Name: 利用生命病毒介导的人神经元转导研究头塔聚集的体外模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: 了解利用慢病毒介导的人神经元转导建立体外tau病变模型的方法。该技术可快速评估tau蛋白毒性并筛选潜在治疗药物，为神经退行性疾病研究提供可靠平台。

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作者谨此感谢阿尔伯特·爱因斯坦医学院的 Peter Davies 博士提供 PHF-1 和 CP13 抗体，以及德克萨斯大学西南医学中心的 Marc Diamond 博士提供 tau 蛋白表达质粒。本研究工作获得了阿尔茨海默病协会（项目编号：NIRG-14-322164）向 S.H.Y. 提供的资助，以及加州再生医学研究所（项目编号：TB1-01193）向 P.R. 提供的资助。

1. 培养基与试剂的准备
<ol>
	<li>在 4 °C 下解冻用于培养板包被的基底膜基质（切勿使基底膜基质升温，否则会凝固）。分装为 1 mL 等份，保存于 -20 °C 或 -70 °C。</li>
	<li>用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）将碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）重悬至 10 µg/mL，并分装为 10 µL 等份，于 4 °C 保存。</li>
	<li>向一个新开封的 500 mL 含谷氨酰胺的 DMEM/F12 培养基中加入 B27（10 mL）、N2（5 mL）和青霉素-链霉素（5 mL）。取 50 mL 此神经干细胞（NSC）培养基置于锥形管中，加入 10 µL 的 10 µg/µL bFGF（终浓度为 2 µg/mL）。将添加了 bFGF 的 NSC 培养基（NSC (+)bFGF）于 4 °C 保存。</li>
	<li>制备不含 bFGF 的培养基（(-)bFGF 培养基）时，采用与步骤 1.3 相同的配方，但不添加 bFGF。该培养基用于诱导神经干细胞向神经元分化，并用于分化后神经元培养物的维持。</li>
</ol>
2. 慢病毒载体构建
注意：在开始使用慢病毒载体之前，需确保实验室已获得使用生物安全二级（BSL-2）试剂的许可。此外，操作慢病毒载体时必须使用生物安全二级（BSL-2）的超净工作台、个人防护装备（PPE）以及相应的废弃物处理方法。
<ol>
	<li>从首选来源获取包装在慢病毒中的 tau 载体（有关载体信息，请参见 Sanders 等人10）。</li>
</ol>
3. 培养人类神经干细胞
注意： NSCs 通常以每平方厘米 100,000–150,000 个细胞的密度接种2 且大多数市售的NSCs以1 x 106 细胞/管。本方案已针对10 cm细胞培养皿进行优化（尽管也可使用其他规格的培养皿）；因此，若使用商业化获得的NSCs，则可能需要先在六孔板中进行扩增培养，以获得足够数量的细胞用于接种10 cm培养皿。本方案亦可适用于多种规格的细胞培养皿（但不包含NSCs传代操作的说明，相关方案可参见其他文献）。11,12).
<ol>
	<li>准备细胞培养板时，取出一份冻存的基底膜基质涂层，置于 4 °C 下解冻（可在接种细胞的前一天晚上将分装样品置于 4 °C 过夜）。将 385 µL 基底膜基质涂层加入 5 mL DMEM/F12 培养基 + 青霉素-链霉素中。 
	注意：5 mL DMEM/F12 培养基 + 青霉素-链霉素足以包被一个 10 cm 培养皿（该基底膜基质包被液 1 mL 可包被六孔板的一个孔）。或者，若需对细胞进行固定和免疫染色，或硫黄素染色，则将细胞培养于 24 孔板中的玻璃盖玻片上。
	<ol>
		<li>在将培养基和基质涂层加入培养皿前及操作过程中，均应保持其低温状态。将基底膜基质涂层加入培养皿后，置于 37 °C 培养箱中孵育 1 小时。为获得最佳包被效果，孵育时间不得超过或少于 1 小时。1 小时后，吸除细胞培养皿中的基底膜基质涂层。确保此步骤与神经干细胞（NSCs）准备接种的时间相匹配。 
		注意：若细胞非从冻存状态复苏，则跳过步骤 3.2，继续进行步骤 3.3。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>若从冻存的神经干细胞（NSC）库存中复苏细胞，取一管冻存细胞，在 37 °C 水浴中通过来回移动使其快速升温。解冻后，用 70% 乙醇喷洒管体，并将其转移至细胞培养超净台中。将细胞转移至约 10 mL DMEM/F12 + 青霉素-链霉素培养基中，在室温下以 1,000 × g 离心 5 分钟。吸除上清液，将细胞重悬于 NSC 培养基中。</li>
	<li>用 NSC 培养基稀释细胞，以获得适用于所用细胞培养容器的合适接种密度。 
	注意：例如，若将神经干细胞（NSCs）接种至六孔板中——六孔培养板每孔表面积为 9 cm2——需接种 900,000 至 1,350,000 个细胞。因此，含有 1,000,000 个细胞的一管细胞可重悬于 2 mL 培养基中，加入六孔板的一个孔中。</li>
	<li>将适量悬浮于 NSC 培养基中的细胞接种至已包被基底膜基质的培养皿中（接种密度为 100,000 个细胞/cm2），并每隔一天更换一次培养基（若使用冻存细胞，接种后次日更换培养基，之后每隔一天更换一次）。培养细胞至其融合度达到 75%–80%。 
	注意：细胞在接种后不久可能即达到 75%–80% 融合度，但若使用冻存细胞，可能需要更长时间。</li>
	<li>当神经干细胞（NSCs）融合度达到 75%–80% 时，开始神经元分化：移除含 bFGF 的 NSC 培养基（NSC (+)bFGF），更换为不含 bFGF 的 NSC 培养基（NSC (-)bFGF）。在此培养基中继续培养细胞（每隔一天更换一次培养基），至少持续 4 周。 
	注意：撤除 bFGF 后，细胞仍会继续分裂数天，因此细胞融合度可能达到 90–100%。经过 4 周培养后，细胞将获得神经元命运，可进行慢病毒处理。</li>
</ol>
4. 神经元培养物的转导与维持
<ol>
	<li>使用慢病毒转导神经元时，采用每细胞 3.4 × 105 可转导单位的滴度（一个100%汇合的10 cm培养皿约含有1000万个神经元）。将可转导单位用细胞培养基稀释至所需浓度后加入细胞中（使用细胞培养皿的正常培养基体积）。加入慢病毒两天后，用新鲜的不含bFGF培养基（不含慢病毒）洗涤细胞一次，并继续在不含bFGF培养基中常规培养。</li>
	<li>慢病毒转导后的处理：每隔一天更换一次细胞培养基（[-]bFGF培养基）以喂养转导后的神经元。转导后维持细胞培养约8周。定期在光学显微镜下观察细胞，以确保细胞存活。
	 
