Name: 方法研究线虫线虫中固有的蛋白质聚集与年龄的变化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: 了解线虫衰老过程中蛋白质聚集变化的检测方法，使用C. elegans模型研究蛋白质不溶性与年龄的关系。该技术通过基因敲除评估蛋白质稳态对衰老的影响，为衰老生物学研究提供重要工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作由德国神经退行性疾病中心（DZNE）以及玛丽·居里国际回归基金（322120，授予 D.C.D.）资助。

<ol><li>Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adapting+proteostasis+for+disease+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Adapting proteostasis for disease intervention.</a> Science. 319, 916-919 (2008).</li>
<li>David, D. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23181070">Aging and the aggregating proteome.</a> Frontiers in genetics. 3, 247(2012).</li>
<li>Hartl, F. U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+chaperones+in+protein+folding+and+proteostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular chaperones in protein folding and proteostasis.</a> Nature. 475, 324-332 (2011).</li>
<li>Ayyadevara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-+and+Hypertension-Associated+Protein+Aggregates+in+Mouse+Heart+Have+Similar+Proteomic+Profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Age- and Hypertension-Associated Protein Aggregates in Mouse Heart Have Similar Proteomic Profiles.</a> Hypertension. 67, 1006-1013 (2016).</li>
<li>David, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+protein+aggregation+as+an+inherent+part+of+aging+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">Widespread protein aggregation as an inherent part of aging in C. elegans.</a> PLoS biology. 8, 1000450(2010).</li>
<li>Demontis, F., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FOXO%2F4E-BP+signaling+in+Drosophila+muscles+regulates+organism-wide+proteostasis+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">FOXO/4E-BP signaling in Drosophila muscles regulates organism-wide proteostasis during aging.</a> Cell. 143, 813-825 (2010).</li>
<li>Lechler, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+Insulin%2FIGF-1+Signaling+Restores+the+Dynamic+Properties+of+Key+Stress+Granule+Proteins+during+Aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">Reduced Insulin/IGF-1 Signaling Restores the Dynamic Properties of Key Stress Granule Proteins during Aging.</a> Cell reports. 18, 454-467 (2017).</li>
<li>Reis-Rodrigues, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+age-dependent+changes+in+protein+solubility+identifies+genes+that+modulate+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+cell%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of age-dependent changes in protein solubility identifies genes that modulate lifespan.</a> Aging cell. 11, 120-127 (2012).</li>
<li>Tanase, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Carbonyl+Modifications+on+Aging-Associated+Protein+Aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Role of Carbonyl Modifications on Aging-Associated Protein Aggregation.</a> Scientific reports. 6, 19311(2016).</li>
<li>Walther, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+Proteome+Remodeling+and+Aggregation+in+Aging+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Widespread Proteome Remodeling and Aggregation in Aging C. elegans.</a> Cell. 161, 919-932 (2015).</li>
<li>Lee, V. M., Wang, J., Trojanowski, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+paired+helical+filament+tau+and+normal+tau+from+human+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Purification of paired helical filament tau and normal tau from human brain tissue.</a> Methods in enzymology. 309, 81-89 (1999).</li>
<li>Goudeau, J., Aguilaniu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbonylated+proteins+are+eliminated+during+reproduction+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+cell%22%5BJournal%5D)">Carbonylated proteins are eliminated during reproduction in C. elegans.</a> Aging cell. 9, 991-1003 (2010).</li>
<li>Zimmerman, S. M., Hinkson, I. V., Elias, J. E., Kim, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproductive+Aging+Drives+Protein+Accumulation+in+the+Uterus+and+Limits+Lifespan+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">Reproductive Aging Drives Protein Accumulation in the Uterus and Limits Lifespan in C. elegans.</a> PLoS genetics. 11, 1005725(2015).</li>
<li>Uno, M., Nishida, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifespan-regulating+genes+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Npj+Aging+And+Mechanisms+Of+Disease%22%5BJournal%5D)">Lifespan-regulating genes in C. elegans.</a> Npj Aging And Mechanisms Of Disease. 2, 16010(2016).</li>
<li>Sulston, J. H. <a target="_blank" href="NULL">The Nematode Caenorhabditis elegans</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 587-606 (1988).</li>
<li>Maine, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+As+a+tool+for+understanding+germline+development+in+Caenorhabditis+elegans%3A+uses+and+cautions%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">RNAi As a tool for understanding germline development in Caenorhabditis elegans: uses and cautions.</a> Developmental biology. 239, 177-189 (2001).</li>
<li>Rauniyar, N., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isobaric+labeling-based+relative+quantification+in+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+proteome+research%22%5BJournal%5D)">Isobaric labeling-based relative quantification in shotgun proteomics.</a> Journal of proteome research. 13, 5293-5309 (2014).</li>
