方法研究线虫线虫中固有的蛋白质聚集与年龄的变化

本实验的总体目标是检测秀丽隐杆线虫中蛋白质不溶性随年龄的变化，并评估靶向基因敲低如何影响这种衰老标志物。这种方法可以帮助回答衰老和蛋白质稳态领域的关键问题，例如为什么生物体无法随着年龄的增长而保持健康的蛋白质组。该技术的主要优点是有机会在没有疾病过程的情况下研究正常衰老过程中的蛋白质聚集。

虽然这种方法可以提供对秀丽隐杆线虫中蛋白质聚集的见解，但它也可以适用于其他模式生物，例如研究小鼠中与年龄相关的蛋白质不溶性。开始处理时，按照随附文本方案中的说明，将 207.45 毫升 S 基础培养基和其他试剂添加到 2， 800 毫升 Fernbach 培养瓶中。加入终浓度为 50 μg/mL 的羧青霉素和 1 毫摩尔的 IPTG，并用膜螺帽关闭培养瓶。

从 25 摄氏度的培养箱中取出 L1 样品，并将其转移到 15 毫升试管中。将 L1 以 1， 900 倍 g 离心 3 分钟。旋转后，去除上清液。

在显微镜下，计算每 2 微升的 L1 含量，并对至少 9 滴获得的数字进行平均。接下来，将 50， 000 条蠕虫添加到年轻蠕虫收集中，将 100， 000 条蠕虫添加到上一步制备的四个 Fernbach 培养瓶中。然后，根据蠕虫的数量成比例添加目标基因的对照 RNAi 细菌和 RNAi 细菌。

添加细菌后，用 S Basal 完成蠕虫培养，使总体积达到 300 毫升。将蠕虫培养物在 25 摄氏度下以 150 rpm 的摇动培养箱中孵育直至收集。在第 2 天或第 3 天收集幼虫以测量蛋白质溶解度的基础水平。

将一个培养瓶中的蠕虫倒入分离漏斗中，让蠕虫在室温下沉淀 10 分钟。蠕虫沉淀后，打开旋塞阀，将蠕虫滴入一根 50 毫升的试管中。接下来，将蠕虫颗粒分成两个 15 毫升的试管。

用 M9 将试管装满 15 毫升，然后离心蠕虫。要清洗蠕虫，请去除上清液，并在试管中加入 M9 至 15 毫升。重复离心。洗涤完成后，将蠕虫转移到两个 50 毫升的试管中，并使用冰冷的 M9 将总体积填充至 20 毫升。

为了去除细菌和死虫，将两个 20 毫升稀释的蠕虫颗粒添加到两个 50 毫升的试管中，试管中装满了 20 毫升冰冷的 60% 蔗糖。快速离心管。使用 25 毫升移液器，小心去除最多 15 mL 的顶部蠕虫层。

将顶部蠕虫层直接放入 37 毫升冰上制备的 M9 加辛氧醇醚-9 中。然后，将试管以 2， 700 倍 g 的速度以 4 摄氏度加速 9 度和减速 7 度离心 3 分钟。弃去上清液后，将沉淀转移到四个 15 毫升的试管中，并用冰冷的 M9 加辛氧醇醚-9 洗涤两次。

然后，离心管。去除上清液，用冰冷的 M9 加辛氧醇醚-9 填充试管至 15 毫升标记处。用冰冷的 M9 清洗蠕虫，并将 4 管合并成 2 管。

将试管装满 15 毫升并离心。取出上清液，在室温下用 M9 填充两根试管，总体积为 4 毫升，然后在章动混合器上以 25 摄氏度旋转 40 分钟。章动后，用冰冷的 M9 加辛氧醇醚-9 清洗蠕虫两次。

