Name: 体外流动下单核细胞亚群的同时研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: 学习利用共聚焦荧光显微镜和特异性表面标记，在体外流动条件下同时研究单核细胞亚群的黏附与跨内皮迁移机制。该方法可扩展应用于其他造血细胞类型的分析。

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感谢 Paul Bradfield 博士对文稿的审阅和反馈。A. S. 收到了来自 Sir Jules Thorn 慈善海外信托注册机构的经济支持，

人体材料的使用已获得志愿者捐献者的知情同意，并符合瑞士临床研究伦理委员会的规定。
1. 人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的分离与冻存
<ol>
	<li>在开始 HUVEC 分离前，向 T75 培养瓶中加入 5 mL 包被液（含 0.1 mg/mL 胶原蛋白 G 和 0.2% 明胶的 pH 7.4 磷酸盐缓冲液 PBS），于 37 °C 孵育 30 分钟。</li>
	<li>用 PBS 清洗脐带，以无菌纱布擦拭，并将其置于无菌的 20 cm 培养皿中。用无菌剪刀剪去脐带两端。</li>
	<li>识别单根大静脉和两根小动脉。将连接三通止液夹的导管轻轻插入脐带两端的静脉末端。</li>
	<li>用一段金属丝牢固地固定脐带与导管的连接处。</li>
	<li>用含 100 U/mL 青霉素、100 U/mL 链霉素和 250 ng/mL 两性霉素 B 的 RPMI 培养基各 20 mL 对脐带灌注两次，以清洗脐静脉。此过程会使脐带外观变得更白更透明。在加入胶原酶前，用注射器从一端收集 RPMI 培养基，排空静脉。</li>
	<li>用 12 mL 1 mg/mL I 型胶原酶溶液（经 0.22 µm 滤膜过滤）灌注静脉。</li>
	<li>关闭脐带两端的止液夹，于 37 °C 孵育 12 分钟。</li>
	<li>轻轻按摩脐带，使内皮细胞从静脉腔脱落。</li>
	<li>用 50 mL 注射器吸取 30 mL 含 10% 胎牛血清的 RPMI 培养基，并连接至脐带一端。</li>
	<li>将一个空的 50 mL 注射器连接至脐带另一端。</li>
	<li>打开止液夹，从一端灌注静脉，同时从另一端交替收集液体。 
	注意： 收集到的悬液中含有内皮细胞。</li>
	<li>将该细胞悬液以 200 x g 离心 5 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，用 10 mL 完全 M199 培养基重悬细胞沉淀（M199 培养基含 20% 胎牛血清、15 µg/mL 内皮细胞生长补充物、100 µg/mL 肝素钠、0.5 µM 氢化可的松、10 µg/mL L-抗坏血酸、100 U/mL 青霉素、100 U/mL 链霉素和 250 ng/mL 两性霉素 B）。</li>
	<li>从 T75 培养瓶中移除包被液，并用 PBS 冲洗一次。</li>
	<li>将步骤 1.13 收集的细胞接种至 T75 培养瓶中，置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中培养。</li>
	<li>次日，用完全 M199 培养基冲洗培养瓶 3 次以去除残留的红细胞，之后每 2 天更换一次培养基，直至细胞融合。</li>
	<li>当细胞融合度达 80–90% 时，用 5 mL PBS 冲洗 HUVEC 单层细胞一次，再加入 5 mL 含 1 mM EDTA 的 0.05% 胰蛋白酶于 37 °C 消化 5 分钟。加入 4 mL M199 培养基和 1 mL 胎牛血清以终止胰蛋白酶作用。轻柔吹打培养瓶，使所有 HUVEC 脱落。</li>
	<li>取 50 µL 细胞样品用于 VE-钙黏蛋白、PECAM-1 和 gp38 的染色，并通过流式细胞术分析以检测 HUVEC 纯度。</li>
	<li>将步骤 1.18 剩余的 HUVEC 收集至 15 mL 离心管中，于室温下以 200 x g 离心 5 分钟。</li>
	<li>弃去步骤 1.19 的上清液，用冻存液（含 10% DMSO 的胎牛血清）将细胞沉淀重悬至密度为 5 x 105 个细胞/mL，分装至冻存管中，于 -80 °C 或液氮中保存备用。</li>
	<li>检测 HUVEC 纯度：
	<ol>