<li>Brignull, H. R., Morley, J. F., Garcia, S. M., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+polyglutamine+pathogenesis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Modeling polyglutamine pathogenesis in C. elegans.</a> Methods in enzymology. 412, 256-282 (2006).</li>
<li>Fay, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classical+genetic+methods%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Classical genetic methods.</a> WormBook. , 1-58 (2013).</li>
<li>Brunquell, J., Bowers, P., Westerheide, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorodeoxyuridine+enhances+the+heat+shock+response+and+decreases+polyglutamine+aggregation+in+an+HSF-1-dependent+manner+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Fluorodeoxyuridine enhances the heat shock response and decreases polyglutamine aggregation in an HSF-1-dependent manner in Caenorhabditis elegans.</a> Mech Ageing Dev. 141, 1-4 (2014).</li>
<li>Angeli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA+synthesis+inhibitor+is+protective+against+proteotoxic+stressors+via+modulation+of+fertility+pathways+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+%28Albany+NY%29%22%5BJournal%5D)">A DNA synthesis inhibitor is protective against proteotoxic stressors via modulation of fertility pathways in Caenorhabditis elegans.</a> Aging (Albany NY). 5, 759-769 (2013).</li>
<li>Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorodeoxyuridine+improves+Caenorhabditis+elegans+proteostasis+independent+of+reproduction+onset%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset.</a> PLoS One. 9, 85964(2014).</li>
<li>Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorodeoxyuridine+affects+the+identification+of+metabolic+responses+to+daf-2+status+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans.</a> Mech Ageing Dev. 133, 46-49 (2012).</li>
<li>Luo, S., Kleemann, G. A., Ashraf, J. M., Shaw, W. M., Murphy, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+and+insulin+signaling+regulate+reproductive+aging+via+oocyte+and+germline+quality+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TGF-beta and insulin signaling regulate reproductive aging via oocyte and germline quality maintenance.</a> Cell. 143, 299-312 (2010).</li>
<li>Andux, S., Ellis, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+maintains+oocyte+quality+in+aging+Caenorhabditis+elegans+females%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">Apoptosis maintains oocyte quality in aging Caenorhabditis elegans females.</a> PLoS genetics. 4, 1000295(2008).</li>
<li>Vilchez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RPN-6+determines+C.+elegans+longevity+under+proteotoxic+stress+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RPN-6 determines C. elegans longevity under proteotoxic stress conditions.</a> Nature. 489, 263-268 (2012).</li>
<li>Ghazi, A., Henis-Korenblit, S., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcription+elongation+factor+that+links+signals+from+the+reproductive+system+to+lifespan+extension+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">A transcription elongation factor that links signals from the reproductive system to lifespan extension in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS genetics. 5, 1000639(2009).</li>
<li>Shemesh, N., Shai, N., Meshnik, L., Katalan, R., Ben-Zvi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncoupling+the+Trade-Off+between+Somatic+Proteostasis+and+Reproduction+in+Caenorhabditis+elegans+Models+of+Polyglutamine+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Uncoupling the Trade-Off between Somatic Proteostasis and Reproduction in Caenorhabditis elegans Models of Polyglutamine Diseases.</a> Front Mol Neurosci. 10, 101(2017).</li>
<li>Kaletsky, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C.+elegans+adult+neuronal+IIS%2FFOXO+transcriptome+reveals+adult+phenotype+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The C. elegans adult neuronal IIS/FOXO transcriptome reveals adult phenotype regulators.</a> Nature. 529, 92-96 (2016).</li>
<li>Kawarabayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+changes+in+brain%2C+CSF%2C+and+plasma+amyloid+%28beta%29+protein+in+the+Tg2576+transgenic+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Age-dependent changes in brain, CSF, and plasma amyloid (beta) protein in the Tg2576 transgenic mouse model of Alzheimer's disease.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 372-381 (2001).</li>
<li>Kraemer, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegeneration+and+defective+neurotransmission+in+a+Caenorhabditis+elegans+model+of+tauopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Neurodegeneration and defective neurotransmission in a Caenorhabditis elegans model of tauopathy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 9980-9985 (2003).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文报道了一种从经历RNA干扰并用于质谱和蛋白质印迹分析的老年C. elegans中分离高度不溶性蛋白质聚集体的方法。我们发现，通过降低胰岛素/胰岛素样生长因子信号通路（IIS）来改善蛋白质稳态，可显著防止与年龄相关的蛋白质聚集。通过在C. elegans中选择性地过表达特定的易聚集蛋白质，可进一步解析调控固有蛋白质聚集的分子机制。
固有的年龄依赖性蛋白质聚集与疾病相关蛋白质聚集的对比 
本研究基于先前的研究发现，即蛋白质聚集并不局限于特定蛋白质在疾病背景下的聚集。通过关注内源性易聚集蛋白质，而非异位表达的疾病相关蛋白质，有望为蛋白质聚集过程的生理调控提供新的见解。由于年龄依赖性蛋白质聚集物存在于不同的细胞区域5，对其研究也应有助于揭示特定区室的质量控制机制。总体而言，调控固有蛋白质聚集的机制也可能在预防疾病相关蛋白质聚集中发挥重要作用。值得注意的是，尽管年龄依赖性蛋白质聚集在多个方面与疾病相关蛋白质聚集相似，但目前仍不清楚这些聚集物是否含有淀粉样纤维，而...