	注意：细胞稀疏或树突断裂是细胞失去活性的征兆。</li>
</ol>
5. 细胞成像
<ol>
	<li>活细胞成像 
	<ol>
		<li>转导后（加入慢病毒4天后），在具备活细胞成像功能的荧光显微镜下观察YFP信号。将细胞培养皿从培养箱中取出，并通过保持培养皿盖在上方来确保培养孔保持无菌状态。使用10倍物镜，激发波长约514 nm，发射滤光片约527 nm，对细胞进行成像。 
		注意：在施加慢病毒后6–8天，转导的细胞培养物中通常可见聚集体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>固定细胞染色（β-微管蛋白III标记与硫黄素染色）
	<ol>
		<li>为用多聚甲醛（PFA）固定细胞，移除生长在玻璃盖玻片上的转导神经元的培养基。用PBS洗涤细胞1次，弃去洗涤液，然后向盖玻片加入300–500 µL（若使用24孔板）4% PFA（溶于PBS中），室温孵育20分钟。移除PFA后，用PBS洗涤盖玻片2次。</li>
		<li>配制封闭液，包含PBS、3%牛血清白蛋白（BSA）和0.3% Triton X-100。向各孔加入300–500 µL封闭液，将盖玻片在4 °C孵育2小时。2小时后，将一抗（抗体稀释比例为1:500）用封闭液稀释，并向每孔加入300–500 µL一抗溶液。将培养板置于摇床或旋转平台（低速）上，4 °C孵育过夜。</li>
		<li>次日，移除一抗溶液，用PBS洗涤盖玻片3次，每次5分钟。将二抗用封闭缓冲液稀释（稀释比例为1:1,000），并向每孔加入二抗溶液。选择合适的二抗时，应使用荧光标记不与YFP信号重叠的二抗（例如CY-3）。将细胞置于摇床或旋转平台上，室温孵育2小时。2小时后，移除二抗溶液，用PBS洗涤盖玻片3次，每次10分钟。</li>
		<li>用双蒸水（DDW）洗涤盖玻片10分钟。移除DDW后，向每孔加入300 µL 0.015%硫黄素-S（溶于50%乙醇中），孵育10分钟。移除硫黄素溶液后，用50%乙醇洗涤盖玻片2次，每次4分钟；随后用30%乙醇洗涤1次，4分钟；再用30%乙醇洗涤2次，每次5分钟。在封片前，用DDW洗涤盖玻片1次。 
		注意：步骤5.2.4中描述的硫黄素染色为可选步骤。</li>
		<li>将盖玻片封固于载玻片上时，取一滴封片介质滴加在载玻片的“+”面。移除含玻璃盖玻片孔中的所有液体，用精细镊子小心取出盖玻片，并注意记录哪一侧为培养细胞面。</li>
		<li>用镊子夹住盖玻片，轻轻将其边缘接触Kimwipe纸以去除多余水分。仍用镊子夹持盖玻片，使细胞面朝向封片介质液滴，先将盖玻片边缘接触液滴，然后轻轻将盖玻片放置于封片介质上（使培养的细胞进入封片介质中，并夹在盖玻片与载玻片之间）。让封片介质在成像前硬化30分钟。载玻片可于-20 °C保存以供后续使用。</li>
		<li>使用荧光显微镜及相应的激发/发射光谱（YFP = ~514/527 nm，CY-3 = ~555/568 nm，硫黄素S = ~390/426 nm）对细胞进行成像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 可选方法
<ol>
	<li>每隔2天，从培养物中收集条件培养基，并于 -20 °C 保存，用于后续分析培养物释放的tau蛋白亚型。</li>
</ol>

