Name: 工作流的高含量，荧光标记的万能工具显微镜数据，支持开源软件的单个细胞定量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: 了解使用Cell Profiler和R Studio进行高内涵荧光显微图像分析的计算流程。该方法通过siRNA基因敲除和荧光标记，实现单细胞核质标志物定量及亚细胞定位分析，为细胞生物学研究提供可靠的数据支持。

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本工作由英国癌症研究中心（CRUK）基金项目15043和CRUK 14251资助。
感谢 Daniel Wetterskog 和 Ka Kei Ho 提供技术协助以及对文稿的审阅。

1. 反应标志物的实验扰动与细胞标记（反向转染siRNA筛选）
<ol>
	<li>在无菌细胞培养罩中，将70 µl含200 nM siRNA的1× siRNA缓冲液加入无菌空白96孔板的各孔中。将转染脂质稀释至40倍体积的无血清DMEM培养基中，并向含siRNA的各孔中加入105 µl。 
	注意：将262.5 µl脂质稀释于10.5 ml无血清DMEM中，可制备适用于整块96孔板的主混合液，每孔提供2.6 µl脂质。本步骤使用200 nM siRNA起始浓度，将在步骤1.3中获得20 nM的工作浓度；但实验也可在低至5 nM的工作浓度下进行，相应调整起始浓度（即 50 nM）。较低的工作浓度可能减少脱靶假阳性信号，但也可能减弱靶向响应强度，从而增加靶向假阴性率。</li>
	<li>在室温下轻轻振荡混匀平板10分钟。将所得的175 µl混合液分装为每靶标三个50 µl重复样，转移至带有透明底的不透明、经组织培养处理的96孔板中。</li>
	<li>通过直接向每孔50 µl脂质-siRNA复合物上加入含10%血清的DMEM培养基中的8,000个细胞（体积为150 µl）进行反向转染。使用稳定表达GFP标记、用于报告CDK2活性的HCT116人结直肠癌细胞5,8。无需进一步混匀。用无菌透气粘性膜密封平板以控制湿度并防止“边缘效应”，并将平板置于37 °C、5% CO2的加湿培养箱中孵育48小时。</li>
	<li>吸除培养基，使各孔中保留少量残留液体。通过向每孔加入100 µl 4%缓冲甲醛溶液固定细胞，并在室温下于通风橱中孵育10分钟。</li>
	<li>通过吸除方式移除固定液。此时可选择终止实验：用100 µl磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤平板三次，随后在4 °C避光条件下，以100 µl PBS密封保存，最多可保存一周；或继续进行细胞通透化处理。 
	注意：建议在固定后尽快处理平板，通常更倾向于保存已完成全部处理的平板。可添加生物杀菌防腐剂（如硫柳汞、叠氮化钠或商用替代品）以防止微生物生长。添加磷酸酶抑制剂有助于保护磷酸化表位，在相关检测背景下，其他维持蛋白质修饰状态的方法也可能有益。</li>
	<li>移除平板中的PBS，并通过向每孔加入100 µl通透化溶液进行细胞通透化处理。室温下静置孵育10分钟，不摇动。使用多通道移液器吸除通透化溶液。重复此步骤三次。</li>
	<li>通过向每孔加入100 µl封闭液，在室温下封闭30分钟。通过吸除方式移除封闭液，然后在室温避光条件下，用50 µl以封闭液按500倍稀释的抗P-S780 RB1抗体探针孵育2小时。</li>
	<li>用100 µl洗板液洗涤平板三次，每次在板上停留5分钟。在4 °C避光条件下，用50 µl以封闭液按1,000倍稀释并添加2 µM染色质特异性DNA染料Hoechst（Bisbenzimide）的荧光标记二抗探针孵育过夜。按前述方法洗涤平板三次，并在4 °C避光条件下以100 µl PBS密封保存。在两周内完成成像。</li>
</ol>
2. 成像与图像分割
<ol>
	<li>使用配备 20X 物镜的共聚焦或转盘式荧光显微镜，分别采集对应于 DNA 染料、GFP 和免疫染色荧光染料的三个通道的 16 位灰度 TIFF 图像。采集大量无重叠的图像集（此处称为帧），以覆盖每孔约 1,000–2,000 个细胞。</li>
	<li>系统命名图像文件，使每个文件名按顺序唯一地包含“实验名称”、“孔位地址”、“帧编号”和“通道标识符”&#160;（图 3）。示例数据集使用“Blue”（染色质 DNA 染色）、“Green”（GFP）或“Red”（免疫染色荧光染料）作为通道标识符。孔位地址、帧编号和通道标识符在后文中统称为图像元数据。使用下划线符号以避免孔位和帧元数据之间产生混淆。</li>