		<li>向步骤 1.18 收集的 50 µL HUVEC 样品中加入 1 µL 抗人 VE-钙黏蛋白-FITC 抗体、1 µL 抗人 PECAM-1-PE 抗体和 1 µL 抗人 Podoplanin-APC 抗体。</li>
		<li>室温孵育 10 分钟。</li>
		<li>加入 100 µL PBS，以 400 x g 离心 30 秒。</li>
		<li>弃去上清液，用 100 µL PBS 重悬细胞。现在可通过流式细胞术获取数据。 
		注意： HUVEC 对 VE-钙黏蛋白和 PECAM-1 呈阳性，对 Podoplanin 呈阴性。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. HUVEC 解冻
注意：实验中使用低代次的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）（最多不超过5代）。
<ol>
	<li>在 37 °C 下，用 1 mL 包被液对 T75 培养瓶进行包被，孵育 30 分钟。</li>
	<li>在 37 °C 下快速解冻 HUVEC 细胞 2 分钟，并将细胞重悬于 10 mL 完全 M199 培养基中。</li>
	<li>在室温下以 200 × g 离心细胞 5 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于 10 mL 完全 M199 培养基中。</li>
	<li>将细胞悬液转移至预先包被的培养瓶中。将培养瓶置于含 5% CO2 的 37 °C 培养箱中培养，每 2 天更换一次培养基。</li>
</ol>
3. 0.4 µ-Slide 培养小室中 HUVEC 的培养
<ol>
	<li>在开始流体实验前五天，将含有0.1 mg/mL胶原蛋白G和0.2%明胶的30 µL PBS加入0.4 µ-载玻片的腔室中，于37 °C孵育30分钟，预先包被腔室。</li>
	<li>用100 µL PBS洗涤腔室。</li>
	<li>从T75培养瓶中处于80–90%融合状态的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）上消化细胞。</li>
	<li>用5 mL PBS冲洗HUVEC，并加入5 mL 0.05%胰蛋白酶，在37 °C下消化5分钟以脱离细胞。</li>
	<li>冲洗并收集细胞悬液至完全M199培养基中，采用最便捷的方法计数细胞。在室温下以200 × g离心5分钟。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬至浓度为106 个细胞/mL，每腔室加入30 µL（含30,000个细胞）。</li>
	<li>将细胞置于37 °C、5% CO2的培养箱中孵育1小时。</li>
	<li>向每个腔室加入150 µL完全M199培养基，在37 °C、5% CO2培养箱中继续培养5天，每2天更换一次培养基。</li>
</ol>
4. 流动条件下内皮细胞单核细胞募集实验的染色
<ol>
	<li>在细胞标记前，将由 M199 培养基和 1 µM CMFDA（5-氯甲基荧光素二乙酸酯）组成的标记培养基于 37 °C 预热 5 分钟。</li>
	<li>用 37 °C 预热的 M199 培养基洗涤 HUVEC 细胞两次。</li>
	<li>加入 30 µL 含 1 µM CMFDA 的预热标记培养基，置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中孵育 10 分钟。</li>
	<li>用完全 M199 培养基洗涤一次，然后在 37 °C、5% CO2 的培养箱中用完全 M199 培养基继续孵育细胞 30 分钟。 
	注意：在加入标记溶液前必须彻底去除血清残留，否则可能影响 HUVEC 的染色效果。</li>
	<li>更换为含人 TNFα（500 U/mL）或人 TNFα（500 U/mL）与人 VEGFA（1 µg/mL）混合物的完全 M199 培养基，在 37 °C、5% CO2 的培养箱中孵育 6 小时。</li>
</ol>
5. 人泛单核细胞的分离及亚群染色
<ol>
	<li>使用浓缩人血的血沉棕黄层，或采集于实验当日、含EDTA真空采血管中的20 mL新鲜分离人血。</li>
	<li>用 PBS-1 mM EDTA 将血液稀释（1:1），轻轻将 20 mL 稀释后的血液加至 20 mL 密度梯度介质上方。以 400 × g 离心 g 室温下缓慢加速，无刹车，离心30分钟。</li>