<ol><li>Rojas, J. C., Boxer, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegenerative+disease+in+2015%3A+Targeting+tauopathies+for+therapeutic+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurology%22%5BJournal%5D)">Neurodegenerative disease in 2015: Targeting tauopathies for therapeutic translation.</a> Nature Reviews Neurology. 12 (2), 74-76 (2016).</li>
<li>Kadavath, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+stabilizes+microtubules+by+binding+at+the+interface+between+tubulin+heterodimers%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tau stabilizes microtubules by binding at the interface between tubulin heterodimers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (24), 7501-7506 (2015).</li>
<li>Wang, Y., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+in+physiology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurology%22%5BJournal%5D)">Tau in physiology and pathology.</a> Nature Reviews Neurology. 17 (1), 5-21 (2016).</li>
<li>Gomez-Ramos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+and+consequences+of+muscarinic+receptor+activation+by+tau+protein%5BTitle%5D)+AND+%22European+Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Characteristics and consequences of muscarinic receptor activation by tau protein.</a> European Neuropsychopharmacology. 19 (10), 708-717 (2009).</li>
<li>Warmus, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau-mediated+NMDA+receptor+impairment+underlies+dysfunction+of+a+selectively+vulnerable+network+in+a+mouse+model+of+frontotemporal+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Tau-mediated NMDA receptor impairment underlies dysfunction of a selectively vulnerable network in a mouse model of frontotemporal dementia.</a> Journal of Neuroscience. 34 (49), 16482-16495 (2014).</li>
<li>DeVos, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+reduction+in+the+presence+of+amyloid-beta+prevents+tau+pathology+and+neuronal+death+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Tau reduction in the presence of amyloid-beta prevents tau pathology and neuronal death in vivo.</a> Brain. 141 (7), 2194-2212 (2018).</li>
<li>Cheng, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+reduction+diminishes+spatial+learning+and+memory+deficits+after+mild+repetitive+traumatic+brain+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Tau reduction diminishes spatial learning and memory deficits after mild repetitive traumatic brain injury in mice.</a> PLOS ONE. 9 (12), e115765(2014).</li>
<li>Ando, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+human+mutant+tau+aggregation+by+knocking+out+murine+tau+in+a+transgenic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Accelerated human mutant tau aggregation by knocking out murine tau in a transgenic mouse model.</a> The American Journal of Pathology. 178 (2), 803-816 (2011).</li>
<li>Reilly, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+human+neuronal+tau+model+exhibiting+neurofibrillary+tangles+and+transcellular+propagation%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Novel human neuronal tau model exhibiting neurofibrillary tangles and transcellular propagation.</a> Neurobiology of Disease. 106, 222-234 (2017).</li>
<li>Kfoury, N., Holmes, B. B., Jiang, H., Holtzman, D. M., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-cellular+Propagation+of+Tau+Aggregation+by+Fibrillar+Species%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Trans-cellular Propagation of Tau Aggregation by Fibrillar Species.</a> The Journal of Biological Chemistry. 287 (23), 19440-19451 (2012).</li>
<li>Yuan, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-surface+marker+signatures+for+the+isolation+of+neural+stem+cells%2C+glia+and+neurons+derived+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Cell-surface marker signatures for the isolation of neural stem cells, glia and neurons derived from human pluripotent stem cells.</a> PLOS ONE. 6 (3), e17540(2011).</li>
<li>Marchenko, S., Flanagan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passaging+human+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Passaging human neural stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (7), e263(2007).</li>
<li>Lathuiliere, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motifs+in+the+tau+protein+that+control+binding+to+microtubules+and+aggregation+determine+pathological+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Motifs in the tau protein that control binding to microtubules and aggregation determine pathological effects.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13556(2017).</li>
<li>Asai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+microglia+and+inhibition+of+exosome+synthesis+halt+tau+propagation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Depletion of microglia and inhibition of exosome synthesis halt tau propagation.</a> Nature Neuroscience. 18 (11), 1584-1593 (2015).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案描述了一种体外人源tau蛋白病模型的建立方法，该模型可形成银染阳性聚集物和硫黄素阳性神经原纤维缠结（NFTs）。此外，转导后的细胞表现出tau蛋白诱导的病理特征，如形态学缺陷、突触生成减少以及溶酶体体积增大。本方案的主要优势在于提供了一种易于获取且成本较低的神经元tau蛋白病模型，可用于药物筛选研究以及tau蛋白毒性的分析。该模型填补了神经退行性疾病研究中的材料需求空白，因为目前人源tau蛋白病细胞系尚未广泛可得，而使用来源于小鼠神经元的转基因tau蛋白则需要动物繁育，且受限于不同物种间神经元特性的差异。
除了上述步骤外，本实验的成功还依赖于若干关键步骤。首先，必须确保使用正确的病毒滴度，因为如果病毒滴度太低，细胞培养物将无法形成聚集体。其次，应妥善维持神经干细胞（NSC）培养物，并确保其融合度不超过约80%。NSC过度生长会导致过早分化。最后，在从NSC中撤除bFGF培养基后，需等待整整4周，以使神经元培养物充分分化。这一时间长度对于确保神经元的成熟至关重要。
尽管上述方法是构建体外tau蛋白病模型的有效手段，但该方案...