	<li>按指定顺序命名文件中的这些元数据元素。这是确保后续软件步骤能够正确分组图像集以供分析的必要条件。</li>
	<li>下载并安装免费软件 Cell Profiler、Active Perl 社区版、R 统计编程环境和 RStudio。安装过程中接受所有默认选项；安装 Active Perl 的 PC 用户应在提示时启用与 PATH、文件扩展名关联和脚本映射相关的所有选项。Mac 用户可选择是否安装 Active Perl，否则需通过终端命令行运行第 3.2 步的 Perl 脚本，而非通过图标点击运行。</li>
	<li>打开 Cell Profiler 软件，点击“文件”、“导入流程”然后选择“从文件”，并选中文件 3_channels_pipeline.cppipe（图 S1A &#38; S1B）。该文件包含必要的指令，使软件能够根据前述文件命名规则解析图像文件的元数据。Cell Profiler 现在将关联图像，从中提取细胞核 DNA 和抗体信号强度，并利用 GFP 通道计算每个被检测细胞的细胞核与细胞质信号强度比值（图 4 &#38; 图 5）。</li>
	<li>点击 Cell Profiler 窗口左下角的“查看输出设置”按钮。在新窗口顶部，有标为“默认输入文件夹”和“默认输出文件夹”的文本框。依次点击这些文本框右侧的文件夹图标，分别选择待分析图像文件的存放位置以及提取数据的输出目标位置（图 S1C）。</li>
	<li>点击 Cell Profiler 窗口左下角的“分析图像”按钮，开始图像分析。在屏幕底部可查看剩余分析时间，以及“停止分析”和“暂停”按钮。如需暂停分析，可随时点击“暂停”按钮，这在观察正在分析的图像时尤为有用（见步骤 2.8 的说明）。</li>
	<li>可选：点击程序窗口最左侧面板中的眼睛图标，打开任意图像分析步骤的窗口（图 S1D）。观察“IdentifyPrimaryObjects”窗口以及“Secondary”和“Tertiary Objects”窗口，以检查 Cell Profiler 中当前用于图像分割的设置是否合适（参见 图 1 和讨论部分，获取修改这些设置的建议）。</li>
	<li>分析完成后，点击弹出消息框中的“确定”按钮。前往“默认输出文件夹”位置，所有结果数据文件将以逗号分隔值（.csv）格式保存（图 S2A）。</li>
</ol>
3. 数据提取
<ol>
	<li>找到新文件“细胞核.csv ”，该文件包含来自Cell Profiler输出的单个细胞数据，如荧光核抗体强度、核DNA强度以及GFP-CDK2报告基因比值图6A &amp;#38; S2A). 
	注意：不同的实验室可根据各自检测方法的特点对本类数据进行相应处理。建议根据抗体数据和GFP-CDK2报告基因值，使用所提供的Perl脚本对各处理条件下的细胞进行设门分析2_gate_classifier.pl.</li>
	<li>复制提供的 Perl 脚本文件‘2_gate_classifier.pl 与‘相同的文件夹中细胞核.csv’ 数据文件（图S2A）。双击 Perl 脚本的图标，当系统提示时，输入数据文件的完整文件名，接着输入用于保存待设门细胞数据的文件名（需以“.csv”为扩展名），最后输入抗体荧光和 GFP-CDK2 报告基因数据的设门阈值。 
	注意：如何主要确定门控设置并将其应用于数据分析，将在下文的代表性数据部分进行讨论。 图6 （分析所提供数据时，请分别使用“0.004”和“1.5”）。Mac 用户应通过终端命令行输入“perl 2_gate_classifier.pl”来运行 Perl 脚本。</li>
	<li>观察新创建的文件，该文件将来自原始 Cell Profiler 数据的单个细胞检测原始值与亚群标签合并，显示了每个孔中每个细胞在两个门控条件下的表现情况图6C).</li>
	<li>使用 RStudio 软件打开提供的数据文件，通过“文件”菜单选择“打开文件”，然后选择所提供的“，利用各个实验条件下单个细胞亚群标签绘制数据图分析.r’ 文件。观察绘图命令 图6B, 7 和 8 在 RStudio 的左上窗口中图S2B）。在左上角窗口中，于第5行和第6行的双引号符号之间，输入包含门控数据文件夹的计算机地址。分别包含驱动器字母以及文件本身的名称（例如，“C:/analysis folder/analysis output”和“nuclei_gated.csv”). 
