生物素化细胞表面蛋白的纯化上皮细胞

从 Rhipicephalus microplus 上皮肠细胞中纯化生物素化细胞表面蛋白。在这项研究中，利用一种改进的基于 Percoll 梯度的方法从 Rhipicephalus microplus 肠道组织中分离单个上皮细胞。表面结合的蛋白质被生物素化并通过链霉亲和素磁珠纯化，用于下游应用。

从半充血的 Rhipicephalus microplus 中解剖肠道上皮。您将需要以下材料。将一条胶带粘在培养皿的底部。

在胶带上滴一滴 Super Glue。将蜱虫腹侧朝下放在 Super Glue 上，让它干燥。将蜱虫完全浸入 100 mL PBS 中。

使用 11 号手术刀，从眼睛的顶部切开到蜱虫两侧的底部花饰。使用无菌镊子，完全去除盾片和尿囊膜，露出内部器官。去除细小的白色线状器官和其他膜。

用镊子去除肠道。将肠道储存在冰冷的 HBSS 和 PIC 中。上皮细胞解离。

您将需要以下材料。将解剖的肠道倒入 50 mL Falcon 管内的 70 微米细胞过滤器上。由于 Falcon 管内可能会形成真空，请提起过滤器以允许空气流通。

用 50 mL 冰冷的 HBSS 和 PIC 冲洗肠道组织。将内脏重悬于带有 PIC 的 30 mL 冰冷 HBSS 中。如有必要，使用无菌刮刀协助肠道重悬。

以 500 g 离心。去除上清液并重复洗涤过程 3 次。将肠道细胞重悬于 10 mL DMEM、2%FCS、5 毫摩尔 EDTA、1 毫摩尔 TCEP 和 PIC 中。

轻轻混合。使用 滚筒在 37 摄氏度下缓慢旋转孵育 60 分钟。通过 250 微米的细胞过滤器过滤悬浮液。

涡旋流过。并通过 70 微米的细胞过滤器过滤，收集剩余的流过。离心悬浮液。

使用 Percoll 梯度分离单个上皮细胞。您将需要以下材料。通过 AP15 预滤纸过滤，在 Milli-Q 水中制备 40% 和 20%Percoll。

在无菌注射器中加入 Percoll 溶液。将其应用于过滤装置并缓慢排出 Percoll。在 4 摄氏度下冷却一小时，然后分层渐变。

如图所示设置蠕动泵。使用设置为最低速的蠕动泵，将 3 mL 40% Percoll 分层到 16 mL 超速离心管中。让它在冰上沉淀 15 分钟。

泵的速度应导致流速小于每分钟 1 mL。将试管倾斜 45 度角，使用蠕动泵将 20% Percoll 分层在 40% 层的顶部。确保输出管靠在离心管上，以防止液滴与下层混合。

泵的速度应导致流速小于每分钟 1 mL。让各层在冰上沉淀 15 分钟。使用蠕动泵以低于每分钟 1 mL 的流速对含有分离的上皮细胞的 DMEM 溶液进行分层，梯度为 20% 至 40%。

确保输出管靠在离心管上，以防止液滴与下层混合，从而破坏梯度。以 600 g 离心 10 分钟。收集 DMEM、20% Percoll 梯度和 20%40% Percoll 梯度之间的间期以分离上皮单细胞。

细胞表面蛋白生物素化和生物素化表面蛋白的分离。您将需要以下材料。根据制造商的说明，使用 Biotin Type A 偶联试剂盒对 100 μL 单细胞上皮细胞进行生物素化。

向生物素化细胞中加入 100 微升 PBS、1% Triton X-100、10% 甘油、100 微摩尔氧化谷胱甘肽和 PIC。在冰上孵育一小时，每 10 分钟轻轻混合一次。将细胞提取物在 4 摄氏度下以 20， 000 g 离心 20 分钟，然后放置。

用 1， 000 微升 TBS 1%Tween-20 洗涤，制备 50 微升链霉亲和素磁珠。用手指轻弹轻轻混合。将试管放入磁力架中，将磁珠收集在试管的侧面。

取出并丢弃上清液。将 300 μL 生物素化的细胞表面蛋白与洗涤的磁珠混合。在室温下搅拌孵育 2 小时。

用磁力架收集珠子，去除并丢弃上清液。向试管中加入 300 微升 TBS 1%Tween-20，轻轻混合以重悬珠子。收集珠子，去除并丢弃上清液。

重复此洗涤步骤两次。向磁珠中加入 100 微升 1 摩尔甘氨酸 pH 2。并在室温下孵育 5 分钟。

收集珠子并去除含有洗脱的生物素化表面蛋白的上清液。图 1 表示用于从整蜱中分离上皮细胞及其表面蛋白的方案。利用该方案，可以从 50 个蜱虫的初始解剖中纯化大约 1.2 x 10 到 7 个细胞/mL，活力为 75% 至 80%，以及 20 至 24 μg 纯化的生物素化表面蛋白。

使用该方案制备的蜱上皮细胞的代表性荧光显微镜图像如图 2A 和 2B 所示。细胞表现为单一的、球形的、光滑的表面形态，并且在整个样品中大小一致。较差的分离物被可视化为包含单个上皮细胞的不完全解离，通过不同的细胞大小和形态鉴定出不同的细胞群。

通过充分冲洗蜱肠道以产生白色或清晰的 Percoll 梯度，可以最大限度地减少来自宿主蛋白的交叉污染，图 3A。通过 SDS-PAGE、图 4A、银染、图 4B、斑点印迹、图 5 和 ELISA（图 6）对蛋白质的比较表明，所描述的方法成功地从从 Rhipicephalus microplus 蜱肠道分离的单个上皮细胞中纯化了生物素化表面蛋白。总之，本研究中采用的方法成功地从 Rhipicephalus microplus 的整个肠道中分离出单个上皮细胞。

获得来自 Rhipicephalus microplus 上皮细胞表面的蛋白质用于进一步分析和研究。最后，开发的方案证明了来自蜱肠道的单个上皮细胞的潜在产量和细胞生物素化表面蛋白的效率。开发的方案可用于任何具有经济意义的蜱物种，通过研究肠道的膜蛋白组成来研究蜱虫与宿主的相互作用。