然后，用 M9 洗涤两次，并将蠕虫转移到一个试管中。收集前，在不含抑制剂的重组或 RAB 高盐提取缓冲液中洗涤蠕虫。去除上清液，直到蠕虫颗粒顶部没有液体。

然后，估计蠕虫颗粒的体积并加入相同体积的 RAB 和抑制剂。在干冰上准备一根 50 毫升的管子，一半装满液氮，使用巴斯德移液管，吸出蠕虫并慢慢滴入管中。让液氮蒸发并将冷冻蠕虫储存在零下 80 摄氏度，直到进一步加工。

用液氮冷却砂浆，然后在干冰上进行动物破坏。将冷冻的蠕虫转移到预冷的研钵中，研磨 2.5 分钟。向粉末中加入 100 毫升液氮，再研磨 2.5 分钟。

使用显微镜检查蠕虫体是否被打碎成小块。然后，将粉末转移到两毫升管中，并储存在零下 80 摄氏度。在干冰上，称取每个时间点 350 毫克地蠕虫的两倍，将每个 RNAi 细菌倒入两毫升试管中。

为了去除高盐溶性蛋白质，向每个试管中加入每重量两个体积的已制备的含有抑制剂的 RAB、1 毫摩尔 PMSF、200 单位/毫升 DNase I 和 100 微克/毫升 RNase A，并将粉末溶解在冰上。将悬浮液吸入 1 毫升注射器中 15 次，并在冰上孵育 10 分钟。在 4 摄氏度下以 18、400 倍 g 离心 20 分钟。

穿过脂肪层，将含有高盐溶性蛋白质的上清液收集到每种情况下的一根 2 毫升管中。去除脂肪并丢弃。分装高盐溶性蛋白质，在零下 80 摄氏度下冷冻。

要丢弃脂质，用 700 微升 RAB 溶解沉淀，其中含有含有一磨牙蔗糖（不含 DNase I 和 RNase A）的抑制剂，将悬浮液吸入注射器中 10 次，并在冰上孵育 5 分钟。确保去除所有上清液和脂质并丢弃它们。要去除 SDS 可溶性蛋白质，请用 700 微升 RIPA 缓冲液溶解沉淀。

将悬浮液吸入注射器中 10 次，并在冰上孵育 10 分钟。在 4 摄氏度下以 18、400 g 离心 20 分钟。收集含有 SDS 可溶性蛋白的上清液，并分装在零下 80 摄氏度下冷冻。

用 500 微升 RIPA 缓冲液溶解每个沉淀后，将每种情况的两个样品混合在一起，并将悬浮液吸入注射器中 10 次。小心去除所有上清液并将其丢弃。用 400 微升 70% 甲酸溶解含有高度不溶性蛋白质的最终沉淀，并将悬浮液吸入注射器中 20 次。

将悬浮液在冰上孵育 20 分钟。在超速离心管中离心悬浮液以去除蠕虫角质层碎片。收集含有高度不溶性蛋白质的上清液，并在零下 80 摄氏度下冷冻。

年轻和老年蠕虫不溶性蛋白含量的总蛋白染色显示，对照动物和长寿动物中高度不溶性蛋白质水平与年龄相关的强烈增加，而长寿动物则没有。PAB-1 是一种具有预测朊病毒样结构域的 RNA 结合蛋白，其抗体染色证实了质谱数据，即长寿动物随着年龄的增长而保持 PAB-1 可溶性。对咽部肌肉中表达 tagRFP PAB-1 的转基因动物进行体内分析。

在幼小动物中，tagRFP PAB-1 主要弥漫在整个咽部。随着年龄的增长，从咽后球开始，在明亮的点状物中逐渐积累。在衰老过程中，我们还观察到越来越多的动物在咽前球中聚集。

在野生型和 daf-2 突变体背景中随年龄变化的不同 tagRFP PAB-1 聚集水平的定量显示，在长寿动物中，tagRFP PAB-1 聚集随年龄的增长而强烈延迟。观看此视频后，您应该对如何收集大量蠕虫进行蛋白质提取以及如何分离高度不溶性大聚集体以便通过质谱或 SDS 页面进行进一步分析有很好的了解。