	注意：如果在某台计算机上首次使用 RStudio，则需要先安装 R 的图形包“ggplot2”。此步骤仅在新安装 RStudio 后执行一次，之后无需重复。要安装“ggplot2”，请单击 RStudio 右下角窗口上方的“Packages”选项卡，然后单击其下方出现的“Install Packages”按钮。此时将弹出一个新窗口，在该窗口的“Packages”输入框中键入 ggplot2（无需输入引号），最后单击“Install”按钮以关闭窗口、安装所需的 ggplot2 功能，并返回主 RStudio 窗口继续执行步骤 3.6。</li>
	<li>在 RStudio 左上方窗口中高亮第 1 至 17 行，然后点击“Run”按钮。这将把实验数据、阈值以及孔位信息输入到 R 中图 S2CR 现在将临时保存用于绘图的相关数据。</li>
	<li>在第17行下方，高亮显示剩余代码的各个代码块，并像之前一样通过点击“Run”按钮生成相应的图表。在RStudio右下角的窗口中观察图表，并通过点击“Export”按钮以多种格式保存图表图 S2D).</li>
	<li>关闭 RStudio 时，当系统提示保存，点击“不保存”。这可以避免下次使用 RStudio 时产生混淆，否则其会保留上一次会话的数据。</li>
</ol>

<ol><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler%3A+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7 (10), 100(2006).</li>
<li>Khan, A., Eldaly, H., Rajpoot, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gamma-gaussian+mixture+model+for+detection+of+mitotic+cells+in+breast+cancer+histopathology+images%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol+Inform%22%5BJournal%5D)">A gamma-gaussian mixture model for detection of mitotic cells in breast cancer histopathology images.</a> J Pathol Inform. 4, 11(2013).</li>
<li>Selzer, P., Beibel, M., Gubler, H., Parker, C. N., Gabriel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+multivariate+data+analysis+strategies+for+high-content+screening%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">Comparison of multivariate data analysis strategies for high-content screening.</a> J Biomol Screen. 16 (3), 338-347 (2011).</li>
<li>Lyman, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+content%2C+high-throughput+analysis+of+cell+cycle+perturbations+induced+by+the+HSP90+inhibitor+XL888%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High content, high-throughput analysis of cell cycle perturbations induced by the HSP90 inhibitor XL888.</a> PLoS One. 6 (3), e17692(2011).</li>
<li>Richardson, E., Stockwell, S. R., Li, H., Aherne, W., Cuomo, M. E., Mittnacht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism-based+screen+establishes+signalling+framework+for+DNA+damage-associated+G1+checkpoint+response%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mechanism-based screen establishes signalling framework for DNA damage-associated G1 checkpoint response.</a> PLoS One. 7 (2), e17692(2012).</li>
<li>Heynen-Genel, S., Pache, L., Chanda, S. K., Rosen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+and+high-content+screening+for+target+discovery+and+deconvolution%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Functional genomic and high-content screening for target discovery and deconvolution.</a> Expert Opin Drug Discov. 7 (10), 955-968 (2012).</li>
