三种不同方法在乳腺癌细胞系中细胞增殖检测的比较

本演示的总体目标是比较三种不同的细胞增殖检测方法，并阐述每种方法的优缺点。该方法有助于回答癌症研究领域中的关键问题，例如如何选择最合适的细胞增殖检测方法。该方法的准备工作至关重要，因为细胞成像仪的操作步骤较难掌握。

在应用适当的细胞计数掩膜之前，需要先聚焦于细胞。开始此操作时，将两种 MCF-7 细胞系在含酚红-free DMEM 的 T75 平方厘米组织培养瓶中培养三天，使其融合度达到 75% 至 80%。三天后，通过将培养基倒入废液容器中，从培养瓶中去除细胞。

然后，立即用两毫升预热的两倍浓度胰蛋白酶洗涤细胞层。吸除胰蛋白酶，并向细胞层中加入另外两毫升预热的胰蛋白酶，随后将细胞置于培养箱中。待细胞脱落之后，用10毫升温热的新鲜添加物补充DMEM洗涤细胞。

然后，将细胞悬液转移至无菌的15毫升离心管中，在室温下离心5分钟。5分钟后，小心吸除并弃去上清液。随后，将细胞沉淀重悬于5毫升新鲜的含补充物的DMEM培养基中。

进行细胞计数时，将100微升细胞悬液加入900微升的1×DPBS中稀释。然后，将一个新的60微米传感器安装到自动细胞计数仪上。按住推杆，并将传感器浸入稀释后的细胞悬液中。

缓慢释放细胞计数器上的移液推杆，完成后将传感器从细胞计数器上取下。将细胞接种于96孔板中，终体积为100 µL，接种密度约为20%融合度，以预留细胞生长空间，并便于在三至五天内检测细胞增殖情况。

使用血细胞计数板测定细胞数量时，先将培养基和胰蛋白酶在细胞培养孵育箱、烘箱或水浴中预热至37摄氏度。接着，将细胞中的培养基吸除至废液容器中。然后，用30微升的两倍浓度胰蛋白酶洗涤细胞一次，并再次将液体吸至废液容器中。

接着，用 30 微升的两倍胰蛋白酶再次洗涤细胞，并在 37 摄氏度下孵育 5 分钟。轻轻敲击培养板边缘以使细胞脱落。随后，加入 50 微升添加了补剂的 DMEM，通过移液吹打混匀细胞，直至形成单细胞悬液。

将玻璃盖玻片盖在计数室上，并固定至在盖玻片边缘与血细胞计数板之间出现牛顿折射环为止。然后，轻轻吸取20 µL细胞悬液，从盖玻片边缘注入，使计数室通过毛细作用自动充满液体。随后，在10倍物镜下观察网格布局中的计数室。

在此步骤中，将发光试剂在22°C水浴中解冻30分钟。轻轻倒置瓶身以获得均匀混合液。然后，将一板已接种细胞在室温下平衡30分钟。

随后，向每孔加入 100 µL 发光试剂。在轨道摇床上混匀内容物 2 分钟。然后，将酶标板在室温下孵育 10 分钟。

使用多功能酶标仪软件设置发光实验时，先打开多功能酶标仪并启动软件。在任务管理器中，选择“实验”和“新建实验”。然后，从侧边工具栏中选择“文件”，在“方案”选项卡下选择“步骤”。

接下来，选择 Greiner 96 平底板作为板型，并勾选“使用盖子”选项。在读取方法框中选择“读取”操作，然后选择“发光”作为检测方法，点击“确定”。在读取步骤框中，于“整板”选项卡下选择需要扫描的孔，并选择用作空白对照的孔。

将滤光片组设置为“空滤光片”。增益设为135，每孔积分时间为5秒，读数高度为6.5毫米。单击“确定”以保存发光检测的设置。

进行发光检测时，选择仪器控制选项卡并点击“Plate Out”以弹出板架。将96孔板放置在板架上，确保盖子已盖好。然后在仪器控制选项卡下点击“Plate In”，关闭板架。

然后，单击工具栏中的“立即读取”以进行发光检测。之后，将每个孔的相对光单位（RLU）测量值导出到电子表格中以进行进一步分析。要设置细胞成像实验，请打开多功能细胞成像仪并启动软件。

在任务管理器中，选择“实验”选项卡并创建新实验。在文件工具栏上，单击“方案”选项卡，然后单击“步骤”选项卡。选择“设置温度”操作。

将培养箱设置为开启状态，温度设为 37 摄氏度。勾选预热选项，然后点击确定以保存设置。接下来，选择读取操作。

单击“图像”作为检测方法。然后选择终点/动力学读数类型和滤光片光学类型，然后单击“确定”。接着，单击“整板”选项卡，选择需要成像的孔位。单击“确定”以保存设置。

现在，从下拉的“物镜”选项中选择 2.5 倍物镜。在“通道”标签页中，选择 GFP 469.525 和明场。为两个通道均勾选自动曝光，并选择自动曝光的孔位。

为确定自动对焦设置，请点击“选项”。在自动对焦选项中，选择方法“扫描，然后自动对焦”。点击“确定”以保存设置。

此后，将水平和垂直偏移量设置为相对于孔中心的位置为零。选择在每个孔内以三行两列的拼接方式扫描多幅图像。然后，单击“确定”以保存程序设置。

要读取所选培养皿中的实验结果，请点击仪器控制选项卡并选择“取出培养皿”功能。将一个96孔板放置在培养皿架上，并确保盖上盖子。在仪器控制选项卡下，选择“放入培养皿”功能。

接下来，在酶标板标签页中选择“立即读取”，并在接种后每24小时重复读取一次，直至96小时。要分析图像，请点击成像后酶标板的“数据”标签页，选择“GFP 469, 525 加明场”图像，然后双击成像的孔位。

现在，单击已加载的图像。选择“分析”，然后选择要分析的拼接图像中的单个图像。接着，单击“确定”。随后，仅勾选GFP通道，并根据表3中列出的参数进行设置。

此后，单击“开始”以将参数应用于成像的细胞。观察覆盖在成像细胞上的细胞计数掩膜，该掩膜用于确定每张图像中的细胞数量。单击“应用更改”，并在整个实验过程中对每块成像的培养板保持这些设置。

在本图中，采用线性回归分析比较了用于检测 MCF-7-LeGO 细胞和 MCF-7-delta 40p53 细胞增殖的不同方法之间的相关性关系。计算了皮尔逊相关系数，并确定了不同细胞增殖检测方法之间的显著性。基于发光的检测法与细胞成像仪之间的比较显示出最强的相关性。

此处展示的是使用细胞成像仪每24小时拍摄的GFP阳性MCF-7-LeGO和MCF-7-delta 40p53乳腺癌细胞的代表性图像，直至细胞融合度接近100%。该方法可提供有用的细胞信息，包括能够直观地监测多日内的细胞生长情况，并比较不同细胞系之间的细胞大小和细胞形态。下表总结了每种测试方法的优缺点，展示了各方法的适用性，有助于读者选择最合适的方法。

观看本视频后，您应能充分理解三种不同的细胞增殖检测方法，并能够确定其中哪一种最适用于您自己的实验设计。