	<li>收集外周血单个核细胞（PBMC）-血小板层（位于密度梯度介质与血浆层之间），转移至含有40 mL PBS-1 mM EDTA的新的50 mL离心管中。用PBS-1 mM EDTA补至50 mL。</li>
	<li>200 x g 离心 g 室温孵育5分钟。弃去上清液。</li>
	<li>用10 mL染色缓冲液（含0.5%牛血清白蛋白BSA的PBS-1 mM EDTA）重悬细胞沉淀。</li>
	<li>以 200 x 离心 g 室温孵育5分钟。弃去上清液。</li>
	<li>重复步骤 5.5 和 5.6。</li>
	<li>用10 mL染色缓冲液重悬细胞沉淀。取一份等分试样 10 µL 用于细胞计数。</li>
	<li>使用流式细胞仪快速检测PBMC群体并计数细胞。 
	注意： 可以观察到特征性的淋巴细胞和单核细胞群体（图1A）。从 50 mL 新鲜人血中预计可获得 50–100 × 106 PBMC</li>
	<li>CD14+ 的招募 与 流式条件下的CD14- PBMC:
	<ol>
		<li>用流式缓冲液（含0.5% BSA的M199）洗涤细胞沉淀3次，并将单个核细胞重悬于流式缓冲液中，浓度为6 x 10⁶6 每毫升细胞数</li>
		<li>分装成等份 200 µL 每次检测。在 37 °C 直到检测前20分钟</li>
		<li>添加 5 µL 抗CD14-PE和Hoechst 33342，终浓度为 2 µM 向每份等分试样中加入。混匀后于 37 °C 10 分钟。</li>
		<li>将等分试样在400 x g离心 g 30秒。</li>
		<li>弃去上清液，用缓冲液重悬沉淀物 200 µL 流式缓冲液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在流动条件下单核细胞亚群的募集:
	<ol>
		<li>使用全单核细胞分离试剂盒，按照制造商说明书分离单核细胞。 
		注意： 以下分离方案适用于 50 x 106 细胞。只要在制造商建议的范围内，均可进行扩增或缩小。</li>
		<li>将 PBMC 悬液以 200 x g 室温下孵育5分钟。</li>
		<li>弃去上清液，用缓冲液重悬沉淀物 400 µL 染色缓冲液</li>
		<li>添加 50 µL Fc受体阻断试剂的 50 µL Pan 单核细胞抗体混合液</li>
		<li>室温孵育10分钟。</li>
		<li>添加 400 µL 染色缓冲液和 100 µL 磁珠偶联抗生物素抗体。室温孵育15分钟。</li>
		<li>加入2 mL染色缓冲液，使用与磁铁偶联的MACS LS柱。</li>
		<li>将LS柱置于磁铁上，加入1 mL染色缓冲液，弃去穿流液。</li>
		<li>将PBMC悬液通过柱子，收集含有泛单核细胞的澄清流穿液至新的15 mL离心管中。</li>
		<li>加入染色缓冲液至终体积5 mL。</li>
		<li>取一份等分试样，使用流式细胞仪检测单核细胞分离的质量。</li>
		<li>确定全单核细胞计数。 
		注意： 仅能观察到单核细胞群体 （图1B）.</li>
		<li>离心步骤5.11.11中剩余的单核细胞，200 x g 5 分钟。</li>
		<li>弃去上清液。</li>
		<li>将细胞沉淀重悬于5 mL流式缓冲液（含0.5% BSA的M199培养基）中。</li>
		<li>重复步骤 5.11.13 至 5.11.14 两次，以彻底去除 EDTA 残留。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在流式缓冲液（M199 加 0.5% BSA）中制备单核细胞悬液，浓度为 6 x 106 cells/mL</li>
	<li>分装成等份 200 µL 每次招募实验所需的单核细胞数量。</li>
	<li>保持分装样本于 37 °C 在注射前20分钟从培养箱中取出。</li>
	<li>添加 5 µL 抗CD16-PE抗体和Hoechst 33342（2 µM 最终）加入至每份等量样品中。</li>
	<li>混合并在指定条件下孵育 37 °C 10 分钟</li>
	<li>将等分试样在400 x g条件下离心 g 30 秒。</li>
	<li>弃去上清液，用缓冲液重悬沉淀物 250 µL 流式缓冲液</li>
	<li>添加 30 µL 将单核细胞悬液加入载玻片的一个腔室中，用于在共聚焦显微镜上设置采集参数。</li>
	<li>将第5.18步中制备的单核细胞悬液分装样品保存于 37 °C. 