<li>Krausz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-content+siRNA+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biosyst%22%5BJournal%5D)">High-content siRNA screening.</a> Mol Biosyst. 3 (4), 232-240 (2007).</li>
<li>Gu, J., Xia, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Cycle-dependent+Regulation+of+a+Human+DNA+Helicase+That+Localizes+in%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Damage+Foci.+Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Cell Cycle-dependent Regulation of a Human DNA Helicase That Localizes in.</a> DNA Damage Foci. Mol Biol Cell. 15 (7), 3320-3332 (2004).</li>
<li>Mittnacht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+pRB+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Control of pRB phosphorylation.</a> Curr Opin Genet Dev. 8 (1), 21-27 (1998).</li>
<li>Mittnacht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinoblastoma+protein--from+bench+to+bedside%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The retinoblastoma protein--from bench to bedside.</a> Eur J Cell Biol. 84 (2-3), 97-107 (2005).</li>
<li>Nybo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFP+imaging+in+fixed+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">GFP imaging in fixed cells.</a> BioTechniques. 52 (6), 359-360 (2012).</li>
<li>Schwartz, R. L., Foy, B. D., Phoenix, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchwartz%2C+RL+%22Learning+Perl+-+Making+Easy+Things+Easy+and+Hard+Things+Possible%22">Learning Perl - Making Easy Things Easy and Hard Things Possible</a>. , 6th ed, O'Reilly Media. 1-363 (2011).</li>
<li>Wickham, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWickham%2C+H+%22ggplot2%3A+Elegant+Graphics+for+Data+Analysis%22">ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis</a>. , Springer. New York. 978-970 (2009).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露

本文所述工作流程是一种利用siRNA对细胞进行多孔板扰动，随后进行标志物检测，并最终通过一系列软件支持的步骤，从获得的荧光显微图像中提取定量数据的方法。该方法侧重于获取单个细胞的细胞核和细胞质强度值，在多种基于细胞的应用中具有广泛的实用价值。此处使用的示例数据来自一项siRNA筛选实验，其中测试了两种针对G1期细胞周期进程的荧光检测方法，并将其结果与核DNA含量的更直接的生物物理测量结果进行关联分析。
使用荧光DNA染料对细胞核DNA进行成像，是图像分割过程中不可或缺的步骤，因为它能够识别单个细胞，所生成的“细胞核掩膜”可作为识别相应细胞质区域的起点。细胞中稳定表达的GFP标记CDK2报告分子，在细胞质中产生强度可变但始终高于背景信号的荧光，从而可清晰界定该区室。相同的分析流程也可适用于利用其他合适的荧光标记报告分子研究蛋白质转位事件及其对扰动的响应。此外，若将GFP-CDK2报告分子替换为特异性标记细胞质的荧光染料，则可另辟途径利用该算法测量图像中细胞质的尺寸以及细胞之间的相对大小。