蛋白质错误折叠和聚集被认为是多种神经退行性疾病（如阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症（ALS）、额颞叶痴呆（FTD）以及其他许多疾病）的标志性特征。例如，在帕金森病患者中，α-突触核蛋白会组装成淀粉样纤维，并在黑质区域积聚形成路易小体；而在肌萎缩侧索硬化症患者中，TDP-43 或 FUS 蛋白发生错误折叠，进而在变性的运动神经元胞质中形成聚集体。在这些神经退行性疾病中，维持蛋白质稳态（即蛋白质内稳态）的机制均无法阻止错误折叠蛋白的积累，从而导致疾病的发生。
蛋白质稳态对于维持细胞功能至关重要，在正常条件下，这些调控机制可严格控制蛋白质的合成、折叠和降解速率。多项研究表明，随着衰老，许多细胞和器官维持蛋白质稳态的能力逐渐受损，而蛋白质稳态网络在生理上的老化性衰退是神经退行性疾病的重要加剧因素（详见参考文献1,2,3）。蛋白质质量控制能力以及细胞对未折叠蛋白应激的响应能力随年龄增长而下降，这一事实提示蛋白质错误折叠和聚集可能是衰老的普遍后果。事实上，我们及其他研究团队已证明，蛋白质聚集不仅限于疾病状态，而是部分蛋白质组在衰老动物体内会变得高度去垢剂不溶4,5,6,7,8,9,10。计算分析和体内研究表明，这些生理性衰老相关聚集物在多个方面与疾病相关的聚集物相似5。内源性、依赖年龄的蛋白质聚集现象的发现，使我们能够在不使用异位表达的人类疾病相关蛋白的情况下，解析调控蛋白质聚集的分子与细胞机制。目前，关于广泛性蛋白质不溶性的调控机制，以及这种失调对机体健康影响的研究仍十分有限。
线虫 C. elegans 是衰老研究中最广泛使用的模式生物之一，因其寿命相对较短，并表现出许多在高等生物中观察到的典型衰老特征。在 C. elegans 中，研究人员已通过基于差异溶解度的逐级生化分级方法，研究了衰老对蛋白质不溶性的影响，该方法在神经退行性疾病研究领域被广泛用于提取疾病相关的蛋白聚集体11。通过定量质谱分析，已有研究显示，在无疾病模型的情况下，数百种蛋白质在 C. elegans 中会变得易于聚集5。本文详细描述了在液体培养基中大量培养线虫的实验方案，以及通过逐级提取分离聚集蛋白的方法，以便通过质谱进行定量，并通过蛋白质印迹（Western blot）进行分析。由于错误折叠及易聚集的蛋白质会在衰老的 C. elegans 生殖腺中积累，从而掩盖其他体细胞组织中的变化5,12,13，我们采用一种缺失生殖腺的突变体，以将分析重点集中在非生殖组织中的蛋白质不溶性上。本方法可用于分析那些在0.5% SDS中高度不溶、且可通过相对较低离心速度沉淀下来的大型聚集体。此外，已有其他文献报道了另一种提取条件较温和的方案，可用于收集更小且溶解性更高的聚集体10。同时，本文还描述了用于在 C. elegans 中评估体内（in vivo）蛋白聚集的方法。
总体而言，这些方法结合RNA干扰（RNAi）可用于评估目的基因在调控年龄依赖性蛋白质聚集中的作用。为此，我们描述了对年轻和年老线虫的提取物进行分析的方法，这些线虫在有或无RNAi介导的特定目的蛋白敲低条件下培养。这些方法应成为确定蛋白质稳态网络中哪些组分调控蛋白质不溶性的有力工具。已有研究表明，多种干预措施（如降低胰岛素/胰岛素样生长因子（IGF）1信号通路（IIS））可显著延缓C. elegans的衰老过程14。寿命调控通路常可诱导蛋白质质量控制机制，因此这些通路可能主动影响蛋白质聚集的速率。例如，我们展示了在长寿动物中抑制IIS通路后，其固有的蛋白质聚集水平降低7。