	注意： 该悬浮液已准备好注入流动系统。</li>
</ol>
6. 流体系统的准备
<ol>
	<li>确保用于成像的细胞培养箱温度设置为 37 °C。 
	注意： 流动系统的示意图见图 2。</li>
	<li>组装管路部分 I：将一个公型鲁尔接头插入一段硅胶管（8 cm 长，3 mm 厚）的一端，另一端连接至在线鲁尔注射装置。将该鲁尔接头的另一端连接至另一段硅胶管（40 cm 长，3 mm 厚）的一端。 
	注意： 可选地，可在在线鲁尔注射装置与硅胶管之间插入一个三通旋塞，并连接一个 5 mL 注射器，以便去除可能存在的气泡。</li>
	<li>组装管路部分 II：将一个 20 mL 注射器连接至一段硅胶管（1 m 长，3 mm 厚）的一端。在管路的另一端插入一个公型鲁尔接头。</li>
	<li>通过将两个公型鲁尔接头插入一个母型鲁尔锁紧耦合器，连接管路部分 I 和部分 II（图 2A）。</li>
	<li>将硅胶管的自由端放入盛有预热至 37 °C 的流动缓冲液（M199 + 0.5% BSA）的储液槽中。</li>
	<li>拉动 20 mL 注射器的活塞，使管路中充满流动缓冲液。</li>
	<li>将注射器安装到泵上并固定。</li>
	<li>将泵设置为抽吸模式（而非灌注模式），并设定流速。</li>
	<li>根据所使用的 IBIDI 载片，使用以下公式确定流速： 
	<img alt="流速方程：剪切应力除以缓冲液黏度与载片因子；流体动力学公式。" src="/files/ftp_upload/58509/58509eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Equation"> 
	注意：载片因子取决于实验中所使用的 IBIDI 载片类型。本示例中使用的 µ-slide I0.4 Luer lock 载片因子为 131.6。具体载片因子请参见公司官网14。流动缓冲液的黏度为 0.0072 dyn.s/cm2。后微静脉处的剪切应力约为 0.5 dyn/cm2。</li>
	<li>连接载片（图 2B）：
	<ol>
		<li>用夹具夹住母型鲁尔锁紧耦合器周围的硅胶管，并将两个公型鲁尔接头从耦合器上断开。</li>
		<li>将它们分别连接至载片中含刺激后 HUVEC 的储液室，并用培养基充满。此步骤应避免产生气泡。</li>
		<li>取下夹具，确保连接处无泄漏。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将载片置于显微镜下进行延时成像，并启动泵。</li>
</ol>
7. 通过共聚焦显微镜进行流动条件下单核细胞募集的延时成像
<ol>
	<li>使用40倍物镜（见材料表）进行成像。</li>
	<li>启动405 nm（蓝色单核细胞核）、488 nm（绿色内皮细胞）和561 nm（红色CD16+亚群）激光器。</li>
	<li>使用含有单核细胞的腔室设置采集参数。 
	注意： 为同时检测未迁移和已迁移的单核细胞，需将405 nm激光的针孔和激光强度设置较高。因此，未迁移的单核细胞在基底层面可轻微可见，但只有已迁移的单核细胞在细胞核周围呈现未染色区域，该区域对应其位于内皮细胞下方所占据的新空间。</li>
	<li>将待采集的腔室置于显微镜下。</li>
	<li>在1 cm半径范围内选择3个视野，用于多点共聚焦成像。</li>
	<li>确定内皮细胞的基底侧和顶侧。</li>
	<li>设置z轴堆栈范围为10–12 µm（步长0.5 µm），每1分钟进行一次时间序列采集。</li>
	<li>成像3分钟后，通过在线鲁尔注射口注入200 µL单核细胞悬液（6x106 个细胞/mL）。 
	注意： 单核细胞迅速出现在顶焦平面，黏附并开始迁移（从顶侧向基底侧移动）。</li>
	<li>至少成像30分钟。完成后停止成像并停止流动，夹闭管路以将其从载玻片上断开。</li>
	<li>用4%多聚甲醛在4 °C固定载玻片10分钟。</li>
	<li>用PBS洗涤载玻片，如需进一步分析，将载玻片在4 °C保存。</li>
</ol>
8. 使用 ImageJ 分析数据
<ol>
	<li>计数每个视野中总的贴壁单核细胞数量，计算每 mm2 的细胞数。</li>
	<li>计数位于内皮细胞下方基底侧平面中、且在细胞核周围可见黑色空斑（绿色荧光通道）的跨膜迁移单核细胞。</li>
	<li>将跨膜迁移的白细胞数量除以总的贴壁白细胞数量，跨膜迁移率以贴壁单核细胞的百分比表示。</li>
	<li>为便于说明，可同时显示顶端侧和基底侧，以展示发生在这些内皮细胞区室中的事件。</li>
</ol>

<ol><li>Auffray, C., Sieweke, M. H., Geissmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+Monocytes%3A+Development%2C+Heterogeneity%2C+and+Relationship+with+Dendritic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Blood Monocytes: Development, Heterogeneity, and Relationship with Dendritic Cells.</a> Annual Review of Immunology. 27 (1), 669-692 (2009).</li>
<li>De Palma, M., Venneri, M. A., Roca, C., Naldini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+exogenous+genes+to+tumor+angiogenesis+by+transplantation+of+genetically+modified+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Targeting exogenous genes to tumor angiogenesis by transplantation of genetically modified hematopoietic stem cells.</a> Nature Medicine. 9 (6), 789-795 (2003).</li>
<li>Sidibe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenic+factor-driven+inflammation+promotes+extravasation+of+human+proangiogenic+monocytes+to+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Angiogenic factor-driven inflammation promotes extravasation of human proangiogenic monocytes to tumours.</a> Nature Communications. 9 (1), 355(2018).</li>