此处所述图像分割策略中的另一个设计考虑是使用 Cell Profiler 获取用于DNA定量的积分强度值。对细胞核DNA染色数据的强度值进行积分，可兼容细胞核大小的可能差异，并且与碘化丙啶染色的FACS数据中观察到的定量特征高度一致。然而，在评估蛋白质功能时，积分强度可能并非合适的方法，因为相较于细胞区域内蛋白质（及其相关荧光）的总积分量，平均浓度（以抗原荧光的平均强度为例）在生物学上更具相关性。因此，对于P-S780 RB1和GFP数据，采用的是平均强度值。在Cell Profiler软件的“ExportToSpreadsheet”面板中，可选择在两种数据评估模式（平均或积分）之间进行切换。
文件 3_channels_pipeline.cppipe 中的分析设置已针对示例数据集中的图像进行了优化。使用本方案分析新的图像数据集时，文件名需采用上述命名约定（图3）。此外，可能需要在 Cell Profiler 设置中调整适用于新图像数据集中核DNA染色亮度的灵敏度值以及背景强度的阈值。鉴于DNA染色在构建各类图像分割掩膜中的关键作用，为该通道设置正确的灵敏度参数，是利用Cell Profiler软件成功分析新图像数据的关键。所提供的Cell Profiler设置文件（3_channels_pipeline.cppipe）中包含了最常用参数的注释，用于指导如何将分析流程适配至新数据。这些注释位于Cell Profiler主窗口屏幕顶部的文本框中，包括如何更改灵敏度设置以及调整待分析通道数量的指导说明。如方案第2.8节所述，为测试新图像数据的设置，可能需要通过点击“Identify…Objects”各步骤旁的“眼睛”图标来查看图像分割过程（图S1D）。特别是通过“IdentifyPrimaryObjects”进行图像数据可视化时，可判断DNA染色图像中的细胞核掩膜是否被正确识别。在Cell Profiler软件的“IdentifyPrimaryObjects”模块页面中，包含一个阈值校正因子。通过反复试验调整该值，可解决大多数细胞核识别错误问题。该值用于平衡每幅图像中DNA通道信号与背景强度的关系。阈值校正因子通常以1为基准：大于1表示更严格（适用于清晰图像），小于1则表示更宽松（适用于染色与背景对比度较低的图像）。
Cell Profiler 输出的单细胞原始数据可根据其他研究的需求以多种方式进行分析。此处展示的是使用 Perl 脚本对每个细胞测量的两个参数施加门控，以帮助从数据中提取生物学趋势，并允许将鉴定出的亚群与额外的测量结果进行交叉比对。尽管同样可以在 Cell Profiler 框架内实现门控功能，但此处采用的替代方法在处理大规模数据集时提供了更高的灵活性和速度。当前方案在图像采集后的最慢步骤是运行 Cell Profiler 软件。此处运行 Cell Profiler 时不设置门控，以生成未门控的原始数据集，随后可通过 Perl 脚本更快地重新分析，并在需要时使用不同的门控值进行迭代分析。并非所有研究都能预先确定合适的门控值，因为门控值可能随不同试剂或数据集而变化，甚至可能随时间变化。因此，建议生成直方图，展示来自 Cell Profiler 的阳性对照和模拟扰动细胞的原始数据分布，以确定感兴趣参数的合适门控值。
Perl 脚本被编写为接受来自 Cell Profiler 的严格定义的列结构数据，如果用户通过“ExportToSpreadsheet”设置修改了 Cell Profiler 输出的参数数量，脚本可能会停止工作。为了帮助实施设置的修改，Perl 脚本文件中包含了相关说明。要查看这些说明，请在文本编辑器中打开脚本，建议使用支持对 Perl 元素进行语法高亮的编程专用文本编辑器例如，http://www.activestate.com/komodo-edit）。这些注释指明了在数据格式发生变化时应调整脚本的位置。与提供的 Perl 脚本类似，所提供的 R 代码文件（analysis.r)，包含根据图像分析数据绘制图表的操作说明，可用文本编辑器或 RStudio 软件打开，以查看有关使用和修改的附加说明。这些说明可结合正则表达式和 Perl 的详细信息进行补充12 以及 ggplot213 用于R的软件包，二者分别构成数据读取、注释和绘图的基础。
利用荧光显微镜开展的新研究，以及随开源出版物一同发布的原始数据，均适用于本文所述的分析方法。高内涵数据本身的特性决定了其适合进行递归分析，不同研究者可根据各自的研究兴趣，侧重不同的分析方向。尽管对数据所能提出的问题受限于最初使用的探针，但图像数据通常能够被有意义地重新分析，其应用范围往往可超越原始研究的范畴。

本文介绍了一种利用免费软件Cell Profiler对贴壁细胞的荧光显微镜图像进行算法引导式分析的方法，以识别单个细胞及特定的亚细胞区域。该方法被称为图像分割，可通过量化每个细胞或亚细胞区域（即分割对象）中荧光标记的定位信号，实现对成像细胞的多参数分析。该工作流程为高内涵分析提供了基础，旨在为缺乏专用高内涵仪器或商业软件的研究实验室提供一种可进一步开发和修改的工具，用于开展多参数的单细胞分析。随本文提供的文件包括一组用于测试的相关原始图像数据、算法设置以及生成所述分析结果所需的辅助脚本。所提供的Cell Profiler算法设置已针对示例数据集进行了优化，讨论部分详细说明了在应用其他研究中的图像数据时可能需要进行的调整。
使用 Cell Profiler 提取定量数据后，不同实验室可能对如何利用原始数据中各个细胞的数值有不同的要求；此处展示了一种针对每项检测将门控应用于原始数据的方法。通过这些门控，数据被转化为响应的二元形式，从而能够可视化不同处理与门控所定义的响应细胞亚群之间的趋势关联。门控的设定基于对每项相关测量指标的适当阴性对照和阳性对照所获得的数据分布的观察。使用门控仅是管理基于细胞的原始测量数据的一种示例方法。此处还展示了将细胞核 DNA 强度测量值以其原始形式作为连续数值范围，与门控数据结合使用的方式。根据研究性质的不同，还应考虑其他管理图像分析数据的方法；已有文献报道了将细胞分配至亚群时替代门控的统计学方法2，以及对在大量参数基础上汇总高内涵数据策略的系统性比较研究3。
