由人多能干细胞生成节后交感神经元

取一个包被有细胞外基质的微孔板，并加入悬浮于分化培养基中的人多能干细胞。

该培养基含有可影响细胞信号通路的信号分子，能够引导细胞分化为神经前体细胞。

加入另一种含有诱导信号分子的分化培养基，以诱导其分化为神经嵴细胞（NCCs），即神经元和非神经元细胞的前体细胞。

加入酶以破坏基质，从而解离细胞。

洗涤以中和酶，然后离心并弃去上清液。将NCC重悬于类器官培养基中，并转移至微孔板。

培养基中的生长因子和小分子可诱导球状体形成。

添加视黄酸，以促进分化为交感神经前体细胞。

将类球体转移至含有交感神经元成熟培养基的黏附蛋白包被的微孔板中，以促进类球体的贴附。

培养基中的神经营养因子和视黄酸可促进其成熟为节后交感神经元，这类神经元属于周围神经系统，负责调节非自主性生理过程。

在诱导分化前一天，用每孔2毫升的基底膜基质包被适量的六孔板，并于4摄氏度过夜保存。次日早晨，将六孔板升温至室温，用新鲜的PBS洗涤即将传代的人多能干细胞培养物，每次洗涤使用新鲜PBS，共洗涤两次。

第二次洗涤后，在细胞培养孵育箱中用七毫升 0.5 毫摩尔 EDTA 处理细胞 15 分钟，然后吸出悬浮的人多能干细胞，并将收集的细胞转移至 50 毫升离心管中。

向离心管中加入等体积的磷酸盐缓冲液（PBS）以稀释EDTA，并通过离心收集细胞。将细胞沉淀重悬于1毫升第01天分化培养基中。在加入适量培养基进行计数前，用2毫升分化培养基将细胞稀释至每平方厘米1.25 × 10⁵ 个细胞的浓度，每孔接种。

吸出预先准备的六孔板中每个孔内的全部基底膜基质溶液。然后，向每个孔中接种2毫升细胞，并将该六孔板放入细胞培养孵育箱中。次日早晨，每孔加入3毫升第01天分化培养基对细胞进行换液。

分化第2天，每孔加入3毫升第2至10天分化培养基对细胞进行换液。此后每隔一天换液一次，直至第10天。为将神经嵴细胞聚集成球体，第10天时用PBS洗涤细胞，每孔加入2毫升解离培养基。在细胞培养孵箱中孵育20分钟后，将悬浮的细胞转移至50毫升锥形管中，并用新鲜PBS将管内悬液体积补至50毫升。

通过离心收集细胞，并将沉淀重悬于适量的第10至14天类球体培养基中用于计数。计数后，用第10至14天类球体培养基将细胞稀释至每500微升含5 × 10⁵ 个细胞的浓度，并将500微升细胞悬液接种至超低吸附24孔板的每孔中。然后将细胞放回细胞培养孵箱中继续培养。

为了诱导形成最小类球体培养，在培养的第11天，每孔补充500微升第10至14天类球体培养基。在第12天，倾斜培养板使类球体聚集于孔板的一侧，小心吸除尽可能多的培养基，注意避免吸出类球体。随后，每孔加入1毫升第10至14天类球体培养基对类球体进行换液。

为了在第15天诱导形成扩大的类球体培养物，向每孔中加入1.5毫升第10至14天的类球体培养基，并补充0.5微摩尔/升的视黄酸。然后将类球体放回细胞培养孵育箱中。

在第14天或第28天进行交感神经元分化时，倾斜培养板使类球体聚集在板的一侧，并小心吸除尽可能多的培养基。向细胞中加入一毫升交感神经元培养基。

为将大的类球体聚集体分解为较小的类球体，每孔加入的培养基不得超过1毫升，并在分瓶前用移液器将类球体吹打5到10次。

从先前准备好的 24 孔板中去除多余的层粘连蛋白和纤连蛋白。将 24 孔球状体培养板中每孔的球状体按每孔 1 毫升的量，分种到新包被的 24 孔板的四个独立孔中。每孔加入 250 微升新鲜的交感神经元培养基，然后将培养板放入细胞培养箱中。次日上午，将每孔中的培养基更换为 1 毫升添加了 0.125 微摩尔视黄酸的交感神经元培养基，并将培养板放回细胞培养箱。第 35 天后，通过小心更换每孔中一半的原有培养基为新鲜培养基，对神经元进行换液喂养。