一种基于免疫荧光的定量癌细胞复制应力的方法

从携带 IdU（胸苷核苷酸的合成替代品）的癌细胞开始，已经整合到它们的 DNA 中。当这些细胞遇到复制应激时，它们的 DNA 合成就会停止，从而在暴露的单链 DNA 区域中显示 IdU。

固定细胞并添加洗涤剂分子，使细胞膜具有渗透性。

添加 BSA 以阻断非靶标抗体结合位点。

引入与 IdU 标记的单链 DNA 相互作用的抗 IdU 抗体。

添加靶向抗 IdU 抗体的绿色荧光团标记的二抗。去除未结合的抗体。

盖玻片放在载玻片上，载玻片上含有含有荧光染料的封片介质，该载体会染色细胞核。

在荧光显微镜下，观察蓝色细胞核。

绿色荧光病灶代表与单链DNA结合的抗体。

计算病灶的数量以量化复制应力水平。

放置在24孔板孔中的聚-L-赖氨酸盖玻片上加入1毫升细胞悬液，并在标准条件下在培养基中生长细胞。在一次群体倍增后，从板中吸出现有培养基，并用 10 微摩尔 IdU 脉冲细胞进行随后的两次群体倍增。

要收获细胞，请用冰冷的 0.5% PBSTx 在冰上放置培养基 5 分钟。为了固定细胞，吸出PBSTx，并在室温下将细胞与3%多聚甲醛孵育15分钟。用PBS洗涤3至4次后，将固定细胞保持在4摄氏度直至进一步使用。

固定后，在冰上使用 0.5% PBSTx 透化细胞 5 分钟，确保覆盖整个盖玻片。在室温下用1毫升0.2%PBST洗涤细胞3至4次后，吸出PBST，并封闭样品，使用PBS制成的5%BSA在室温下30分钟。

对于免疫染色，将湿纸巾放在平底特百惠上，准备一个加湿室。用封口膜盖住 24 孔板盖。将其放入加湿室中，并将盖玻片放在板盖上。在盖玻片顶部加入 60 微升稀释的抗 BrdU 小鼠一抗。

或者，为了减少抗体的干燥并使用更少的体积，将一滴稀释的抗体滴在封口膜上，然后将盖玻片翻转到其上。然后，在37摄氏度下孵育1小时。孵育后，吸出一抗。

将盖玻片放回 24 孔板中，并用 0.2% PBST 洗涤 4 次。如前所述，在盖玻片上加入稀释的二抗，并在室温下在黑暗中孵育一小时。标记显微镜载玻片，并用 DAPI 封固剂将盖玻片安装在载玻片上。如果封片介质需要固化或硬化，请将载玻片在室温下避光保存 24 小时。