<table><tbody><tr><td>Fernbach培养瓶&amp;nbsp;</td><td>康宁</td><td>4425-2XL</td><td>Pyrex，容量 2,800 ml，带 3 个挡板凹槽</td></tr><tr><td>膜片螺口盖&amp;nbsp;</td><td>Schott</td><td>1088655</td><td>GL45</td></tr><tr><td>往复式混合器</td><td>VWR</td><td>444-0148</td><td></td></tr><tr><td>分液漏斗</td><td>Nalgene</td><td>4300-1000</td><td>容量 1,000 ml</td></tr><tr><td>1 ml 注射器&amp;nbsp;</td><td>BD Plastipak</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>灰色针头，27 G × &amp;frac12; &quot;，0.4 mm × 13 mm</td><td>BD Microlance 3</td><td>300635</td><td></td></tr><tr><td>膜过滤器 0.025 &amp;micro;M</td><td>Millipore</td><td>VSWP04700</td><td></td></tr><tr><td>pH 试纸</td><td>Machery-Nagel</td><td>92110</td><td>pH-Fix 0-14</td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物</td><td>罗氏</td><td>4693132001</td><td>Complete Mini 无EDTA片剂&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>辛苯聚醇-9&amp;nbsp;</td><td>Applichem</td><td>A1388</td><td>Triton X-100</td></tr><tr><td>4-吗啉乙磺酸（MES）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1317</td><td></td></tr><tr><td>壬基酚聚氧乙烯醚</td><td>Applichem</td><td>A1694</td><td>Nonidet P40 (NP40)</td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>罗氏</td><td>04716728001</td><td>重组，无RN酶</td></tr><tr><td>RNaseA</td><td>Promega</td><td>A7973</td><td>溶液</td></tr><tr><td>总蛋白印迹染色</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>S11791</td><td>Sypro Ruby 蛋白印迹染色剂</td></tr><tr><td>总蛋白凝胶染色</td><td>Thermofisher</td><td>S12001</td><td>Sypro Ruby 蛋白凝胶染色剂</td></tr><tr><td>TCEP（三(2-羧乙基)膦盐酸盐）</td><td>塞尔瓦</td><td>36970</td><td></td></tr><tr><td>碘乙酰胺</td><td>塞尔瓦</td><td>26710</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢铵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>09830</td><td></td></tr><tr><td>测序级修饰胰蛋白酶</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>相对与绝对定量的同重元素标签</td><td>Sciex</td><td>4352135</td><td>iTRAQ 试剂多重试剂盒</td></tr><tr><td>Centrifuge Avanti J-26XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>393126</td><td></td></tr><tr><td>Optima Max-XP 超速离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>393315</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5424R</td><td>Eppendorf</td><td>5404000413</td><td></td></tr><tr><td>离心机 5702</td><td>Eppendorf</td><td>5702000329</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge Megafuge 40R</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>75004518</td><td></td></tr><tr><td>Concentrator Plus</td><td>Eppendorf</td><td>5305000304</td><td>离心蒸发仪</td></tr><tr><td>荧光体视显微镜 M165 FC&amp;nbsp;</td><td>Leica</td><td></td><td>使用 Planapo 2.0x 物镜</td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td></td><td>Leica S6E</td></tr><tr><td>高倍显微镜 Zeiss Axio Observer Z1</td><td>蔡司</td><td></td><td>使用 PlanAPOCHROMAT 20x 物镜和 Zeiss Axio Cam MRm</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>图像分析软件</td><td>ImageJ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>质谱数据分析</td><td>蛋白质探查者</td><td></td><td>http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;大肠杆菌菌株&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OP50</td><td>CGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;RNAi 细菌&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L4440</td><td>Julie Ahringer RNAi文库</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;em&gt;秀丽隐杆线虫&lt;/em&gt; 突变体&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CF2253</td><td>CGC，菌株名称：EJ1158&amp;nbsp;</td><td></td><td>基因型： &lt;em&gt;gon-2(q388)&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;em&gt;秀丽隐杆线虫&lt;/em&gt; 转基因技术&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DCD214</td><td>Della David 在德国神经退行性疾病中心（DZNE）的实验室&amp;uuml;bingen</td><td></td><td>基因型： &lt;em&gt;N2；uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>DCD215</td><td>Della David 实验室，德国神经退行性疾病中心（DZNE）T&amp;uuml;bingen</td><td></td><td>基因型： &lt;em&gt;daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]&lt;/em&gt;</td></tr></tbody></table>

