体外流动下单核细胞亚群的同时研究

因为这种方法可以帮助回答炎症和免疫学领域的关键问题。例如，白细胞粘附和跨内皮迁移的分子机制是什么？这种技术的主要优点是，它允许无限使用之间的异化和强添加单核细胞到内皮单层之间的无限使用。

虽然这种方法提供了有关在流中招募单细胞的信息，但它也可以适应造血系统的其他细胞，如T细胞、B细胞或亚细胞的衍生物。洗涤后，用30微升37摄氏度M199介质标记人体脐静脉内皮细胞或HUVEC，辅以1微摩尔CMFDA，在37摄氏度和5%的二氧化碳下进行10分钟。在孵育结束时，用150微升完整M199培养的培养液清洗细胞，并在150微升新鲜完整M199培养的培养中再孵育30分钟。

然后用150微升的完整的M199介质，包含适当的实验补充剂，并返回幻灯片室培养器6小时。对于人类PAN单细胞分离，稀释PBS中新鲜采集的血液样本，以一比一的比例补充1毫摩尔EDTA，并小心地将20ml血液溶液分层到20ml密度梯度介质上，通过离心进行密度梯度分离。将中外周外体血细胞血小板层收集到含有 40 ml PBS 的新的 50 ml 管中，并辅以 1 毫摩尔 EDTA，并在计数后将最终体积与额外的 PBS-EDTA 一起放入 50 ml，然后根据制造商的说明使用 PAN 单核细胞分离试剂盒分离单核细胞。

在M199介质中三次清洗细胞，辅以0.5%牛血清白蛋白或BSA，以消除EDTA的任何痕迹。单细胞分离的质量对于确保强大的迁移和粘附结果至关重要。因此，必须严格遵守制造商的隔离建议。

在新鲜M199介质中，以每毫升6倍至6个单核细胞浓度重新加入颗粒，并辅以0.5%BSA，将细胞分成每微离心管200微升等分法。然后将细胞在37摄氏度下放置20分钟，然后注射到流室。要准备用于分析的流体系统，请先将公 luer 连接器插入 8 厘米长 3 毫米厚的硅胶管的一端，然后将另一端连接到内联 luer 喷射装置。

然后将 luer 连接器连接到一块 40 厘米长、3 毫米厚的硅胶管的一端。接下来，将 20 mm 注射器插入一端 1 米长 3 毫米厚的硅胶管，并将公用 luer 连接器插入另一端。然后将两个公 luer 连接器插入母 luer 锁连接器，并将硅胶管的自由端放入 37 摄氏度 M199 介质的储液罐中，并辅以 0.5%BSA。

缩回柱塞，用流量缓冲液填充油管，并固定注射器泵上的注射器。然后将泵设置为提取模式并指定流量。要连接滑动室，请将硅胶管夹在母凸锁连接器周围，然后断开两个 luer 连接器与连接器的母连接器，以便将其连接到滑轨的储液罐。

气泡不仅干扰图像质量，而且会对细胞产生毛细管纯粹的压力，导致细胞死亡。为避免气泡，在将凸流器插入储液罐之前，请确认油管的正确夹紧。然后拆下夹子以确认连接未泄漏，然后将幻灯片置于显微镜下。

为对流动下的单细胞招募进行成像，在室温下将5微升面粉结合抗CD16抗体和适当的核染料加入每个等分单核细胞，在室温下孵育10分钟，并采集具有短暂离心的细胞。将颗粒重新注入 250 微升流量缓冲液中，然后启动注射器泵。将一个单核细胞悬浮液的30微升添加到幻灯片的一个腔室，并在共合显微镜上选择40倍的镜面。

激活适当的荧光激光器，并使用标有单细胞的腔室设置共合体显微镜的采集参数"下一步"，选择三个视场在半厘米半径内进行多位置共声成像，将 Z 堆栈设置为 10 到 12 微米范围，并且每一分钟运行一次时间推移采集。经过三分钟的成像，通过内联 luer 注射口注入 200 微升单核细胞，并开始成像细胞相互作用。至少 30 分钟后，停止成像和流量并夹紧油管，以便将其与幻灯片断开。

要通过受刺激的HUVECs确定细胞的迁移速率，请打开图像J并计算每个字段中粘附单细胞的总数，以确定每平方毫米的细胞计数。然后计算在内皮细胞下方的基底平面中存在的异化单核的数量，如细胞核周围黑洞区的存在所识别。一个简单的方法来检查HUVECs的激活状态刺激后是可视化其在炎症压力下的伸长。

时间推移共物成像允许在可评估其表型的平面上对单细胞进行可视化。迁移的细胞在从平面上消失并重新出现在基底平面之前，会移动到细胞间细胞到细胞的交汇点。随着时间的推移，单细胞招募的定量证实，单细胞粘附后跟转位。

当内皮细胞仅用TNF alpha刺激时，CD16阳性单细胞的迁移率较低，但当内皮细胞同时使用TNFα和血管内皮生长因子或维格法刺激时，迁移率会上升。与CD14阳性单细胞相比，使用TNF alpha和TNF alpha加VEGFA的HUVEC刺激诱导CD14阴性T、B和NK细胞的依从性增加。此外，HUVEC刺激只诱导单细胞种群的迁移，因为T、B和NK细胞在TNF alpha或TNF alpha加上VEGFA刺激条件下不会迁移。

要进行最佳的单核细胞招募测定，重要的是您提前计划实验并在同一天进行。当您净化细胞时，请确保您的显微镜在37度，这样在实验中不会将细胞转移到不同的温度。为了学习这个程序，可以执行所有的方法，如HUVEC细胞因子和化疗表达的特征分析，以及化疗研究，以回答有关分子机制的附加问题，维持特定单细胞群体迁移和粘附。