微管相关蛋白tau的病理性聚集是多种神经退行性疾病（包括阿尔茨海默病（AD）、额颞叶痴呆（FTD）、皮克病和进行性核上性麻痹（PSP））的典型特征1。在非疾病状态下，tau蛋白可结合并稳定神经元轴突中的微管纤维2。然而，与疾病相关的tau蛋白过度磷酸化会促进其聚集、脱离微管，并导致神经元毒性3。聚集态tau蛋白的毒性作用可能涉及胆碱能4和谷氨酸能受体5的异常激活，从而引起细胞内钙离子稳态失调，并最终导致细胞死亡。在动物模型中，降低脑内tau蛋白水平可改善阿尔茨海默病小鼠6以及反复轻度创伤性脑损伤小鼠模型7的病理表现。
越来越多的证据表明，小鼠来源的tau蛋白在结构和结合亲和力方面与人源tau蛋白存在差异，且小鼠tau蛋白不适合用于模拟人类tau蛋白病8。然而，目前 commercially 可获得的人类细胞tau蛋白病模型尚不广泛。本研究的总体目标是建立一种体外tau蛋白聚集模型，其中人源神经元被转导携带突变人源tau构建体的慢病毒载体9。诱导tau蛋白聚集的慢病毒构建体编码含有P301L和V337M突变的tau重复结构域，并与YFP报告基因融合（Tau-RDLM-YFP），而对照构建体则编码野生型（Wt）tau重复结构域与YFP报告基因的融合蛋白（Tau-Wt-YFP）。采用该方法转导的神经元培养物中tau蛋白表达量约为未转导培养物的九倍。尽管Tau-RDLM-YFP和Tau-Wt-YFP转导细胞中tau蛋白的过表达水平大致相等，但仅有转导了Tau-RDLM-YFP的神经元出现蛋白聚集。使用Tau-RDLM-YFP转导的培养物对硫黄素染色呈阳性，并表现出轴突长度缩短和突触密度降低。因此，该细胞模型可能成为研究体外tau蛋白聚集的有用工具。