高内涵图像数据分析已广泛应用于药物反应、反向遗传学以及环境胁迫信号通路的细胞研究中4–6。高内涵分析的优势在于，通过对荧光显微图像数据进行算法分析，可同时获取单个细胞的定量与空间参数信息7。通过这种方法，可对多个检测结果进行交叉比对，追踪实验条件下由检测定义的细胞亚群的差异性行为，并将形态学变量纳入分析考量。本文所讨论的策略与分析流程，与其他高内涵方法类似，均能够提供与单个细胞相对应的多重数据。高内涵方法适用于生成荧光显微图像的研究，可分析的数据范围广泛，既包括传统荧光显微镜低通量实验产生的数十幅图像，也包括自动化高内涵筛选平台产生的数千幅图像。
此处以示例数据说明该工作流程，其中分别通过核荧光标记强度或荧光报告蛋白的核/胞质转位来测量不同的检测指标。该工作流程具有灵活性，可根据不同研究者提出的具体科学问题，单独或联合使用上述检测方法。示例数据来源于一项RNA干扰（RNAi）实验（图1）。实验中使用小干扰RNA寡核苷酸（siRNA）在HCT116人结直肠癌细胞中敲低特定蛋白，从而引起两种细胞周期依赖性激酶（CDK）活性荧光报告系统的信号变化。通过抗体染色检测视网膜母细胞瘤蛋白在丝氨酸780位点（P-S780 RB1）上由CDK6介导的磷酸化水平。在同一细胞中，通过绿色荧光蛋白标记的CDK2活性报告蛋白（GFP-CDK2报告蛋白）的核/胞质分布比例来评估其活性：当CDK2无活性时，该报告蛋白定位于细胞核内；而当CDK2被激活后，报告蛋白则从细胞核转运至胞质8。此外，使用DNA嵌入染料双苯并咪唑（Bisbenzimide）对每个细胞的核DNA进行染色，用于识别细胞、界定图像中细胞核的边界，并通过DNA含量评估细胞所处的细胞周期阶段（图2）。
当细胞从细胞周期的G1期过渡到S期时，CDK6和CDK2的活性可被检测到5，且二者依次相继激活9,10，因此在单个细胞中，预期这两种报告分子之间具有高度一致性。本示例所用的演示数据集分析了靶向CDK6、视网膜母细胞瘤蛋白（RB1）的siRNA以及一个非靶向阴性对照的效果（表1）。CDK6的敲低应导致P-S780 RB1表位减少，并引起细胞在细胞周期G1期的积聚。RB1的敲低则作为磷酸化-S780抗体特异性的试剂对照。实验采用经甲醛固定11并进行荧光染色的HCT116组织培养细胞，通过荧光显微镜成像，并利用算法进行图像分析。所得的数值数据随后用于交叉比对报告分子，评估不同敲低状态的影响。
此类分析所产生的数据量可能非常庞大，给常规分析工具带来挑战。例如，单个细胞的数据量可能超过某些电子表格软件所能容纳的范围。为此提供了 Perl 脚本，可用于对数据进行简单、高度重复且需人工监督的处理，以辅助大规模数据集的分析。这些 Perl 脚本专为 Cell Profiler 生成的输出文件编写，适用于处理采用特定文件命名规则的图像文件（图3），并支持在分析中使用每个孔中可变数量的视野。通常有必要对单细胞检测数据进行设门处理，以追踪细胞亚群中的变化趋势5，此处展示了如何使用 Perl 脚本根据每种检测类型预先设定的门限对每个细胞进行标记。此外还提供了可选的 Perl 脚本，用于汇总各个孔（或实验条件）的数据结果，输出内容包括：处于设定门限内的细胞百分比以及原始检测评分的平均值。后一种更为均质化的数据呈现方式，适用于响应效应影响孔内全部或大多数细胞的情形。如上所述，当响应仅局限于细胞群体中的部分细胞时，相较于基于单细胞数据的设门分析，此类整体性评估所提供的信息较少。
所述实验流程的应用不仅限于siRNA干扰或文中描述的标记物检测。已有研究采用该方法，在组织培养实验中联合使用siRNA、化学抑制剂和辐射处理，以检测CDK6和CDK2活性以外的其他标志物5。
从概念上讲，该实验策略能够自动识别荧光显微镜图像中单个细胞内多种具有生物学意义的亚细胞区域。因此，该方法可提供定量、多重的数据，揭示出那些仅关注细胞群体而非单个细胞的技术可能遗漏的生物学信息。通过少量修改，本文所述的方法和分析流程可适用于任何基于荧光的检测输出和细胞生物学响应，适用于需要对DNA含量进行定量评估、对细胞核或细胞质荧光进行定量分析，或对这两者之间标志物的穿梭行为进行单独或多重检测的研究。随着期刊发表要求日益倾向于提交公开可获取的原始数据，获取并熟悉此类免费显微图像分析工具（如本文所述）也将直接引起希望重新分析已发表数据的实验室的浓厚兴趣。

<table><tbody><tr><td>AllStars 阴性对照 siRNA</td><td>Qiagen</td><td>1027280</td><td>阴性对照 siRNA。</td></tr><tr><td>CDK6 siRNA</td><td>Dharmacon/定制合成</td><td>NA</td><td>反义序列：5' CUCUAGGCCAGUCUUCUUCUU</td></tr><tr><td>RB1 siRNA</td><td>Dharmacon/定制合成</td><td>NA</td><td>反义序列：5' GGUUCAACUACGCGUGUAATT</td></tr><tr><td>5x siRNA 缓冲液</td><td>Thermo Scientific</td><td>B-002000-UB-100</td><td>需用无核酸酶、未经 DEPC 处理的水稀释。</td></tr><tr><td>无核酸酶水（非 DEPC 处理）</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM9937</td><td>用于稀释 siRNA 缓冲液。</td></tr><tr><td>Hiperfect</td><td>Qiagen</td><td>301705</td><td>转染脂质试剂。</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>41966052</td><td>含丙酮酸和高葡萄糖的组织培养基。