人脐静脉内皮细胞的分离及其在流动条件下中性粒细胞跨内皮迁移研究中的应用

本实验的总体目标是分离高质量的人源内皮细胞，并利用这些细胞在低流条件下研究中性粒细胞跨内皮迁移的调控机制。该目标通过以下步骤实现：首先分离并接种人脐静脉内皮细胞，第二步是将细胞接种至IBD小室中。

接下来，将新分离的人类中性粒细胞灌注到活化的内皮细胞上，诱导中性粒细胞滚动、牢固黏附及跨内皮迁移。最后一步是利用视频显微镜定量分析跨内皮迁移过程。最终可通过荧光显微镜和明场显微镜评估中性粒细胞穿越活化内皮细胞的能力。

内皮细胞的分离方法虽易于描述，但学习起来较为困难，部分原因在于关键步骤需要对脐带进行可视化观察。因此，对该方法进行直观演示至关重要。该方法将有助于我们理解炎症领域的关键问题，例如在流动条件下白细胞如何被招募，以及内皮细胞在流动条件下的行为将得到更深入的认识。

尽管该方法可用于研究炎症过程中中性粒细胞的募集，也可应用于自然杀伤细胞和嗜酸性粒细胞等稀有白细胞群体。与Ritu Sharma共同演示该实验步骤的是我实验室的技术员Hong Jang。在实验开始前至少一小时，预先将T75培养瓶用明胶在37摄氏度下孵育。

然后在超净工作台中开始内皮细胞分离操作：使用剪刀从胎盘上剪取一段脐带。更换为无菌手套后，仔细检查脐带，弃去含有血凝块或因分娩时夹闭脐带而受损的部分。随后辨认脐带中的两条动脉和一条静脉。

接下来，将连接有双向停流阀的导管轻轻插入静脉的一端，然后在导管周围放置一个夹子以牢固固定其位置。该操作过程中最困难的部分之一是脐带的灌注。为确保灌注成功，需用过量缓冲液对脐带进行灌注，并观察液体流动，直至流出液变澄清为止。

用脐带缓冲液灌注脐静脉，直至流出液变澄清，然后夹闭脐带末端。在灌注过程中，有时会暴露出一个小孔，这是由于医生已从脐带中采集了脐带血所致。在此类情况下，可使用止血钳封闭小孔，并在分离内皮细胞的同时继续进行灌注。

准确控制胶原酶处理的时间至关重要。处理时间过短，收获的内皮细胞数量不足；处理时间过长，则可能导致平滑肌细胞污染或内皮细胞受损。随后，用新配制的温热胶原酶溶液灌注静脉。

关闭旋塞，将脐带置于含有温热脐带缓冲液的烧杯中孵育。10分钟后取出，轻轻按摩脐带，使内皮细胞从静脉管腔中松脱。将溶液引流至含有5 mL内皮细胞培养基的离心管中，并用脐带缓冲液冲洗脐带两次，以去除残留的细胞。

现在将细胞在室温下以350 × g离心10分钟，弃去上清液，然后将沉淀重悬于10毫升内皮细胞培养基中，转移至经明胶包被的T75培养瓶中，在37°C、5% CO₂条件下培养内皮细胞过夜。次日，轻轻振摇培养瓶以去除任何残留的红细胞。

然后移除上清液，并用预热的HBSS洗涤内皮细胞培养物。移除HBSS后，加入10毫升预热的ECM培养细胞。随后在显微镜下观察细胞，以确认红细胞已被去除，并评估内皮细胞的汇合程度及形态。

每隔三天更换一次培养基，直至细胞达到汇合。此时，使用胰蛋白酶和EDTA溶液对细胞进行传代。随后收集脱落的细胞，并将其重悬于ECM中。

最后，用明胶包被IBD小室的每个孔，去除多余的明胶，然后向小室的每个孔中加入浓度为1.5 × 10⁶ /mL的内皮细胞悬液。在内皮细胞被激活的同时，通过将内皮细胞与适当的刺激物共同孵育，诱导细胞表面黏附分子和活化分子的上调表达。

通过密度梯度离心法从健康志愿者的外周血中分离中性粒细胞，该方法已有文献报道。随后将细胞重悬于含人血清白蛋白的HBSS中，浓度为1 × 10⁶ 个/毫升。显微镜准备就绪后，将含有经刺激的内皮细胞的IBD小室连接至显微镜的管路系统。选择10 × 相差物镜，然后设定注射泵以设定的切应力开始抽吸并启动HBSS流动。

通过将出口侧的三通旋塞阀转至关断位置，短暂停止流动，并将进口管路由HBSS切换至分离的中性粒细胞。再将旋塞阀转回开启位置，重新启动流动。随后使用连接至DVD录像机的CCD相机开始记录。

启动计时器。当嗜中性粒细胞在四分钟后进入腔室时，切换回 HBSS 以防止新的嗜中性粒细胞附着。如果需要获取滚动和牢固黏附的总相互作用数据，请使用 10 x 相差显微镜。

在第4至第5分钟之间，使用10倍物镜对六个随机视野进行成像，每个视野成像10秒。最后切换至40倍物镜，在目标时间点记录单个视野。中性粒细胞灌注10分钟后，采集5到10个随机视野。

未受刺激的内皮细胞不支持中性粒细胞的招募。因此，以下图示显示的是中性粒细胞与经TNF alpha刺激后的内皮细胞之间的相互作用。请注意，黄色箭头所示为黏附的中性粒细胞，白色箭头所示为正在跨内皮迁移的中性粒细胞。

中性粒细胞的跨内皮迁移可发生在细胞连接处或直接穿过内皮细胞本身。为了区分这两种情况，使用抗VE-cadherin抗体对内皮细胞进行标记。如图中红色所示，迁移被判定为发生在细胞间（旁细胞途径）或穿越细胞（跨细胞途径）。

在此模型中，几乎所有跨内皮迁移均为细胞旁途径，这一点可通过本图中前两幅图像的叠加结果得以证实。在三幅图中的第一幅中，使用 ImageJ 软件对中性粒细胞的相互作用进行了观察和测量。需要注意的是，中性粒细胞与经 TNF alpha 激活的内皮细胞之间的相互作用显著多于与未受刺激的对照组内皮细胞之间的相互作用。

总相互作用细胞进一步被分为滚动、牢固黏附或跨内皮迁移，方法同前。在分离内皮细胞后，含有活化内皮细胞的孔中，中性粒细胞跨内皮迁移显著增多。其他方法如蛋白质印迹、实时PCR和内皮电阻检测可在内皮细胞生物学相关附加问题的研究中应用。

该方法将有助于炎症和血管生物学领域的研究人员理解在人体模型系统中流动条件下白细胞募集的过程。观看本视频后，您应能够充分掌握如何分离人脐静脉内皮细胞，并利用这些细胞在流动条件下通过显微灌流腔室研究中性粒细胞的跨内皮迁移。