的三种不同方法对乳腺癌细胞株确定细胞增殖的比较
2016年9月3日
该方案描述了使用三种不同的方法来分析乳腺癌细胞系中的细胞增殖。这包括使用常规细胞计数、基于发光的细胞活力以及通过使用细胞成像仪进行细胞计数。每种方法都为细胞增殖的可重复测量提供了优势。
该演示的总体目标是比较三种不同的细胞增殖检测，并介绍每种方法的优缺点。这种方法可以帮助回答癌症研究领域的关键问题，例如使用最合适的细胞增殖方法。这种方法的准备至关重要，因为细胞成像仪的步骤很难学习。
它们要求您在应用适当的细胞计数掩码之前专注于细胞。要开始此过程，使用不含酚红的 DMEM 在 T75 平方厘米组织培养瓶中培养两个 MCF-7 细胞系三天，使其达到 75% 至 80% 汇合。三天后，将培养基倒入废液容器中，从培养瓶中取出细胞。
然后，立即用 2 毫升预热的 2 倍胰蛋白酶洗涤细胞层。吸出胰蛋白酶，在细胞层中再加入 2 毫升预热的胰蛋白酶，然后将其放入培养箱中。细胞分离后，用 10 毫升加热的新鲜补充 DMEM 洗涤它们。
然后，将细胞悬液转移至无菌 15 mL 试管中，并在室温下离心 5 分钟。5 分钟后，小心吸出并处理掉上清液。之后，将细胞沉淀重悬于 5 mL 新鲜补充的 DMEM 中。
要进行细胞计数，请将 100 μL 细胞悬液稀释在 900 μL 的 1 倍 DPBS 中。然后，将新的 60 微米传感器放在自动细胞计数仪上。按住柱塞，将传感器浸入稀释的细胞悬液中。
慢慢松开细胞计数仪上的柱塞。然后，完成后从细胞计数器中取出传感器。将最终体积为 100 微升的细胞接种在 96 孔板中，以约 20% 的汇合度，以便在 3 到 5 天内为细胞生长和增殖测量留出空间。
要使用血细胞计数器测定细胞计数，请在细胞培养箱、烘箱或水浴中将培养基和胰蛋白酶预热至 37 摄氏度。接下来，将培养基从细胞中吸出到废液容器中。然后，用 30 微升 2 倍胰蛋白酶洗涤一次，并再次将培养基吸入废液容器中。
接下来，用 30 μL 的 2 倍胰蛋白酶再次洗涤细胞，并在 37 摄氏度下孵育 5 分钟。轻轻敲击板边缘以去除细胞。随后，加入 50 微升补充的 DMEM，并通过移液混合细胞，直至形成单细胞悬液。
将玻璃盖玻片放在计数室上并固定，直到在盖玻片边缘和血细胞计数器之间看到牛顿折射环。然后，在盖玻片下轻轻吸取 20 μL 细胞填充液，并让计数室通过毛细管运动填充。随后，在 10 倍放大倍率下可视化网格布局中的计数室。
在此过程中，将发光试剂在 22 摄氏度的水浴中解冻 30 分钟。轻轻倒置瓶子以获得均匀的混合物。然后，在室温下平衡一板接种的细胞 30 分钟。
然后，向每个孔中加入 100 μL 发光试剂。在轨道摇床上混合内容物 2 分钟。然后，让板在室温下孵育 10 分钟。
要使用多功能读板器软件设置发光实验，请打开多功能读板器并打开软件。在 Task Manager （任务管理器） 中，选择 Experiments （实验） 和 Create New （新建）。然后，从侧面工具栏中选择 File，然后在 Protocol 选项卡下，选择 Procedure。
接下来，选择 Greiner 96 平底作为板类型，并选中 Use Lid 框。在 Read method 框下选择 Read作。然后，选择 Luminescence 作为检测方法，然后单击 Read Step 框 OK.In，在 Full Plate 选项卡下选择要扫描的孔，然后选择作为空白孔的孔。
将 Filter Set （过滤器集） 设置为 Empty Filter （空过滤器）。将增益设置为 135，每孔积分时间为 5 秒，读取高度为 6.5 毫米。单击 OK （确定） 保存发光读取的设置。
要执行发光读数，请选择"仪器控制"选项卡，然后单击"板输出"以弹出板支架。将 96 孔板放在板架上，确保盖子盖上。单击"仪器控制"选项卡下的"Plate In"，关闭板架。
然后，单击工具栏中的 Read Now 以执行发光读取。之后，将每个孔的 RLU 测量值导出到电子表格中以供进一步分析。要设置细胞成像实验，请打开多模式细胞成像仪并打开软件。
在 Task Manager 中，选择 Experiments 选项卡和 Create New。在 File （文件） 工具栏上，单击 Protocol （协议） 选项卡，然后单击 Procedure （过程） 选项卡。选择 Set Temperature作。
将 Incubator（培养箱）设置为 On（打开），并将 Temperature（温度）设置为 37 摄氏度。检查 预热，然后单击 OK 保存设置。接下来，选择 Read作。
单击 Image 作为检测方法。然后，选择 Endpoint/Kinetic 读取类型和 Filters optics 类型，然后单击 OK。之后，单击 Full Plate 选项卡，然后选择板上要成像的孔。点击 OK 保存设置。
现在，从下拉列表中选择 2.5 倍目标 选项。在 Channels 选项卡下，选择 GFP 469.525 和 Bright Field。选中两个通道的 Auto Exposure（自动曝光），然后选择 Auto exposure 井。
要确定自动对焦设置，请单击 Options （选项）。对于自动对焦选项，请选择方法 Scan 然后 auto focus。点击 OK 保存设置。
之后，将距井中心的水平和垂直偏移量设置为零。选择以 3 x 2 蒙太奇的形式扫描每个孔的多个图像。然后，单击 OK 保存过程设置。
要读取所选板上的实验，请单击"仪器控制"选项卡，然后选择"板外"功能。将 96 孔板放在板架上，确保盖子已盖上。在 Instrument Control（仪器控制）选项卡下，选择 Plate In（进板）功能。
接下来，从板选项卡中选择 Read Now（立即阅读），并每 24 小时重复一次读取，直至接种后 96 小时。要分析图像，请单击成像板上的"数据"选项卡，然后选择"图片 GFP 469、525 加明场"。然后，双击成像的井。