</td></tr><tr><td>96 孔组织培养板</td><td>Falcon</td><td>3072</td><td>普通 96 孔组织培养板，用于平行、分隔式混合转染复合物。</td></tr><tr><td>Packard Viewplate</td><td>Perkin Elmer LAS</td><td>6005182</td><td>带光学底的 96 孔组织培养板，用于细胞转染、培养、固定及最终成像。配有不透明粘性板封膜，用于使用后板的储存。</td></tr><tr><td>透气膜</td><td>Alpha Labs</td><td>LW2783</td><td>无菌、透气、带粘性的膜。</td></tr><tr><td>10% 中性缓冲福尔马林</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT5012-1CS</td><td>10% 福尔马林（4% 甲醛），在实验方案中直接使用。</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100PC</td><td>非离子型去垢剂</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>Trizma 碱（三（羟甲基）氨基甲烷）</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td>用于板洗液。</td></tr><tr><td>抗-P-S780 RB1 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab32513</td><td>兔单克隆抗体</td></tr><tr><td>AlexaFluor647 抗兔抗体</td><td>Invitrogen</td><td>A21245</td><td>高度交叉吸附的荧光标记二抗。</td></tr><tr><td>Hoechst 33342（双苯并咪唑）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td>可插入染色质的荧光 DNA 染料。</td></tr><tr><td>通透液</td><td>NA</td><td>NA</td><td>含 0.1% Triton X-100 的 50 mM Tris 缓冲盐水，pH 8.0。</td></tr><tr><td>板洗液</td><td>NA</td><td>NA</td><td>含 0.1% Tween-20 的 Tris 缓冲盐水。</td></tr><tr><td>封闭液</td><td>NA</td><td>NA</td><td>含 5% 脱脂奶粉、Tris 缓冲盐水和 0.1% Tween-20 的溶液，用于免疫染色前封闭培养板以及抗体稀释。</td></tr><tr><td>Cell Profiler 2.1</td><td>Broad Institute</td><td></td><td>http://www.cellprofiler.org/download.shtml</td></tr><tr><td>Active Perl 社区版</td><td>ActiveState</td><td></td><td>http://www.activestate.com/activeperl/downloads</td></tr><tr><td>R 编程环境</td><td>The R Foundation</td><td></td><td>http://www.r-project.org</td></tr><tr><td>Rstudio</td><td>Rstudio</td><td></td><td>http://www.rstudio.com/</td></tr></tbody></table>

基于开源软件的通用显微镜数据中荧光标记物高内涵单细胞定量分析工作流程

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

随着对贴壁培养的哺乳动物细胞行为调控机制研究的不断深入，单细胞分析技术正变得愈发重要。传统方法所提供的数据通常反映的是细胞群体中生物标志物的平均值，这类综合数据容易忽略反映生物系统异质性的亚群动态变化。因此，传统方法正逐渐被更先进的细胞检测技术所取代或补充，这些新技术能够结合高内涵显微镜进行分析。此类检测方法可产生大量荧光生物标志物的图像，借助配套的专用软件，实现对单个细胞的多参数测量。然而，许多此类设备较高的购置成本和过度专业化的特点，限制了其在广大科研人员中的普及应用。
本文描述了一种普遍适用的工作流程，用于从单个细胞的特定亚细胞区域中定量多种荧光标记的强度，适用于大多数荧光显微镜获取的图像。该工作流程的关键在于使用免费的 Cell Profiler 软件1&#160;，以识别图像中的单个细胞，将其分割为定义的亚细胞区域，并输出针对这些区域的荧光标记强度值。从图像数据中提取单个细胞的强度值是本工作流程的核心目的，文中将以贴壁人源细胞中 G1 期检查点调控因子 siRNA 筛选的对照数据分析为例进行说明。然而，此处提供的工作流程也可应用于其他细胞扰动方式（例如，化合物筛选）以及基于荧光的其他细胞标记形式的数据分析，因此适用于广泛的研究实验室。

本文展示了一种灵活的信息学工作流程，可实现对荧光标记细胞的多重基于图像的分析。该工作流程可定量分析细胞核和细胞质标志物，并计算这些标志物在不同区室间的转位情况。文中提供了利用siRNA对细胞进行扰动的实验步骤，以及在96孔板体系中通过间接免疫荧光法可靠检测标志物的方法。

哺乳动物贴壁组织培养模型中细胞行为调控机制研究的最新进展正日益推动该领域的发展……

