一种检测 tau 种子诱导的报告蛋白聚集的 FRET 流式细胞术技术

取表达微管结合蛋白 tau 重复结构域的哺乳动物细胞培养物。

这些细胞质 tau 报告基因具有容易聚集的突变，并作为单体存在。

报告基因融合到荧光团 A 或 B 上，前者的发射光谱与后者的吸收光谱重叠。

添加与 tau 种子或全长 tau 纤维聚集体复合的脂质体。

进入细胞后，脂质体释放细胞质中的种子。

释放的种子介导 tau 报告基因的聚集，使荧光团 A 接近荧光团 B。

加入胰蛋白酶分离细胞，然后进行固定。

使用流式细胞仪分析细胞。

由于聚集体内的接近性，在激发时，通过偶极-偶极相互作用从荧光团 A 到 B 的能量转移称为荧光共振能量转移或 FRET。

激发的荧光团 B 发出 FRET信号，该信号的存在表明蛋白质聚集。

要在无菌条件下重新铺板生物传感器细胞，请用温热的PBS冲洗每个细胞系，然后与胰蛋白酶-EDTA孵育3分钟。当细胞分离后，停止用温热培养基反应，并立即将细胞转移到锥形管中。

心细胞，将沉淀重悬于新鲜培养基中。然后，计数细胞并使每 13 毫升培养基 3,500,000 个细胞的预混液细胞稀释液。使用多通道移液器，将 130 微升细胞缓慢转移到平底组织培养处理的 96 孔板的每个孔中，注意将移液器吸头放置在孔的中心，不要接触板的底部。

细胞接种后，让它们沉降，在室温下不受干扰 10 分钟，然后将板在 37 摄氏度、5% 二氧化碳和大于或等于 80% 的相对湿度下孵育过夜。第二天，当生物传感器细胞汇合 60% 至 65% 时，将还原血清培养基、脂质体试剂和生物种子源混合制成转导复合物。

然后，轻轻地将 20 微升转导复合物移液到每个单独的生物传感器孔的侧面，并将处理过的细胞送回培养箱中再放置 24 至 48 小时。在收获之前，未经处理的细胞将仅显示漫射荧光。然而，用 tau 种子材料处理的细胞将在 1 至 2 天后显示出明亮的聚集体。

要收获细胞，请用 50 微升胰蛋白酶-EDTA 替换细胞培养基，5 分钟后用 150 微升冷冻培养基停止反应。立即，将细胞转移到 96 孔圆底板上并沉淀细胞。在不干扰沉淀的情况下吸出上清液，然后将细胞轻轻但彻底地重悬于 50 微升 2% 多聚甲醛中 10 分钟。然后，再次旋转细胞并将沉淀重悬于 200 微升冷冻流式细胞术缓冲液中。