<table><tbody><tr><td>10 cm 培养皿</td><td>Thermofisher</td><td>12556002</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>Biopioneer</td><td>CNT-15</td><td></td></tr><tr><td>16% 多聚甲醛</td><td>Thermofisher</td><td>50-980-487</td><td></td></tr><tr><td>24 孔细胞培养板</td><td>Thermofisher</td><td>930186</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>Biopioneer</td><td>CNT-50</td><td></td></tr><tr><td>喷雾瓶中的 70% 乙醇</td><td>多种来源</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>B27 添加剂</td><td>Thermofisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>基底膜基质（Matrigel）</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）</td><td>Biopioneer</td><td>HRP-0011</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养孵箱</td><td>多种来源</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>多种来源</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>含谷氨酰胺的 DMEM-F12 培养基</td><td>Thermofisher</td><td>10565042</td><td></td></tr><tr><td>乙醇（浓度 50% 或更高）</td><td>多种来源</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>荧光标记的二抗</td><td>多种来源，依实验而定</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>多种来源</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>玻璃盖玻片</td><td>Thermofisher</td><td>1254581</td><td></td></tr><tr><td>载玻片</td><td>Thermofisher</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>人神经干细胞</td><td>多种来源</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>慢病毒载体</td><td>多种来源</td><td>定制</td><td></td></tr><tr><td>封片剂</td><td>Thermofisher</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>N2 添加剂</td><td>Thermofisher</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Thermofisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Thermofisher</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>一抗</td><td>多种来源，依实验而定</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>摇床或旋转平台</td><td>多种来源</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>无菌细胞培养操作台</td><td>多种来源</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>硫黄素 S</td><td>Sigma</td><td>T1892-25G</td><td></td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>Thermofisher</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>多种来源</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

一种利用慢病毒介导的人类神经元转导研究 tau 蛋白聚集的体外模型

An In Vitro Model for Studying Tau Aggregation Using Lentiviral-mediated Transduction of Human Neurons

蛋白tau的异常聚集在包括阿尔茨海默病（AD）在内的多种神经退行性疾病中具有致病作用。尽管tau蛋白病的小鼠模型为研究聚集态tau的神经毒性机制提供了宝贵的资源，但越来越多的证据表明，由于物种间神经生理学的差异，小鼠大脑并不适合模拟人类疾病状态。细胞培养技术的进步使得人类神经元培养物可在体外实验中被获取，并促进了神经治疗药物的开发。然而，尽管已建立了人类神经元细胞培养体系，目前仍缺乏广泛应用的体外人类tau蛋白病模型。本方案描述了一种tau蛋白聚集的细胞模型，其中人类神经元被转导携带编码致病性突变tau蛋白的慢病毒载体，该tau蛋白与黄色荧光蛋白（YFP）报告分子融合。转导后的神经元培养物可形成tau蛋白聚集体，可被硫黄素染色阳性标记，并表现出神经毒性的相关特征，例如轴突长度减少和溶酶体体积增大。该方法可能是一种研究人类tau蛋白病的有用且经济高效的模型。