本实验的总体目标是通过定量显微镜图像中特定荧光标记的强度，客观地测量单个细胞的反应。该目标的实现分为两个步骤：首先，对贴壁培养的组织细胞进行小干扰RNA介导的基因敲低；其次，对细胞进行多种目标标记物的荧光染色，随后进行成像。在最后一步中，特定亚细胞区域内的标志物表达通过算法进行定义，并针对单个细胞进行分析。最终，可通过测量目的标志物的荧光表达水平及其亚细胞转位情况，来分析细胞对基因敲低所产生的生物学信号的响应。尽管该实验流程可为研究 siRNA 处理下 G1 期细胞周期进程的调控机制提供深入见解。该方法还可应用于生成荧光细胞图像、研究核转运和蛋白质稳态的研究。演示该实验步骤的是我实验室的博士后研究员 Daniel Wek 和 Car K HO。首先，在无菌组织培养操作台中，将 70 微升稀释于 irna 缓冲液中的 200 纳摩尔 irna 加入无菌 96 孔板的相应孔中。然后，将 105 微升转染脂质稀释于 40 体积的无血清 DMEM 培养基中，加入每孔 sirna 中。通过轻轻振荡使 96 孔板在室温下混匀，10 分钟后，将所得的 175 微升混合液分装至不透光、带透明底的 96 孔组织培养板中，每靶标分为三个 50 微升的重复孔。随后，将8,000个细胞溶于150微升含10%血清的DMEM中，每孔直接加入含有50微升脂质-iRNA复合物的孔板中，无需混匀。然后用无菌透气胶膜密封孔板，并将孔板置于37°C、5%二氧化碳的湿化培养箱中孵育。48小时后，从孔板中吸除培养基。然后在通风橱中，于室温下用100微升4%多聚甲醛缓冲液固定细胞。10分钟后，吸去固定液，并用100微升PBS洗涤三次，每次洗涤后均吸去PBS。最后一次洗涤后，去除PBS，并加入100微升通透化溶液，室温孵育10分钟，重复此步骤三次，孵育过程中不摇动。最后一次孵育结束后，吸去通透化溶液，每孔加入100微升封闭液，室温孵育30分钟。然后吸除封闭液，并在标记后两周内加入50微升目标一抗对细胞进行孵育。使用配备20倍物镜的共聚焦显微镜，分别在三个通道中采集16位灰度TIFF图像，对应DNA染料、GFP和免疫荧光染色。Flora fours采集多组不重叠的图像集或帧，以覆盖每孔约1000至2000个细胞。系统地命名图像文件并包含元数据信息，使每个文件名均为实验名称、孔位地址、帧编号和通道标识符的唯一组合。然后打开 Cell Profiler 软件，点击文件并导入流程。接下来，在“来自文件”选项下，选择三通道流程 CP 管道文件（three channels pipeline CP pipe file），该文件包含软件解析图像文件元数据所需的指令，元数据来源于保存的文件名命名规范。现在可以使用 Cell Profiler 对图像进行关联，从文件中提取细胞核 DNA 和抗体信号强度，并利用 GFP 通道计算细胞核与细胞质信号强度的比值。对于检测到的每个细胞，点击“查看输出设置”按钮，然后点击默认输入和默认输出文件夹。分别选择用于分析的图像文件位置以及提取数据的保存位置。然后在分析模块窗口中，点击相应的眼睛图标，以在分析过程中查看“识别初级对象”和“识别三级对象”窗口，并在分析完成后点击“分析图像”。在消息框中点击“确定”，然后前往默认的输出文件夹位置，所有数据文件均以逗号分隔值文件的形式保存。为了执行数据提取，请在 Cell Profiler 输出结果中找到新生成的细胞核 CSV 文件，该文件包含单个细胞的荧光核抗体强度、核 DNA 强度以及 GFP-CDK2 报告基因比值的个体细胞数据。将提供的 Pulse Script 文件复制到与细胞核 CSV 数据文件相同的文件夹中，然后双击 Pearl Script 的图标。当提示时，输入数据文件的完整名称，后跟一个点 CSV 文件名，该文件用于对细胞进行设门，并包含抗体荧光和 G FP CDK2 报告基因数据的门控值。确认新创建的文件将来自原始细胞数据谱的单个细胞检测原始值与亚群标签合并，以显示每个孔中每个细胞在两个门控条件下的表现。现在打开 R Studio 软件，通过单击“文件”并选择“打开文件”，然后选择提供的分析脚本 dot r 文件，使用单个细胞亚群标签绘制每种实验条件下的数据图。输入包含已设门数据的文件夹的计算机地址，包括驱动器字母以及文件本身的名称。然后在工作室左上窗口中选中第1行至第17行，点击运行按钮，以输入实验数据的阈值及孔位信息。最后，依次选中第17行以下剩余代码的各个独立代码块，并点击运行按钮，生成相应的图表。观察工作室右下角窗口中的图表，然后点击导出按钮，以多种格式保存这些图表。此处描述的工作流程可分析荧光显微镜图像，生成以列表形式呈现的原始数据，列表中包含每个被识别细胞及其相应的检测值。这些数据具有多种分析选项。例如，在这些直方图中，经对照RNA处理的细胞的检测值可用于确定适当的设门阈值，以对每项检测进行划分。随后通过脉冲脚本应用这些设门阈值，根据检测结果对原始数据中的每个细胞进行标记。这种标记方法有助于初步的视觉观察，以及对处理条件与大量单细胞数据亚群分布之间关系的自动化分析。例如，在本项代表性实验中，三种 siRNA 敲低条件下，细胞相对于两个检测中设门的分布呈现出不同的结果。R 图利用标签计算各象限中细胞的百分比分布。这些标签还可将额外的荧光测量结果与检测数据进行交叉比对。在本实验中，经SI CDK六处理的细胞亚群根据各自的检测标签进行分组，并绘制为细胞核DNA染色的直方图。利用细胞数据标签可揭示两种细胞检测方法与细胞DNA含量之间的关系。在执行该操作时，使用Cell Profiler时务必始终记得测试并调整图像分割参数。首次使用新的或未经测试的图像文件时，这一点尤为重要。好的。

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生物学

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