M1 和 M2 人类单细胞衍生细胞的极化和对 结核病 感染的流动细胞学分析

该方案提供了基于 10 色流式细胞术对不同巨噬细胞亚群中绿色荧光蛋白标记的 Mtb 进行可视化和深度表征，跟踪人单核细胞衍生细胞免疫极化的机会。这代表了一种有效且可重复的方法，用于研究 M1 或 M2 极化巨噬细胞对 Mtb 感染的反应，包括感染前后表型和功能的评估。为了从人类供体血沉棕黄层中分离 PBMC，使用移液管将 15 毫升血沉棕黄层血液沿着 50 毫升试管的侧面缓慢覆盖到 15 毫升密度梯度培养基上，并通过离心分离细胞。

使用无菌巴斯德移液器去除顶部血浆层，并小心地将单核细胞层转移到新的 50 毫升试管中。向细胞中加入无血清 RPMI 培养基，至终体积为 50 mL，并在离心前轻轻倒置试管几次。然后将细胞重悬于 20 mL 无血清培养基中进行计数。

为了启动巨噬细胞分化，将细胞稀释至每毫升无血清培养基浓度的 5 乘以 10 至第 6 个细胞，并将 2 毫升细胞接种到 6 孔板的各个孔中。将板放入细胞培养箱中 2 到 3 小时，让细胞粘附在孔底上。在孵育结束时，用每次洗涤 1 毫升无血清培养基洗涤孔 3 次，并分别向贴壁细胞的每个孔中加入补充有 50 ng/ml GM-CSF 或 50 ng/ml M-CSF 的完全 RPMI 培养基，用于 M1 或 M2 分化。

极化开始后 3 天，小心地将每个孔中的 1 毫升上清液替换为 1 毫升补充有适当生长因子的新鲜完全培养基。在培养的第 6 天，向 GM-CSF 处理的孔中加入每毫升 50 纳克干扰素 γ 和 10 纳克/毫升的 LPS，向 M-CSF 处理的孔中加入每毫升 20 纳克的 IL-4。通过光学显微镜定期检查单核细胞衍生的细胞培养物的形态，以确保较小的单核细胞分化成较大的巨噬细胞样细胞。

为了建立 Mtb 培养物，在生物安全 III 级设施中，将 1 毫升等分试样的解冻细菌悬浮液与 9 毫升 TB 完全培养基混合在 50 毫升过滤盖管中，在细胞培养箱的管中孵育 24 小时。第二天，通过离心收集细菌，并将沉淀重悬于 15 至 20 mL 新鲜 TB 完全培养基中，放入新的 50 mL 过滤盖培养管中，然后将细菌送回细胞培养箱。培养 7 至 10 天后，每次洗涤用 35 至 40 mL 无菌洗涤缓冲液洗涤细菌 2 次，第二次洗涤后将细菌重悬于 1 mL 无血清 RPMI 培养基中。

向细菌中再添加 9 mL 无血清 RPMI 培养基，并在 II 级生物安全柜中的水浴超声仪中，在 37 摄氏度下对细菌进行 5 分钟的超声处理。然后在放置在生物安全柜内的分光光度计中测量 600 纳米波长的一毫升细菌悬浮液的光密度。为了感染单核细胞衍生的细胞，在无血清培养基中将细菌稀释至每毫升浓度的 5 乘以 10 至第 6 个菌落形成单位，并用每孔 1 毫升新鲜无血清培养基和 1 毫升细菌悬浮液替换六孔细胞培养板每个孔中的上清液，以获得 5 的感染倍数。

在细胞培养箱中孵育 4 小时后，每次洗涤用 1 mL 无菌洗涤缓冲液洗涤每个孔 3 次，每次洗涤后小心倾斜板以去除孔角的全部缓冲液体积。然后将 Mtb 感染的单核细胞衍生细胞重悬于不含抗生素的 2 毫升完全培养基中。为了对细胞进行流式细胞分析染色，将感染细胞与每孔补充 0.5 毫摩尔 EDTA 的 1 毫升 FACS 缓冲液孵育至少 30 分钟。

在孵育结束时，用轻柔的移液收集分离的细胞，并将细胞转移到单独的螺旋盖微量离心管中进行离心。将细胞重悬于约 50 μL 荧光染料偶联的抗人抗体混合物和目标活性染料中，并在 4 摄氏度下避光孵育细胞 30 分钟。洗涤后，用 200 μL 新鲜制备的固定缓冲液在室温下避光固定细胞 30 分钟。

固定和洗涤后，将细胞重悬于 400 μL FACS 缓冲液中，并将细胞转移到 1 mL 微量离心管中。为了分析细胞，使用补偿微珠补偿混合物中每种荧光染料偶联抗体的荧光信号，并使用未染色的细胞为阴性细胞群设置门。然后每个样品至少采集 50， 000 个细胞。

M1 和 M2 单核细胞衍生的细胞在 Mtb 感染后均表现出向更高粒度的垂直偏移和细胞大小的减小。与未感染的 M0 细胞相比，在 Mtb 感染的 M1 和 M2 细胞中也观察到感染倍数为 5 的细胞死亡增强。值得注意的是，与 M1 细胞相比，感染 4 小时后在 M2 细胞中观察到的 Mtb GFP 表达明显更高。

未感染的 M1 和 M2 细胞可分别通过其 CD64 和 CD86 或 CD200 受体和 CD163 共表达来表征。Mtb 感染 4 小时后，在 Mtb GFP 阳性 M1 极化细胞中观察到 CD200 受体阳性细胞的频率增加，而 M2 细胞中 CD163 的表达降低。通过共聚焦显微镜观察，也可以在 CD64 阳性 M1 细胞和 CD163 阳性 M2 细胞中观察到 Mtb GFP 细菌。

UMAP 分析显示，Mtb 感染 4 小时不足以影响巨噬细胞极化，而感染 24 小时导致未感染和感染的 M1 和 M2 细胞簇清晰分离，表达不同的表面标志物表达谱。此外，PhenoGraph 分析显示，24 个不同大小的不同簇独特分布在 M1 和 M2 未感染和 Mtb 感染的细胞中。M1 或 M2 极化或 Mtb 传染性的功效在人类供体之间可能有很大差异。

因此，建议在每个实验中至少包括两个供体，以减少实验变异。该模型允许使用流式细胞术、共聚焦显微镜、mRNA 表达分析、可溶性因子的多重分析以及使用 GFP 表达或集落形成单位的细菌定量同时评估人巨噬细胞。