一种通过FRET流式细胞术检测Tau蛋白种子诱导的报告蛋白聚集的技术

取表达微管结合蛋白tau重复结构域的哺乳动物细胞培养物。

这些细胞质 tau 报告蛋白带有易于聚集的突变，且以单体形式存在。

报告分子分别与荧光团A或B融合，其中前者的发射光谱与后者的吸收光谱重叠。

加入与tau种子或全长tau纤维聚集体复合的脂质体。

进入细胞后，脂质体在细胞质中释放其内含的种子。

释放的种子介导tau报告分子的聚集，使荧光基团A靠近荧光基团B。

加入胰蛋白酶以解离细胞，然后进行固定。

使用流式细胞仪分析细胞。

由于聚集体内距离较近，激发后能量从荧光团A转移至荧光团B 通过 偶极-偶极相互作用被称为荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）。

受激发的荧光基B发出FRET信号，该信号的存在表明蛋白质发生聚集。

在无菌条件下对生物传感器细胞进行传代时，先用预热的 PBS 冲洗每种细胞系，随后加入胰蛋白酶-EDTA 溶液孵育 3 分钟。待细胞脱落后，加入预热的培养基终止反应，并立即将细胞悬液转移至锥形管中。

离心细胞，将沉淀重悬于新鲜培养基中。随后计数细胞，并配制每13毫升培养基含3,500,000个细胞的主混合细胞稀释液。使用多通道移液器，缓慢将130微升细胞悬液转移至平底组织培养处理的96孔板的每个孔中，注意将移液器吸头置于孔中央，避免接触孔底。

细胞接种后，于室温静置10分钟使其沉降，随后将培养板置于37°C、5%二氧化碳及相对湿度大于等于80%的条件下过夜培养。次日当生物传感器细胞融合度达到60%至65%时，将低血清培养基、脂质体试剂和生物种子来源混合，制备转导复合物。

然后，沿每个生物传感器孔的孔壁轻轻加入20微升转导复合物，并将处理后的细胞放回培养箱中继续孵育24至48小时。收获前，未处理的细胞仅显示弥散的荧光信号；而经tau种子物质处理的细胞在1至2天后将显示出明亮的聚集荧光信号。

收集细胞时，将细胞培养基替换为50 µL的胰蛋白酶-EDTA溶液，5分钟后加入150 µL预冷的培养基终止反应。立即把细胞转移至96孔圆底板中，并离心形成细胞沉淀。吸除上清液，注意不要扰动沉淀，随后在50 µL的2%多聚甲醛溶液中轻柔而充分地重悬细胞，固定10分钟。然后再次离心细胞，并将沉淀重悬于200 µL预冷的流式细胞术缓冲液中。