分离人脐静脉内皮细胞和水流条件下其使用中的中性粒细胞轮回研究

本文首先介绍了人类脐静脉内皮细胞的分离的过程，然后演示如何使用这些细胞检查流量条件下的中性粒细胞轮回。通过使用低体积流量室从玻璃的光学特性的聚合物制成，活细胞荧光成像罕见的细胞群也是可能的。

该程序的总体目标是分离高质量的人内皮细胞，并使用它们来检查调节中性粒细胞反式迁移、条件的机制。这是通过首先分离和铺板人脐静脉内皮细胞来实现的。第二步是将细胞分成 IBD 腔室。

接下来，新鲜分离的人中性粒细胞在活化的内皮细胞中传播，导致中性粒细胞滚动牢固粘附和迁移。最后一步是使用视频显微镜量化轮回。最终，荧光和明场显微镜可用于评估中性粒细胞跨活化内皮细胞的迁移。

内皮细胞分离很容易描述，但很难学习，部分原因是关键步骤需要脐带的可视化。因此，这种方法的视觉演示至关重要。这种方法将帮助我们理解炎症领域的关键问题，例如白细胞募集在流动条件下如何发生，以及内皮细胞在流动条件下的行为会更好。理解。

虽然这种方法可以提供对炎症期间中性粒细胞募集的见解。它也可以应用于白细胞稀有群体，如自然杀伤细胞和嗜酸性粒细胞。与 Ritu Sharma 一起演示此程序的是我实验室的技术人员 Hong Jang，至少在手术前一小时，然后在 75 摄氏度下将 T 37 烧瓶与明胶孵育。

然后用一把剪刀从胎盘上剪下脐带，在层流罩中开始内皮细胞分离程序。换上无菌手套后，仔细检查脐带并丢弃任何含有血栓或在分娩过程中因夹脐带而损坏的部分。然后确定脊髓中存在的两条动脉和单静脉。

接下来，将带有双向止动旋塞的套管轻轻插入静脉的一端，然后在套管周围放置一个夹子以将其牢固地固定到位。该程序最棘手的部分之一是灌注脐带。为确保成功完成，请在脐带中灌注过量的缓冲液，并观察流过，直到流过。

用脐带缓冲液灌注静脉，直到流经畅通，然后夹住脐带的末端。在灌注过程中，偶尔会露出一个小孔，因为医生已经从脐带中取出了脐带血。在这些情况下，可以使用止血钳来堵塞孔，并且可以在隔离内皮细胞的同时继续灌注。

精确安排胶原酶治疗的时间至关重要。时间太少和内皮细胞不够，收获时间过长，可能会污染平滑肌细胞或损伤内皮细胞。然后用新鲜制备的温热胶原酶灌注静脉。

关闭旋塞，将脐带放入装有温热脐带缓冲液的烧杯中孵育脐带。10 分钟后，取下然后轻轻按摩脐带，以松开静脉腔内的内皮细胞。将溶液排空到含有 5 mL 内皮细胞培养基或 ECM 的试管中，用脐带缓冲液冲洗脐带两次，以去除任何残留的细胞。

室温下将细胞旋转 3 次 50 G.At 10 分钟，去除上清液，然后重悬沉淀。在 10 毫升内皮细胞培养基中，将细胞转移到明胶包被的 T 75 培养瓶中并培养，内皮细胞在 37 摄氏度和 5%CO 2 下过夜。第二天，轻轻摇动培养瓶以去除任何红细胞。

然后去除上清液，用温热的 HBSS 洗涤内皮细胞培养物。去除 HBSS 后，用 10 毫升温热的 ECM 喂养细胞。然后在显微镜下检查细胞，以确保去除红细胞，并评估内皮细胞的汇合程度和形态。

继续每三天更换一次培养基，直到细胞达到共流畅度。此时，使用胰蛋白酶和 EDTA 溶液分离细胞。然后收获分离的细胞并将其重悬于 ECM 中。

最后，用明胶涂覆 IBD 室的每个孔。除去过量的明胶，然后将每毫升 6 的内皮细胞悬液中加入 1.5 乘以 10 的剂量，加入腔室的每个孔中。首先通过在内皮细胞被激活时用适当的刺激剂孵育内皮细胞来诱导粘附和活化分子细胞表面表达的上调。

如前所述，通过密度离心法从健康人类志愿者的外周血中分离中性粒细胞，然后在 HBSS 加人白蛋白中以 1 倍 10 至 6/mL 的浓度悬浮细胞。设置显微镜后，将包含刺激的内皮细胞的 IBD 室连接到显微镜的管道上。选择 10 x 相差物镜，然后将注射泵设置为抽出，并在所需的剪切应力下开始 HBSS 的流动。

将出口侧的三向旋塞旋塞转到关闭位置，并将入口管路从 HBSS 切换到分离的嗜中性粒细胞，短暂停止流速。通过将旋塞转回 on 位置，再次启动液流。然后使用连接到 A DVD 刻录机的 CCD 相机开始录制。

启动计时器。当中性粒细胞在 4 分钟后进入腔室时，切换回 HBSS 以防止新的中性粒细胞附着。如果需要总相互作用滚动和牢固粘附的数据，请使用 10 x 相差。

目标 在 4 到 5 分钟之间对 6 个随机场进行 10 秒的成像。最后切换到 40 倍物镜并在感兴趣的时间记录单个视野。中性粒细胞灌注 10 分钟后，收集 5 到 10 个随机视野。

未刺激的内皮细胞不支持中性粒细胞募集。因此，下图显示了中性粒细胞与 TNF α 刺激的内皮细胞相互作用。请注意黄色箭头所示的贴壁中性粒细胞和白色箭头所示的反式迁移中性粒细胞。

中性粒细胞迁移可以发生在细胞连接处或通过内皮细胞本身。为了区分这两种情况，用抗 VE 相干抗体标记内皮细胞。如此处红色所示，迁移被评分为发生在细胞旁或跨细胞。

在这个模型中，几乎所有的轮回都是旁细胞的，如图所示，显示了前两个图的叠加。在三张图中的第一张图中，使用 image J 软件检查和测量了中性粒细胞相互作用。请注意，与对照未刺激的内皮细胞相比，中性粒细胞和 TNF α 活化的内皮细胞之间发生的中性粒细胞内皮细胞相互作用明显更多。

总相互作用的细胞进一步表征为像以前一样滚动或牢固粘附或反式迁移。分离内皮细胞后，在含有活化内皮细胞的孔中发生显着更多的中性粒细胞迁移。可以执行其他方法，如蛋白质印迹、实时 PCR 和内皮抗性，以回答与发育后内皮细胞生物学相关的其他问题。

这种方法将帮助炎症和血管生物学领域的研究人员了解白细胞募集在人体模型系统中的流动条件下是如何发生的。看完这个视频后，你应该对如何分离人脐静脉内皮细胞有一个很好的了解，并使用它们来研究在流动条件下使用ity chamber的中性粒细胞迁移。