工作流的高含量，荧光标记的万能工具显微镜数据，支持开源软件的单个细胞定量

该程序的总体目标是通过量化显微镜图像中的特定荧光标志物强度来客观测量单个细胞的反应。这是通过首先对贴壁组织培养细胞进行 irna 介导的基因敲低来实现的。在第二步中，对细胞进行荧光染色，然后对几种感兴趣的标记物进行成像。

在最后一步中，特定亚细胞区域内标记物的表达由算法定义，是单个细胞。最终，可以通过测量目标标记物的荧光表达水平及其亚细胞易位来分析细胞对基因敲低的生物线索的反应。尽管该程序提供了对响应 siRNA 的 G 单细胞周期转运调节的见解。

它还可用于生成荧光细胞图像的研究、研究核转运和蛋白质稳态。演示该程序的将是我实验室的博士后 Daniel Wek 和 Car K HO 首先将 70 微升 200 纳摩尔 irna，稀释的 irna 缓冲液分配到无菌组织培养罩中无菌 96 孔板的适当孔中。然后将 105 μL 转染脂质体（在 40 体积的无血清 DMEM 培养基中稀释）加入到 sir a 的每个孔中，通过室温轻轻振动混合板，然后在 10 分钟后，将得到的 175 μL 分液细分为三个 50 μL 重复，每个靶标放入具有透明底座的不透明组织培养物处理的 96 孔板中。

接下来，将每孔 8， 000 个细胞分配到 150 微升含 10% 血清的 DMEM 中，直接分配到 50 微升脂质 irna 复合物上，无需混合。然后用无菌粘合剂透气膜密封板，并将板放入 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的加湿培养箱中。48 小时后，从平板中吸出培养基。

然后在室温下将细胞固定在通风橱中的 100 μL 4% 缓冲甲醛中 10 分钟后，吸出固定剂并在最后一次洗涤后用 PBS 进行 3 次 100 μL 洗涤。去除 PBS，并在室温下用 3 个 100 μL 渗透溶液孵育 10 分钟的循环对细胞进行穿孔，每次 10 分钟，不要摇晃。最后一次孵育后，去除渗透溶液，然后在室温下每孔添加 100 μL 封闭溶液 30 分钟。

然后吸出封闭溶液，并在用 20 x 物镜标记 uc 共聚焦显微镜后的两周内用 50 微升感兴趣的一抗探测细胞，以在对应于 DNA 染料 GFP 和免疫染色的三个通道中拍摄单独的 16 位灰度 TIFF 图像。Flora fours 可捕获许多不重叠的图像集或帧，每孔可对大约 1000 至 2000 个细胞进行成像。使用元数据信息系统地命名图像文件，以便每个文件名都是实验名称、孔地址、帧编号和通道标识符的唯一组合。

然后打开 cell profiler 软件并单击 file 和 import pipeline。接下来，在"从文件"下，选择文件三通道管道 CP 管道文件，其中包含软件从保存的文件名中解释图像文件元数据的必要说明。Convention Cell Profiler 现在可用于关联图像，从文件中提取核 DNA 和抗体强度，并使用 GFP 通道计算细胞核与细胞质强度的比率。对于检测到的每个单元格，单击 view output settings 按钮，然后单击 default input 和 default output 文件夹。

分别选择要分析的图像文件的位置和提取数据的目标。然后，在分析模块窗口中，单击相应的眼睛图标以在分析期间观察识别主要对象和第三对象窗口，并在分析完成后单击分析图像。单击消息框中的 ok 并转到默认输出文件夹 Location 所有数据文件都保存为逗号分隔值文件的位置。

要执行数据提取，请找到细胞分析器输出中包含的新细胞核 CSV 文件，其中包含荧光核抗体强度核 DNA 强度和 GFP CDK 两个报告基因比值的单个细胞数据。将提供的脉冲脚本文件复制到步态分类器 PL 与核 CSV 数据文件相同的文件夹中。然后双击 Pearl Script 的图标。

出现提示时，键入数据文件的全名，后跟要设门的细胞文件的 DOT CSV 文件名，以及抗体荧光和 G FP CDK 两个报告基因数据的门值。确认新创建的文件将来自原始细胞图谱数据的原始单个细胞检测值与显示每个孔中的每个细胞对两个门的性能的亚群标签相结合。现在打开 R Studio 软件，通过单击文件和打开文件，然后选择提供的分析点 r 文件，使用单个细胞亚群标签绘制每个实验条件的数据。

键入包含门控数据的文件夹的计算机地址，包括驱动器号和文件本身的名称。然后在我们工作室的左上角窗口中突出显示第 1 行到第 17 行，然后单击运行按钮以输入实验数据阈值和孔位置详细信息。最后，在第 17 行下方突出显示其余代码的各个块，然后单击 run 按钮创建相应的绘图。

在我们工作室右下角的窗口中观察绘图，然后单击导出按钮以各种格式保存这些图。此处描述的工作流程分析荧光显微镜图像，以列表的形式生成原始数据，详细说明每个鉴定的细胞及其相应的测定值。分析这些数据有很多选择。

例如，在这些直方图中，用对照 RNA 处理的细胞的检测值能够识别适当的门以对每个检测进行阈值测定。然后使用脉冲脚本应用门控阈值，以根据检测结果标记原始数据中的每个细胞。这种标记方法有助于初步可视化以及自动评估处理与甚至非常大的单个细胞数据集的亚群分布之间的关系。

例如，在这个代表性实验中，三个 irna 敲低条件导致细胞相对于门的对比分布是两种测定。R 图使用标签计算每个象限中单元格的百分比分布。这些标记还允许将其他荧光测量值与检测数据进行交叉引用。

在该实验中，用 SI CDK six 处理的细胞亚群根据它们各自的测定标记进行分组，并绘制为核 DNA 染色的直方图。细胞数据标签的这种使用揭示了两种细胞检测与细胞中 DNA 含量之间的关系。执行此过程时，请务必记住在使用 cell profiler 时测试和调整图像分割参数。

当第一次使用新的或未经测试的图像文件时，这一点尤其重要。好。