基于开源软件的通用显微镜数据中荧光标记物高内涵单细胞定量分析工作流程

本实验的总体目标是通过定量显微镜图像中特定荧光标记的强度，客观地测量单个细胞的反应。该目标的实现分为两个步骤：首先，对贴壁培养的组织细胞进行小干扰RNA介导的基因敲低；其次，对细胞进行多种目标标记物的荧光染色，随后进行成像。

在最后一步中，特定亚细胞区域内的标志物表达通过算法进行定义，并针对单个细胞进行分析。最终，可通过测量目的标志物的荧光表达水平及其亚细胞转位情况，来分析细胞对基因敲低所产生的生物学信号的响应。尽管该实验流程可为研究 siRNA 处理下 G1 期细胞周期进程的调控机制提供深入见解。

该方法还可应用于生成荧光细胞图像、研究核转运和蛋白质稳态的研究。演示该实验步骤的是我实验室的博士后研究员 Daniel Wek 和 Car K HO。首先，在无菌组织培养操作台中，将 70 微升稀释于 irna 缓冲液中的 200 纳摩尔 irna 加入无菌 96 孔板的相应孔中。然后，将 105 微升转染脂质稀释于 40 体积的无血清 DMEM 培养基中，加入每孔 sirna 中。通过轻轻振荡使 96 孔板在室温下混匀，10 分钟后，将所得的 175 微升混合液分装至不透光、带透明底的 96 孔组织培养板中，每靶标分为三个 50 微升的重复孔。

随后，将8,000个细胞溶于150微升含10%血清的DMEM中，每孔直接加入含有50微升脂质-iRNA复合物的孔板中，无需混匀。然后用无菌透气胶膜密封孔板，并将孔板置于37°C、5%二氧化碳的湿化培养箱中孵育。48小时后，从孔板中吸除培养基。

然后在通风橱中，于室温下用100微升4%多聚甲醛缓冲液固定细胞。10分钟后，吸去固定液，并用100微升PBS洗涤三次，每次洗涤后均吸去PBS。最后一次洗涤后，去除PBS，并加入100微升通透化溶液，室温孵育10分钟，重复此步骤三次，孵育过程中不摇动。最后一次孵育结束后，吸去通透化溶液，每孔加入100微升封闭液，室温孵育30分钟。

然后吸除封闭液，并在标记后两周内加入50微升目标一抗对细胞进行孵育。使用配备20倍物镜的共聚焦显微镜，分别在三个通道中采集16位灰度TIFF图像，对应DNA染料、GFP和免疫荧光染色。Flora fours采集多组不重叠的图像集或帧，以覆盖每孔约1000至2000个细胞。系统地命名图像文件并包含元数据信息，使每个文件名均为实验名称、孔位地址、帧编号和通道标识符的唯一组合。

然后打开 Cell Profiler 软件，点击文件并导入流程。接下来，在“来自文件”选项下，选择三通道流程 CP 管道文件（three channels pipeline CP pipe file），该文件包含软件解析图像文件元数据所需的指令，元数据来源于保存的文件名命名规范。现在可以使用 Cell Profiler 对图像进行关联，从文件中提取细胞核 DNA 和抗体信号强度，并利用 GFP 通道计算细胞核与细胞质信号强度的比值。对于检测到的每个细胞，点击“查看输出设置”按钮，然后点击默认输入和默认输出文件夹。

分别选择用于分析的图像文件位置以及提取数据的保存位置。然后在分析模块窗口中，点击相应的眼睛图标，以在分析过程中查看“识别初级对象”和“识别三级对象”窗口，并在分析完成后点击“分析图像”。在消息框中点击“确定”，然后前往默认的输出文件夹位置，所有数据文件均以逗号分隔值文件的形式保存。

为了执行数据提取，请在 Cell Profiler 输出结果中找到新生成的细胞核 CSV 文件，该文件包含单个细胞的荧光核抗体强度、核 DNA 强度以及 GFP-CDK2 报告基因比值的个体细胞数据。将提供的 Pulse Script 文件复制到与细胞核 CSV 数据文件相同的文件夹中，然后双击 Pearl Script 的图标。

当提示时，输入数据文件的完整名称，后跟一个点 CSV 文件名，该文件用于对细胞进行设门，并包含抗体荧光和 G FP CDK2 报告基因数据的门控值。确认新创建的文件将来自原始细胞数据谱的单个细胞检测原始值与亚群标签合并，以显示每个孔中每个细胞在两个门控条件下的表现。现在打开 R Studio 软件，通过单击“文件”并选择“打开文件”，然后选择提供的分析脚本 dot r 文件，使用单个细胞亚群标签绘制每种实验条件下的数据图。

输入包含已设门数据的文件夹的计算机地址，包括驱动器字母以及文件本身的名称。然后在工作室左上窗口中选中第1行至第17行，点击运行按钮，以输入实验数据的阈值及孔位信息。最后，依次选中第17行以下剩余代码的各个独立代码块，并点击运行按钮，生成相应的图表。

观察工作室右下角窗口中的图表，然后点击导出按钮，以多种格式保存这些图表。此处描述的工作流程可分析荧光显微镜图像，生成以列表形式呈现的原始数据，列表中包含每个被识别细胞及其相应的检测值。这些数据具有多种分析选项。

例如，在这些直方图中，经对照RNA处理的细胞的检测值可用于确定适当的设门阈值，以对每项检测进行划分。随后通过脉冲脚本应用这些设门阈值，根据检测结果对原始数据中的每个细胞进行标记。这种标记方法有助于初步的视觉观察，以及对处理条件与大量单细胞数据亚群分布之间关系的自动化分析。

例如，在本项代表性实验中，三种 siRNA 敲低条件下，细胞相对于两个检测中设门的分布呈现出不同的结果。R 图利用标签计算各象限中细胞的百分比分布。这些标签还可将额外的荧光测量结果与检测数据进行交叉比对。

在本实验中，经SI CDK六处理的细胞亚群根据各自的检测标签进行分组，并绘制为细胞核DNA染色的直方图。利用细胞数据标签可揭示两种细胞检测方法与细胞DNA含量之间的关系。在执行该操作时，使用Cell Profiler时务必始终记得测试并调整图像分割参数。

首次使用新的或未经测试的图像文件时，这一点尤为重要。好的。