从细胞表面纯化生物素标记的蛋白质 微小牛蜱 上皮肠道细胞

从微小牛蜱（Rhipicephalus microplus）肠道上皮细胞中纯化生物素标记的细胞表面蛋白。本研究采用改良的基于Percoll梯度的方法，从微小牛蜱肠道组织中分离单个上皮细胞。细胞表面结合的蛋白质经生物素标记后，利用链霉亲和素磁珠进行纯化，以用于后续应用。

从半饱血的微小牛蜱（Rhipicephalus microplus）中分离肠道上皮。您将需要以下材料：将一条胶带粘附在培养皿底部。

在胶带上滴一滴超级胶水。将蜱虫腹面朝下放置在超级胶水上，待其完全干燥。随后将蜱虫完全浸入 100 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）中。

使用11号手术刀，从蜱虫两侧眼睛顶部到底部皱褶处进行切割。用无菌镊子完全移除盾板和后盾板，以暴露内部器官。去除细小的白色丝状器官及其他膜状结构。

使用镊子取出肠道。将肠道储存在冰上预冷的 HBSS 和 PIC 中。上皮细胞分离。

您将需要以下材料。将解剖得到的肠道组织倒入置于50 mL Falcon离心管内的70微米细胞滤筛中。由于Falcon管内可能形成负压，需抬起滤筛以允许空气流通。

用 50 mL 冰冷的含 PIC 的 HBSS 冲洗肠道组织。将肠道在 30 mL 冰冷的含 PIC 的 HBSS 中重悬。如有必要，可使用无菌刮勺辅助肠道重悬。

在500 ×g条件下离心。弃去上清液，并重复洗涤过程三次。将肠道细胞重悬于10 mL DMEM、2% FCS、5毫摩尔EDTA、1毫摩尔TCEP及PIC中。

轻柔混匀。在37摄氏度下缓慢旋转孵育60分钟，使用滚轴仪。通过250微米细胞滤网过滤悬液。

涡旋混匀流穿液，然后通过70微米细胞滤筛过滤，收集剩余的流穿液。离心悬浮液。

使用Percoll梯度分离单个上皮细胞。您将需要以下材料。通过AP15预过滤纸过滤，用Milli-Q水配制40%和20%的Percoll溶液。

用无菌注射器吸取Percoll溶液。将其加入滤器装置，并缓慢排出Percoll。在分层梯度前，于4°C冷却一小时。

按照图示设置蠕动泵。使用蠕动泵以最低转速将 3 mL 的 40% Percoll 缓慢加入一支 16 mL 超速离心管中。置于冰上静置 15 分钟。

泵速应使流速低于每分钟1毫升。将离心管倾斜至45度角，使用蠕动泵将20% Percoll缓慢铺加在40% Percoll层上方。确保输出管末端紧贴离心管内壁，以防止液滴直接滴落导致与下层液体混合。

泵的速度应使流速低于每分钟1 mL。将各层在冰上静置15分钟。使用蠕动泵以低于每分钟1 mL的流速，将含有分离上皮细胞的3 mL DMEM溶液缓慢铺加到20%至40% Percoll梯度液上。

确保输出管紧贴离心管，以防止液滴与下层混合，破坏梯度。在600 ×g条件下离心10分钟。收集DMEM、20% Percoll梯度以及20%/40% Percoll梯度之间的界面层，以分离上皮单细胞。

细胞表面蛋白的生物素标记及生物素化表面蛋白的分离。您将需要以下材料。按照生产商说明书，使用A型生物素偶联试剂盒对100微升单细胞上皮细胞进行生物素标记。

向生物素标记的细胞中加入 100 µL PBS、1% Triton X-100、10% 甘油、100 µmol 氧化型谷胱甘肽以及蛋白酶抑制剂混合物（PIC）。在冰上孵育 1 小时，每 10 分钟轻柔混匀一次。在 4 °C 条件下以 20,000 ×g 离心 20 分钟，收集上清，置于一旁备用。

用 1,000 微升含 1% Tween-20 的 TBS 缓冲液洗涤 50 微升链霉亲和素磁珠。用手指轻弹管壁，轻轻混匀。将离心管置于磁力架中，使磁珠吸附在管壁一侧。

移除并弃去上清液。将300微升生物素标记的细胞表面蛋白与洗涤后的磁珠混合。室温下振荡孵育两小时。

将磁珠置于磁力架上收集，移除并弃去上清液。向管中加入300微升含1% Tween-20的TBS缓冲液，轻轻混匀以重新悬浮磁珠。收集磁珠，移除并弃去上清液。

重复此洗涤步骤两次。向磁珠中加入100微升pH为2的1摩尔甘氨酸溶液，并在室温下孵育5分钟。

收集磁珠并移除含有洗脱的生物素化表面蛋白的上清液。图一展示了从完整蜱虫中分离上皮细胞及其表面蛋白所采用的实验方案示意图。利用该方案，通过最初解剖50只蜱虫，可纯化得到约每毫升1.2 × 10⁷个细胞，细胞活力为75%至80%，并可获得20至24微克的纯化生物素化表面蛋白。

采用本方案制备的蜱虫肠上皮细胞的代表性荧光显微镜图像如图2A和2B所示。细胞呈单个、球形、表面光滑的形态，且在整个样本中大小一致。分离效果较差的样本在图像中可见上皮细胞未完全解离，且通过细胞大小和形态的差异可识别出不同的细胞群体。

通过充分冲洗蜱虫肠道以获得白色或透明的Percoll梯度（图3B），可以最大限度地减少宿主蛋白带来的交叉污染（图3A）。通过SDS-PAGE（图4A）、银染（图4B）、点印迹（图5）和ELISA（图6）对蛋白质进行比较，结果表明，本研究所描述的方法成功地从分离自微小牛蜱（Rhipicephalus microplus）肠道的单个上皮细胞中纯化出生物素标记的表面蛋白。总之，本研究采用的方法成功地从微小牛蜱完整肠道中分离出单个上皮细胞。

获取了微小牛蜱（Rhipicephalus microplus）上皮细胞表面的蛋白质，用于进一步分析和研究。最终，所建立的实验方案展示了从蜱肠道中分离单个上皮细胞的潜在产量，以及细胞表面生物素标记蛋白质的高效性。该方案可应用于具有重要经济意义的任何蜱类物种，通过研究其肠道膜蛋白组成，以促进对蜱-宿主相互作用的深入探究。