研究固有蛋白质聚集随年龄变化的方法 秀丽隐杆线虫

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

近几十年来，神经退行性疾病（如阿尔茨海默病（AD）和帕金森病（PD））的发病率不断上升。这些与年龄相关的疾病特征是患者大脑中出现具有纤维结构的蛋白质聚集体。目前尚不完全清楚为何原本可溶性的蛋白质会经历聚集过程。近年来发现，蛋白质聚集不仅限于疾病状态，而是正常衰老过程的一部分，这使得研究人员能够在不使用异位表达的人类疾病相关蛋白的情况下，研究调控蛋白质聚集的分子与细胞机制。本文中，我们描述了通过互补方法在Caenorhabditis elegans中检测固有蛋白质聚集的技术。首先，我们介绍如何培养大量年龄同步化的C. elegans以获得老年个体，并提供用于分离高度不溶性大聚集体的生化实验流程。结合特异性基因敲低技术，可通过定量质谱进行系统性分析，或通过抗体进行候选蛋白分析，从而解析特定基因在促进或抑制年龄依赖性蛋白质聚集中的作用。随后，利用表达荧光标记的易聚集蛋白的转基因动物进行in vivo分析，以验证上述发现。这些方法将有助于阐明为何某些蛋白质在衰老过程中易于聚集，并最终揭示如何维持这些蛋白质的完全功能状态。

