使用免疫组化检测脑组织中异常的朊病毒蛋白

拍摄一张载玻片，其中固定的哺乳动物大脑切片显示错误折叠的朊病毒蛋白聚集体。

用甲酸处理切片以降低朊病毒聚集体的传染性。

水合压力室内用酸性缓冲液处理。高温和酸性 pH 值会破坏固定诱导的蛋白质交联，揭开抗原表位。

入过氧化氢中以灭活内源性过氧化物酶，防止不必要的背景染色。

载玻片放入盖板中并添加缓冲液以保持组织水合作用。

引入封闭溶液，防止非特异性抗体结合。

添加对朊病毒聚集体特异性的一抗。

去除未结合的抗体分子。引入与一抗结合的生物素化二抗。

去除未结合的抗体分子。添加与亲和素复合的生物素化过氧化物酶，该酶与二抗上的生物素结合。

添加显色底物，过氧化物酶将其氧化成有色产品。

使用显微镜观察染色的聚集体。

室温下小心地将组织切片浸入 98% 甲酸中 30 分钟。用自来水冲洗切片 5 分钟，然后用蒸馏水冲洗两次。在装有 500 毫升蒸馏水的压力室中使用不锈钢染色容器，在 98 摄氏度下预处理 10 毫摩尔柠檬酸盐缓冲液 20 分钟。

出于质量控制目的，在篮子上放置一段粘性高压灭菌器指示胶带以监测温度和压力。一旦警报指示设备已达到程序时间和温度，就用载玻片浸入篮子中。接下来，在压力室上启动程序以设置点二，并记录该程序的初始和最终压力。

为了灭活内源性过氧化物酶，将装有样品切片的载玻片篮浸入3%过氧化氢甲醇浴中30分钟。在流水下冲洗切片 5 分钟。引流后，将切片浸入三缓冲盐水中再浸泡 5 分钟。对于免疫检测，将每张载玻片放在用 Tris 缓冲盐水预先润湿的市售盖板支架上。

纸巾面朝向支架，滑动边缘与支架的两个下点重合，确保避免气泡。用拇指和食指握住滑轨支架组件。将一根手指放在样品载玻片的顶部，另一根手指放在支架的底部。然后将装配体放在系统的图库中。

为确保套件组装良好，请用三缓冲盐水填充样品载玻片和支架之间的孔，不要溢出。从这一点开始，确保在支架和载玻片之间必须保留大约 80 微升 Tris 缓冲盐水。不要让切片干燥。

用一抗处理之前，通过将载玻片样品与与二抗宿主相同的 20% 正常血清在 Tris 缓冲盐水中预孵育 30 分钟，以减少背景染色。在不清洗切片的情况下，将 200 微升一抗溶液直接施用于载玻片支架组的每个孔中，并在室温下孵育 60 分钟。

要清洗切片，请用三缓冲盐水填充孔，并等待 5 分钟。重复洗涤两次。接下来，用10%马血清在三缓冲盐水中以1至200浓度稀释生物素化二抗。

根据要处理的切片数量修复所需的体积。将 200 微升二抗溶液应用于载玻片支架组的每个孔中。在室温下孵育30分钟后，重复Tris缓冲盐水洗涤。

对于与亲和素-生物素复合物过氧化物酶孵育，请在使用前 30 分钟准备试剂。并在载玻片板支架的每个孔中施用 200 微升溶液。完成后，将板架在室温下孵育 30 分钟。