枝杆菌（Mtb）4小时后，在Mtb GFP阳性M1极化细胞中观察到CD200受体阳性细胞频率增加，而M2细胞中CD163的表达则降低。通过共聚焦显微镜也可在CD64阳性的M1细胞和CD163阳性的M2细胞中观察到Mtb GFP细菌。

UMAP 分析显示，结核分枝杆菌（Mtb）感染 4 小时尚不足以影响巨噬细胞的极化状态，而感染 24 小时后，未感染与感染的 M1 和 M2 细胞呈现出明显分离的聚类，且表达不同的表面标志物谱型。此外，PhenoGraph 分析表明，在 M1 和 M2 型未感染及 Mtb 感染细胞中，存在 24 个不同大小的独立分布聚类。M1 或 M2 极化效果以及 Mtb 感染效率在不同人源样本供体之间可能存在显著差异。

因此，建议在每次实验中至少使用两名供体样本，以减少实验变异。该模型可同时利用流式细胞术、共聚焦显微镜、mRNA表达分析、可溶性因子多重检测以及基于GFP表达或菌落形成单位的细菌定量，对人巨噬细胞进行综合评估。