我们采用此处所述方法，评估了胰岛素/胰岛素样生长因子信号通路（IIS）减弱的长寿动物如何调控年龄依赖性蛋白质聚集。通过蛋白质印迹法（见步骤2.2，用于蛋白质印迹分析的快速不溶性蛋白质提取），我们分析了对照RNAi以及靶向胰岛素/类胰岛素生长因子-1受体daf-2的RNAi条件下，年轻（成虫第3天）和年老（成虫第18天）线虫的总蛋白含量及不溶性蛋白含量。我们未观察到总蛋白水平在衰老过程中或对照组与daf-2 RNAi组之间发生显著变化（图2A）。如预期，我们在对照组动物中检测到高度不溶性蛋白水平随年龄显著升高（图2B）。相比之下，在daf-2 RNAi的长寿动物中，蛋白质聚集倾向显著降低。对不溶性组分进行全蛋白染色显示，与同龄对照组相比，daf-2 RNAi组第18天线虫的提取物中蛋白条带模式复杂性较低。定量质谱分析表...

本文所介绍方法的目的是研究模式生物 C. elegans 在正常衰老过程中蛋白质的聚集现象。该实验方案是一种强大的工具，可用于研究随年龄增长而形成的高不溶性大分子聚集体，并确定蛋白质稳态的变化如何影响蛋白质聚集。