现在，单击加载的图像。选择 Analyze，然后选择要分析的蒙太奇的单个图像。接下来，单击 OK。然后，仅检查 GFP 通道，并按照表 3 中概述的参数进行设置。
之后，单击 Start 开始 将参数应用于成像的单元格。观察放置在成像细胞上的细胞计数掩码，该掩码用于确定每个图像的细胞计数。单击 Apply Changes（应用更改），并在整个实验过程中为每个成像板保留这些设置。
在该图中，进行了线性回归分析，以比较用于测量 MCF-7-LeGO 细胞和 MCF-7-delta 40p53 细胞增殖的不同方法之间的相关关系。计算 Pearson 相关系数，并确定测量细胞增殖的不同方法之间的显著性。在基于发光的测定和细胞成像仪的比较之间观察到最强的相关性。
此处显示的是 GFP 阳性 MCF-7-LeGO 和 MCF-7-delta 40p53 乳腺癌细胞的代表性图像，使用细胞成像仪每 24 小时捕获一次，直到细胞达到接近 100% 汇合。该方法提供了有用的细胞信息，包括能够直观地监测多天的细胞生长，并比较不同细胞系之间的细胞大小和细胞形态。这里总结了每种测试方法的优缺点，展示了每种方法的多功能性，并将帮助读者选择最合适的方法。
观看此视频后，您应该对三种不同的细胞增殖检测有很好的了解，并且应该能够确定哪一种最适合您的实验设计。
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概述
本协议描述了比较三种不同方法以分析乳腺癌细胞系中细胞增殖的方法。这些方法包括常规细胞计数、基于发光的细胞活力度量以及使用细胞成像仪进行细胞计数，每种方法都有其自身的可重复测量优势。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 癌症研究
- 细胞增殖测定
背景
- 理解细胞增殖在癌症研究中至关重要。
- 不同的测定可以产生不同的结果和见解。
- 这些测定的准备和执行需要特定的技能。
- MCF-7细胞系在乳腺癌研究中常被使用。
研究目的
- 比较三种细胞增殖方法的有效性。
- 确定最适合特定研究需求的方法。
- 为研究人员提供详细的协议。
使用的方法
- 常规细胞计数
- 基于发光的细胞活力测定
- 使用细胞成像仪进行细胞计数
- MCF-7细胞系的培养准备
主要结果
- 每种方法都有其独特的优势和劣势。
- 细胞成像仪需要仔细的准备和聚焦。
- 常规计数直观但可能缺乏灵敏度。
- 基于发光的测定提供关于活力度量的定量数据。
结论
- 选择正确的增殖测定对于获得准确结果至关重要。
- 研究人员应考虑其研究的具体要求。
- 建议对使用细胞成像等高级方法进行培训。
常见问题
Executive Industry Relevance
Reliable quantification of cell proliferation is foundational for early oncology discovery, enabling robust target validation and comparative assessment of compound effects in breast cancer models. Selecting the optimal proliferation assay impacts predictive confidence, assay scalability, and cross-study reproducibility, directly influencing portfolio triage and downstream screening workflows. Methodological rigor in proliferation measurement supports risk-adjusted advancement decisions and enterprise-wide assay standardization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of therapeutic hypotheses in breast cancer cell lines.
- Supports functional target validation by measuring proliferation changes in response to genetic or pharmacological perturbations.
- Facilitates mechanistic de-risking through comparative analysis of proliferation outputs across methods.
- Provides data continuity for predictive confidence in early-stage decision making.
Screening & Assay Development
- Establishes validated, reproducible proliferation assays for compound screening campaigns.
- Supports assay standardization and scalability, especially with luminescence and imaging-based platforms.
- Enables high-throughput readiness and platform reuse for diverse compound libraries.