经 Tau-RDLM-YFP 转导的神经元通过 YFP 进行了荧光标记，而 RDLM 转导的培养物在转导后出现聚集物。这些包涵体对硫黄素呈阳性染色（图1）。如图1所示，本方案可获得呈现硫黄素阳性 tau 蛋白聚集物的神经元培养物。在初始实验中，建议通过免疫标记神经元特异性标志物 β-微管蛋白 III 来确认神经元的分化。重要的是，荧光标记的二抗应选择激发/发射光谱不与 YFP 重叠的染料（例如 Cy3）。尽管在未染色的情况下即可观察到黄色荧光的 tau 聚集体，但仍建议使用硫黄素进行成像，以确认荧光信号来源于聚集的 tau 蛋白，而非细胞碎片。此外，图1中的示例未包含 DAPI 染色以标记细胞核，因为 DAPI 的激发/发射光谱与硫黄素-S 重叠；如需同时显示细胞核，应选用其他与硫黄素-S 兼容的核染料。
<img alt="荧光显微镜示意图：β-III-微管蛋白、硫黄素、YFP；蛋白质染色分析。" cl...

本方案详细描述了一种将编码突变人源tau蛋白的慢病毒载体转导至人神经元培养物中的实验方法。经转导的培养物可出现tau蛋白聚集物及相关病理学特征。

一种利用慢病毒介导的人类神经元转导研究 Tau 蛋白聚集的体外模型

蛋白tau的异常聚集在包括阿尔茨海默病（AD）在内的多种神经退行性疾病中具有致病作用。

本方案详细描述了一种人类tau蛋白病的体外模型。该方法填补了相关材料需求，可能对药物筛选和疾病机制研究具有帮助。该技术的主要优势在于，与动物实验相比，细胞培养模式能够更快速地评估tau蛋白的毒性及潜在的tau蛋白治疗手段。开始此实验前，需在4摄氏度条件下解冻用于培养板包被的基底膜基质。取一毫升等分试样，于负20或负70摄氏度保存。接下来，用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）将碱性成纤维细胞生长因子重悬，浓度为每毫升10微克。取10微升等分试样，于4摄氏度保存。然后准备一瓶新开封的500毫升含谷氨酰胺的DMEM-F12培养基。加入10毫升B27、5毫升N2和5毫升青霉素-链霉素，以配制神经干细胞培养基。取50毫升NSC培养基加入锥形管中，并加入10微升已配制好的bFGF。将此 NSC 加 bFGF 培养基于 4°C 保存。首先，从冷冻箱中取出一份冷冻保存的细胞培养板用基底膜基质包被物，置于 4°C 下解冻。将 385 µL 解冻后的基底膜基质包被物加入含青霉素-链霉素的 5 mL DMEM-F12 培养基中。若细胞来自冻存的NSC储备，从冰箱中取出一管冻存细胞，通过在37摄氏度水浴中来回移动试管使其温育融化。随后，用70%乙醇喷洒试管表面。然后在细胞培养超净台内，将细胞转移至约10毫升含青霉素-链霉素的DMEM-F12培养基中。在室温下以1,000 × g离心5分钟。然后吸除培养基，并将细胞重悬于NSC培养基中。用NSC培养基稀释细胞，以获得适用于所用细胞培养容器的合适接种密度。加入足量悬浮于NSC培养基中的细胞，接种至包被有基底膜基质的培养皿中。将细胞置于37°C、5%二氧化碳条件下培养，直至细胞融合度达到75%至80%，期间每隔一天更换一次培养基。若需用慢病毒转导神经元，请使用每细胞340,000个可转导单位的滴度。将可转导单位用细胞培养基稀释至所需浓度后加入细胞中。添加慢病毒两天后，用不含bFGF的新鲜培养基洗涤细胞一次。随后在37摄氏度、5%二氧化碳条件下，继续在不含bFGF的培养基中培养细胞。转导后将细胞培养约八周，每隔一天更换一次细胞培养基。使用倒置显微镜常规观察细胞，确保细胞存活状态良好。转导后从培养箱中取出培养皿时，务必保持皿盖盖好，以维持培养环境的无菌状态。使用能够进行活细胞成像的荧光显微镜，在10倍物镜下以514纳米激发光和527纳米发射滤光片观察细胞。本研究中，经tau-RDLM-YFP慢病毒感染的神经元通过YFP进行荧光标记。RDLM病毒感染的培养细胞在感染后可见形成聚集体。这些包涵体对硫黄素染色呈阳性。通过在培养物中对神经元特异性标志物β-微管蛋白III进行免疫标记，可确认神经元分化。需要注意的是，荧光标记的二抗的激发-发射光谱不应与YFP的光谱重叠。尽管在未染色的情况下也可观察到黄色荧光的 tau 蛋白聚集体，但仍应使用硫黄素进行成像，以确认荧光信号来源于聚集的 tau 蛋白而非细胞碎片。在成功构建 tau 蛋白过表达细胞后，可进行多种关于神经元健康状况和 tau 蛋白聚集的评估。例如，我们发现这些细胞会出现轴突退行性变。除了细胞培养研究外，我们还使用该方法来检测外泌体来源的 Tau 蛋白的致病性。