在过去的几十年中，阿尔茨海默病（AD）和帕金森病（PD）等神经退行性疾病的患病率不断上升。这些……

本实验的总体目标是检测秀丽隐杆线虫（C.elegans）在衰老过程中蛋白质不溶性的变化，并评估靶向基因敲降对这一衰老标志物的影响。该方法有助于回答衰老与蛋白质稳态领域中的一些关键问题，例如为何生物体随着年龄增长而无法维持健康的蛋白质组。该技术的主要优势在于能够在无疾病过程干扰的情况下，研究正常衰老过程中的蛋白质聚集现象。尽管该方法可用于研究秀丽隐杆线虫（C. elegans）中的蛋白质聚集，但也可适用于其他模式生物，例如用于研究小鼠中与年龄相关的蛋白质不溶性。开始处理时，向一个2,800毫升的Fernbach培养瓶中加入207.45毫升S Basal培养基，并根据随附的文字版实验方案添加其他试剂。加入终浓度为50微克/毫升的羧苄青霉素（Carbenicillin）和1毫摩尔的IPTG，然后用带膜的螺旋盖封闭培养瓶。从25摄氏度培养箱中取出L1期幼虫，转移至15毫升离心管中。在1,900 ×g条件下离心3分钟。离心后，弃去上清液。在显微镜下，计数每2微升中的L1幼虫数量，并对至少九滴样品的计数结果取平均值。随后，将50,000条线虫加入用于收集年轻线虫的四个 Fernbach 培养瓶中，将100,000条线虫加入用于收集老龄线虫的四个 Fernbach 培养瓶中（培养瓶已在前一步骤中准备好）。然后，根据线虫数量，按比例加入对照RNAi细菌和针对目标基因的RNAi细菌。加入细菌后，用S Basal补足线虫培养物体积至300毫升。将线虫培养物置于25°C摇床培养箱中，以150 rpm振荡培养至收获阶段。在培养的第二天或第三天收集幼虫，以测定蛋白质溶解度的基础水平。将蠕虫从一个烧瓶倒入分液漏斗中，在室温下静置沉降10分钟。待蠕虫沉降后，打开活塞，使蠕虫逐滴流入一个50毫升离心管中。接着，将蠕虫沉淀物分装至两个15毫升离心管中。用 M9 培养基将离心管补至 15 毫升，离心收集线虫。洗涤线虫时，弃去上清液，再用 M9 培养基将离心管补至 15 毫升，重复离心操作。洗涤完成后，将线虫转移至两个 50 毫升离心管中，并用预冷的 M9 培养基将总体积补至 20 毫升。为去除细菌和死亡的线虫，将两个20毫升的稀释线虫沉淀分别加入两个装有20毫升冰冻60%蔗糖溶液的50毫升离心管中。迅速离心处理。使用25毫升移液管，小心吸取最多15毫升的上层线虫层。将上层线虫直接放入预冷的含有37毫升M9培养基和辛基酚聚醚-9（octoxynol-9）的冰上溶液中。然后在4°C条件下，以2,700 × g离心3分钟，加速度设为9，减速度设为7。弃去上清液后，将沉淀物转移至四个15毫升离心管中，用冰预冷的M9培养基加octoxynol-9洗涤两次。然后，离心试管。弃去上清液，并用预冷的M9缓冲液加0.1%辛基苯氧基聚乙氧基乙醇（octoxynol-9）将试管补至15毫升刻度线。用预冷的M9缓冲液洗涤线虫，然后将四管样品合并为两管。将试管加液至15毫升后离心。弃去上清液，向两支试管中加入室温M9培养基，定容至4毫升总体积，于25°C在旋转摇床上旋转混匀40分钟。旋转后，用冰预冷的含octoxynol-9的M9培养基洗涤线虫两次。然后用M9缓冲液洗涤两次，并将线虫转移至一个离心管中。在收集前，用不含抑制剂的重装配缓冲液（RAB高盐提取缓冲液）洗涤线虫。去除上清液，直至虫体沉淀表面无液体残留。然后，估测蠕虫沉淀的体积，并加入等体积含有抑制剂的RAB缓冲液。准备一个装有一半液氮的50毫升离心管，置于干冰上，用巴斯德移液管吸取蠕虫，缓慢滴入管中。待液氮完全挥发后，将冷冻的蠕虫于-80摄氏度保存，直至后续处理。用液氮冷却研钵，并在干冰上进行动物组织破碎。将冷冻的蠕虫转移至预冷的研钵中，研磨2.5分钟。向粉末中加入100毫升液氮，再研磨2.5分钟。使用显微镜检查，确保虫体已破碎成小片段。然后将粉末转移至2毫升离心管中，并于-80摄氏度保存。在干冰上，每时间点每种RNAi细菌分别称取两份350毫克的研磨虫体，放入2毫升离心管中。为了去除高盐可溶性蛋白，向每管中加入两倍于已准备好的含抑制剂RAB重量的溶液，以及终浓度为1毫摩尔的PMSF、200单位/毫升的DNase I和100微克/毫升的RNase A，并在冰上溶解粉末。将悬浮液用1毫升注射器抽吸15次，然后在冰上孵育10分钟。在4°C条件下，以18,400 × g离心20分钟。穿过脂肪层，将含有高盐可溶性蛋白的上清液收集到每个条件对应的1个2毫升离心管中。去除脂肪并弃去。分装高盐可溶性蛋白样品，于-80摄氏度冷冻保存。为去除脂质，用700微升含有蛋白酶抑制剂且含1摩尔蔗糖但不含DNase I和RNase A的RAB缓冲液重悬沉淀。将悬液用注射器抽吸10次，并在冰上孵育5分钟。务必彻底移除上清液及脂质并弃去。为去除SDS可溶性蛋白，用700微升RIPA缓冲液重悬沉淀。将悬浮液用注射器反复抽吸10次，置于冰上孵育10分钟。在4°C条件下，以18,400 g离心20分钟。收集含有SDS可溶性蛋白的上清液，并分装后于-80°C冻存。每种条件下，将两个样本分别用500 µL RIPA裂解缓冲液溶解后合并，将悬浮液用注射器抽吸10次。注意彻底移除上清液并弃去。用400 µL 70%甲酸溶解最终含有高度不溶性蛋白的沉淀，并将悬浮液用注射器抽吸20次。将悬液在冰上孵育20分钟。将悬液转入超速离心管中离心，以去除线虫角质层碎片。收集含有高度不溶性蛋白质的上清液，并在-80摄氏度下冷冻保存。对年轻和年老线虫中不溶性蛋白质组分的总蛋白染色显示，对照组动物中高度不溶性蛋白质水平随年龄显著增加，而长寿动物中则无此现象。对PAB-1（一种含有预测的朊病毒样结构域的RNA结合蛋白）的抗体染色结果证实了质谱分析数据，即长寿动物在衰老过程中仍能维持PAB-1的可溶性状态。对在咽部肌肉中表达tagRFP标记PAB-1的转基因动物进行了体内分析。在幼龄动物中，tagRFP标记的PAB-1主要弥散分布于咽部。随着年龄增长，从后部咽球开始逐渐形成明亮的点状聚集。在衰老过程中，我们还观察到越来越多的动物在前部咽球出现聚集现象。在野生型和daf-2突变体背景下，对不同年龄阶段tagRFP PAB-1聚集水平的定量分析显示，在长寿动物中，tagRFP PAB-1的聚集随年龄增长显著延迟。观看本视频后，您应能充分掌握如何收集大量线虫用于蛋白质提取，以及如何分离高度不溶性的大分子聚集体，以便进一步通过质谱或SDS-PAGE进行分析。

