一种利用慢病毒介导的人类神经元转导研究 Tau 蛋白聚集的体外模型

本方案详细描述了一种人类tau蛋白病的体外模型。该方法填补了相关材料需求，可能对药物筛选和疾病机制研究具有帮助。该技术的主要优势在于，与动物实验相比，细胞培养模式能够更快速地评估tau蛋白的毒性及潜在的tau蛋白治疗手段。开始此实验前，需在4摄氏度条件下解冻用于培养板包被的基底膜基质。

取一毫升等分试样，于负20或负70摄氏度保存。接下来，用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）将碱性成纤维细胞生长因子重悬，浓度为每毫升10微克。取10微升等分试样，于4摄氏度保存。

然后准备一瓶新开封的500毫升含谷氨酰胺的DMEM-F12培养基。加入10毫升B27、5毫升N2和5毫升青霉素-链霉素，以配制神经干细胞培养基。取50毫升NSC培养基加入锥形管中，并加入10微升已配制好的bFGF。

将此 NSC 加 bFGF 培养基于 4°C 保存。首先，从冷冻箱中取出一份冷冻保存的细胞培养板用基底膜基质包被物，置于 4°C 下解冻。将 385 µL 解冻后的基底膜基质包被物加入含青霉素-链霉素的 5 mL DMEM-F12 培养基中。

若细胞来自冻存的NSC储备，从冰箱中取出一管冻存细胞，通过在37摄氏度水浴中来回移动试管使其温育融化。随后，用70%乙醇喷洒试管表面。然后在细胞培养超净台内，将细胞转移至约10毫升含青霉素-链霉素的DMEM-F12培养基中。

在室温下以1,000 × g离心5分钟。然后吸除培养基，并将细胞重悬于NSC培养基中。用NSC培养基稀释细胞，以获得适用于所用细胞培养容器的合适接种密度。

加入足量悬浮于NSC培养基中的细胞，接种至包被有基底膜基质的培养皿中。将细胞置于37°C、5%二氧化碳条件下培养，直至细胞融合度达到75%至80%，期间每隔一天更换一次培养基。若需用慢病毒转导神经元，请使用每细胞340,000个可转导单位的滴度。

将可转导单位用细胞培养基稀释至所需浓度后加入细胞中。添加慢病毒两天后，用不含bFGF的新鲜培养基洗涤细胞一次。随后在37摄氏度、5%二氧化碳条件下，继续在不含bFGF的培养基中培养细胞。

转导后将细胞培养约八周，每隔一天更换一次细胞培养基。使用倒置显微镜常规观察细胞，确保细胞存活状态良好。转导后从培养箱中取出培养皿时，务必保持皿盖盖好，以维持培养环境的无菌状态。

使用能够进行活细胞成像的荧光显微镜，在10倍物镜下以514纳米激发光和527纳米发射滤光片观察细胞。本研究中，经tau-RDLM-YFP慢病毒感染的神经元通过YFP进行荧光标记。RDLM病毒感染的培养细胞在感染后可见形成聚集体。

这些包涵体对硫黄素染色呈阳性。通过在培养物中对神经元特异性标志物β-微管蛋白III进行免疫标记，可确认神经元分化。需要注意的是，荧光标记的二抗的激发-发射光谱不应与YFP的光谱重叠。

尽管在未染色的情况下也可观察到黄色荧光的 tau 蛋白聚集体，但仍应使用硫黄素进行成像，以确认荧光信号来源于聚集的 tau 蛋白而非细胞碎片。在成功构建 tau 蛋白过表达细胞后，可进行多种关于神经元健康状况和 tau 蛋白聚集的评估。例如，我们发现这些细胞会出现轴突退行性变。

除了细胞培养研究外，我们还使用该方法来检测外泌体来源的 Tau 蛋白的致病性。