从人多能干细胞产生节后交感神经神经元

取细胞外基质涂层的微孔板，加入悬浮在分化培养基中的人多能干细胞。

该培养基含有影响细胞信号通路的信号分子，引导分化为神经祖细胞。

引入另一种分化培养基，该培养基含有信号分子，可诱导分化为神经嵴细胞或 NCC，神经元和非神经元细胞的前体。

添加酶以破坏基质，从而解离细胞。

洗涤以中和酶，然后离心并丢弃上清液。将NCC重悬于球体培养基中，并将其转移到微孔板中。

培养基的生长因子和小分子诱导球体形成。

补充视黄酸，促进分化为交感神经祖细胞。

球体转移到交感神经元成熟培养基中的粘附蛋白包被微孔板上，引起球体附着。

培养基中的神经生长因子和视黄酸促进节后交感神经元的成熟，这些神经元是周围神经系统的一部分，调节不自主过程。

分化诱导前一天，每孔用两毫升基底膜基质包被适当数量的六孔板，并将板在4摄氏度下储存过夜。第二天早上，将板加热至室温，每次洗涤时用新鲜的PBS洗涤准备分裂的人多能干细胞培养物两次。

第二次洗涤后，在细胞培养箱中用7毫升0.5毫摩尔EDTA处理细胞15分钟，然后吸出漂浮的人多能干细胞并将收获的细胞转移到50毫升管中。

管中加入等体积的PBS以稀释EDTA，并通过离心收集细胞。将沉淀重悬于一毫升第 01 天分化培养基中。在添加适当体积的培养基进行计数之前，在每孔两毫升分化培养基中将细胞稀释至每平方厘米浓度为 1.25 x 10⁵ 个细胞。

从先前制备的六孔板的每个孔中吸出所有基底膜基质溶液。然后，将 2 毫升细胞接种到每个孔中，并将板放入细胞培养箱中。第二天早上，每孔用3毫升第01天分化培养基喂养细胞。

在分化的第二天，每孔用三毫升第二天到十天的分化培养基喂养细胞。然后，每隔一天喂养一次细胞，直到第 10 天。为了将神经嵴细胞聚集成球体，在第10天，用PBS洗涤细胞，并向每个孔中加入两毫升解离培养基。在细胞培养箱中20分钟后，将漂浮细胞转移到50毫升锥形管中，并用新鲜PBS使管中的悬浮液体积达到50毫升。

通过离心收集细胞，并将沉淀重悬于足够体积的第 10 至 14 天球体培养基中进行计数。计数后，使用第10至14天球体培养基将细胞稀释至每500微升浓度为5 x 10⁵个细胞，并将500微升细胞接种到超低附着24孔板的每个孔中。然后将细胞放回细胞培养箱中。

为了诱导最小的球体培养，在培养的第11天，每孔额外喂食500微升第10至14天球体培养基的神经嵴球体。在第 12 天，倾斜板以将球体积聚在板的一侧，并小心地从每个孔中吸出尽可能多的培养基，不要吸出球体。然后，每孔用一毫升第10至14天球体培养基喂养球体。

为了在第15天诱导扩增的球体培养，用1.5毫升的第10至14天球体培养基喂养球体，每孔补充0.5微摩尔维甲酸。然后，将球体放回细胞培养箱中。

对于第 14 天或第 28 天的交感神经元分化，倾斜板以将球体积聚在板的一侧，并小心地吸出尽可能多的培养基。用一毫升交感神经元培养基喂养细胞。

要将大的球体聚集体分解成较小的球体，每孔添加不超过一毫升的培养基，并在分裂前移液球体5至10次。

并从先前制备的 24 孔板中去除多余的层粘连蛋白纤连蛋白。将板从24孔球体培养板上的每个孔中分离出一毫升球体，介于新包被的24孔板的四个独立孔之间。向每个孔中加入 250 微升新鲜交感神经元培养基，并将板放入细胞培养箱中。第二天早上，用一毫升补充有0.125微摩尔视黄酸的交感神经元培养基替换每个孔中的培养基，并将板放回细胞培养箱中。第 35 天后，通过小心地用新鲜培养基替换每个孔中现有培养基的一半来喂养神经元。