methods-to-study-changes-inherent-protein-aggregation-with-age

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

方法研究线虫线虫中固有的蛋白质聚集与年龄的变化

本视频演示了一种 体内 基于成像的检测方法以确定由衰老引起的蛋白质稳态衰退。该检测方法利用 秀丽隐杆线虫...

基于荧光报告基因的麻痹检测法：一种评估年龄相关性多聚谷氨酰胺荧光报告基因进行性形成及其相关麻痹的技术Caenorhabditis elegans

为了研究蛋白质稳态、应激与衰老之间的关系，我们利用遗传操作简便的多细胞生物秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

使用 Caenorhabditis elegans 作为模式系统研究多细胞生物中的蛋白质稳态

荧光寿命成像可监测、量化并区分活体、衰老及应激状态下的秀丽隐杆线虫（C.

使用荧光寿命成像对衰老期间 C. Elegans 中的淀粉样蛋白结构进行表征

蛋白质稳态的衰退是衰老的一个标志，会促进神经退行性疾病的发生。我们提出了一种实验方案，通过异源表达与荧光报告蛋白融合的多聚谷氨酰胺重复序列，定量测量两种不同组织中秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

量化组织特异性蛋白质稳态衰退在 Caenorhabditis elegans 中的变化

本文介绍并描述了一种广泛可及的方法体系，利用一些多功能的线虫模型，包括由离子通道过度激活引起的细胞坏死和由蛋白质聚集物诱导的神经毒性模型，以监测并解析与年龄相关的神经退行性疾病的细胞与分子基础。...

模拟年龄相关性神经退行性疾病 秀丽隐杆线虫

以下方案描述了一种高通量工作流程的建立与优化，用于线虫培养、荧光成像及自动图像处理，以定量多聚谷氨酰胺聚集物，从而评估蛋白质稳态的变化。...

自动化聚集体定量分析 秀丽隐杆线虫

本文介绍了一种用于分析线虫Caenorhabditis...

监测蛋白质聚集动力学 在体 内 使用自动包涵体计数在 秀丽隐杆线虫

我们描述了一种新型的红色荧光蛋白（RFP）报告基因，该报告基因特异性地在黑腹果蝇（Drosophila）眼部表达。本文详细介绍了眼成虫盘的解剖方法，以及如何利用该报告基因辅助解剖并鉴定发育过程中眼部的特定细胞类型。...

一种新型RFP报告系统有助于可视化果蝇复眼原基盘 果蝇

本文介绍了一种利用灭活细菌在秀丽隐杆线虫（C.

基于固体平板的饮食限制方法 秀丽隐杆线虫

本文介绍了一种用于观察线虫秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

Caenorhabditis elegans早期胚胎发育的延时显微成像

了解线虫衰老过程中蛋白质聚集变化的检测方法，使用C. elegans模型研究蛋白质不溶性与年龄的关系。该技术通过基因敲除评估蛋白质稳态对衰老的影响，为衰老生物学研究提供重要工具。

研究固有蛋白质聚集随年龄变化的方法秀丽隐杆线虫

探索更多视频

研究固有蛋白质聚集随年龄变化的方法 秀丽隐杆线虫

探索更多视频

研究固有蛋白质聚集随年龄变化的方法秀丽隐杆线虫