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利用生命病毒介导的人神经元转导研究头塔聚集的体外模型

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慢病毒介导的人类神经元转导用于 Tau 蛋白聚集分析

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体外 使用过度磷酸化 Tau 蛋白的聚集实验

蛋白质聚集体（即蛋白毒性种子）在细胞间的转移可能介导了神经退行性疾病病理过程的进展。本文介绍了一种新型的FRET流式细胞术检测方法，可实现对重组或生物样品中种子活性的特异且灵敏的检测。...

利用FRET流式细胞术灵敏检测蛋白质病理性种子活性

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外源性施加与微粒体相关的α-突触核蛋白聚集体至原代神经元：一种高效的纤维形成细胞模型

本文所述的tau蛋白聚集检测方法模拟了预期的tau蛋白聚集特征 体内...

体外 Tau蛋白聚集研究及药物筛选实验

本文介绍一种基于细胞的检测方法，用于定量评估小胶质细胞对tau蛋白的摄取，旨在建立一种研究工具，以更深入地表征抗tau抗体作用机制。...

基于细胞的检测方法研究小胶质细胞介导的抗体清除Tau蛋白

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通过调节 Tau 蛋白的亚细胞定位研究疾病相关基因的表达

研究和理解帕金森病的发病机制需要一种α-突触核蛋白的体内生理模型。我们描述了一种利用人源化酵母模型监测α-突触核蛋白细胞毒性及聚集体形成的方法。...

一种利用人源化酵母模型研究α-突触核蛋白毒性和聚集的方法

在此，我们演示如何将原代海马神经元的转染与活细胞共聚焦成像相结合，以分析病理蛋白诱导的轴突运输变化，并鉴定介导这些效应的分子机制通路。...

利用活细胞成像技术测定病理性蛋白对原代海马神经元轴突运输的影响

多聚谷氨酰胺脊髓小脑性共济失调由CAG重复扩增引起，导致易于聚集的蛋白质产生。本方案描述了载体构建、立体定位注射以及包涵体和神经元标志物丢失的分析方法，为研究神经退行性疾病的发病机制及评估靶向治疗策略提供了一个可控的实验平台。...

慢病毒诱导的纹状体病理作为多聚谷氨酰胺脊髓小脑性共济失调的临床前模型

了解利用慢病毒介导的人神经元转导建立体外tau病变模型的方法。该技术可快速评估tau蛋白毒性并筛选潜在治疗药物，为神经退行性疾病研究提供可靠平台。

一种利用慢病毒介导的人类神经元转导研究 Tau 蛋白聚集的体外模型

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