Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

该实验的总体目标是可视化和量化细胞粘附初始步骤中发生的区室化翻译事件。这种方法具有广泛的应用。每当可能进行快速特异性翻译反应的分析时，例如在分析细胞迁移、粘附或早期药物反应时，请使用它。

这种技术的主要优点是简单、快速且具有成本效益。它只需要嘌呤霉素、针对嘌呤霉素的抗体和标准的共聚焦扫描成像系统。首先，制备 MRC-5 细胞的悬浮液。

使用胰蛋白酶消化，然后离心，去除上清液，然后以 40,000 个细胞/毫升的浓度重悬于含 10% FBS 的 DMEM 中。轻轻旋转悬浮液孵育 20 分钟，以完全解离黏着斑复合物。这很关键。

接下来，在两个 35 毫米玻璃底培养皿中，加入 2 毫升等分试样悬浮液，并孵育它们以允许细胞粘附和 SiC 形成。40 分钟后，用放线菌酮处理一个板，然后将其放回培养箱中。该板将用作阴性对照。

55 分钟后，将嘌呤霉素以预定浓度涂抹在两个板中，并将板再孵育 5 分钟。接种 1 小时和 5 分钟嘌呤霉素合作后，用 2 毫升冰冷的 PBS 洗涤每个板两次。然后在室温下用 1 毫升 4% 甲醛的 PBS 溶液固定细胞 15 分钟。

固定后，用 PBS 洗涤细胞 3 次，然后在室温下使用 500 微升 0.5% Triton X-100 的 PBS 溶液对细胞进行 20 分钟的渗透。接下来，用 PBS 洗涤板 3 次，然后在 PBS 中加入 500 微升 1% BSA。继续室温孵育 20 分钟。

要去除多余的 BSA，请用 0.1% Tween-20 的 PBS 溶液洗涤细胞 3 次。现在，用 300 μL 抗嘌呤霉素抗体孵育细胞。用 0.1% Tween-20 洗涤 3 次，去除未结合的抗体。

接下来，施用 300 微升两种荧光团偶联的二抗混合物，以观察嘌呤菌化的多肽和事实。将细胞在室温下避光孵育一小时。一小时后，将板洗涤 3 次以去除未结合的抗体，然后应用 300 微升 0.1% Tween-20 溶液，并补充有 DAPI。

让 DAPI 在室温下在细胞中停留 5 分钟。最后，再洗涤细胞四次，最后用纯 PBS 洗涤。然后，将细胞储存在 2 毫升 PBS 中进行成像。

使用任何市售的共聚焦成像系统，首先确定使定量动态范围最大化的适当设置。只有在避免峰大小饱和并适当调整浓度的情况下，才能获得定量的关注。可以通过仔细调整激光功率优势和偏移来实现设置。

首先，调整缩放系数和像素数以优化像素大小。根据 Nyquist 定理执行此作。接下来，降低扫描速度并使用平均来提高信噪比。

然后，手动确定沿 Z 轴的适当顶部和底部焦平面，并通过计算轴向分辨率并将此距离除以 2.3 来设置 StepSize。典型的结果是 20 到 25 个图像图层。调整设置后，使用数值孔径为 1.42 的 60 倍 Plan Apo 油浸物镜采集整个单细胞的共聚焦图像。

要量化和分析荧光团信号，首先打开与图像 J 中感兴趣的 z 平面层相对应的图像，然后使用绘图工具，在需要量化的单元格中画一条线。接下来，通过双击 straight 来修改 whiff 线。强度值将通过线条的宽度进行平均，因此请使用较细的线条以避免来自不同结构的信号重叠。

然后，沿线路分析信号密度。现在，重复沿对应于荧光团的通道中同一条线收集信号密度的过程。值将始终使用线条的方向进行排序。

现在，复制用户档案数据并将其粘贴到电子表格中进行分析。在进行统计分析之前，重复从每个感兴趣的 Z 平面图像收集数据的过程。或者，可以从图像的某个区域收集信号，而不是沿轴收集信号。

首先，使用 geometrical form 函数选择感兴趣的区域。接下来，调整阈值级别以避免任何背景。在像素强度的直方图中，移动滑块以调整哪些像素将包含在量化中。

设置阈值以消除单元格外部的所有红色像素。现在，定义测量目标信号而不是背景信号所需的测量参数。将 limit 切换为 threshold 和 integrated density 选项。

接下来，使用 measure 命令。这将打开一个新窗口，其中包含所选区域中的平均灰度值和像素数。现在重复该过程，应用相同的阈值来确定整个单元中的信号强度。

然后使用此数据计算所选区域中的信号与整个单元的信号之比。为了使用紫霉素掺入准确测量翻译事件，首先评估了轴向测量的最佳条件。比较了浓度范围与 5 或 10 分钟治疗。

MRC-5 和 HeLa 细胞可接受的嘌呤霉素浓度略高于 Huh-7 细胞所需的浓度。用高嘌呤霉素浓度处理 10 分钟的细胞大多产生较小的嘌呤霉素多肽。较小的多肽分解得更快，因此不可取。

因此，较短的孵育时间被认为更可取。放线菌酮治疗是一种有效且重要的阴性对照。在 MRC-5 细胞中，放线菌酮处理后仅检测到微弱的嘌呤霉素信号。

使用轴向信号定量，可以在细胞内的不同水平评估对应于新合成蛋白质的嘌呤菌化多肽的一般定位。信号在整个细胞中的定量分布也是可行的。对于这两种技术，量化图像堆栈中每个 Z 平面的信号以准确评估整个细胞中的翻译事件都很重要。

观看此视频后，您应该对如何评估亚细胞区室中的翻译事件有很好的了解。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在一天内完成。当人们考虑这个程序时，重要的是要记住嘌呤霉素的浓度及其孵育时间很重要。

为了限制扩散，最好限制孵育时间。同样重要的是要认识到，图像采集类型的质量对于获得良好结果至关重要。不要忘记，使用甲醛可能非常危险，在执行此程序时应始终采取预防措施，例如在化学罩中工作。