- Delivers quantitative outputs suitable for robust cross-condition comparisons.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro proliferation metrics with disease-relevant breast cancer models.
- Provides morphological and confluence data via imaging, supporting translational biomarker exploration.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by supporting longitudinal monitoring.
- Reduces biological ambiguity in preclinical candidate selection.
Pipeline & Workflow Integration
These proliferation assays integrate from early discovery through lead identification, supporting both hypothesis testing and screening workflows in oncology R&D.
- Discovery Biology: Quantitative proliferation measurement clarifies pathway activity and validates target engagement.
- Screening: Assay reproducibility and scalability enable reliable compound evaluation and hit triage.
- Analytics: Statistical outputs, including correlation and regression analyses, facilitate method comparison and data-driven decisions.
- Translational Research: Imaging-based methods provide morphological insights relevant to disease models.
- Enterprise Reuse: Standardized protocols support cross-program assay deployment and data harmonization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in proliferation-based readouts.
- Operational Value: Enhances assay standardization, reproducibility, and throughput across R&D teams.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and optimizes resource allocation by enabling robust comparative analyses.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of oncology assets.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in cell culture, imaging, and luminescence assay setup.
- Demands access to multi-mode plate readers, cell imagers, and analytical software infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of assay protocols and data analysis pipelines.
- Adaptation across different cell lines or disease models may require protocol optimization.
- Each method presents trade-offs in sensitivity, throughput, and data richness that must be matched to project needs.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:38
Preparing Cells for Proliferation Assays
2:49
Determining Cell Count Using a Hemocytometer
4:21
Determining Cell Proliferation Using Luminescence-based Assay
7:02
Determining Cell Count Using a Cell Imager
10:40
Results: Comparison of Three Different Methods Measuring Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines
12:10
Conclusion