<li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+to+the+site+of+inflammation%3A+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Immunology%22%5BJournal%5D)">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nature Review Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).</li>
<li>Nourshargh, S., Alon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+Migration+into+Inflamed+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Leukocyte Migration into Inflamed Tissues.</a> Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).</li>
<li>Cros, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+CD14dim+monocytes+patrol+and+sense+nucleic+acids+and+viruses+via+TLR7+and+TLR8+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Human CD14dim monocytes patrol and sense nucleic acids and viruses via TLR7 and TLR8 receptors.</a> Immunity. 33 (3), 375-386 (2010).</li>
<li>Geissmann, F., Jung, S., Littman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+monocytes+consist+of+two+principal+subsets+with+distinct+migratory+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Blood monocytes consist of two principal subsets with distinct migratory properties.</a> Immunity. 19 (1), 71-82 (2003).</li>
<li>Chamorro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+porcine+blood+CD163%E2%88%92+and+CD163%2B+monocytes+into+functional+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of porcine blood CD163− and CD163+ monocytes into functional dendritic cells.</a> Immunobiology. 209 (1-2), 57-65 (2004).</li>
<li>Passlick, B., Flieger, D., Ziegler-Heitbrock, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+novel+monocyte+subpopulation+in+human+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a novel monocyte subpopulation in human peripheral blood.</a> Blood. 74 (7), (1989).</li>
<li>Venneri, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+proangiogenic+TIE2-expressing+monocytes+%28TEMs%29+in+human+peripheral+blood+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Identification of proangiogenic TIE2-expressing monocytes (TEMs) in human peripheral blood and cancer.</a> Blood. 109 (12), 5276-5285 (2007).</li>
<li>Bradfield, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JAM-C+regulates+unidirectional+monocyte+transendothelial+migration+in+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">JAM-C regulates unidirectional monocyte transendothelial migration in inflammation.</a> Blood. 110 (7), 2545-2555 (2007).</li>
<li>Schenkel, A. R., Mamdouh, Z., Muller, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locomotion+of+monocytes+on+endothelium+is+a+critical+step+during+extravasation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Locomotion of monocytes on endothelium is a critical step during extravasation.</a> Nature Immunology. 5 (4), 393-400 (2004).</li>
<li>Luu, N. T., Rainger, G. E., Nash, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+the+different+steps+during+neutrophil+migration+through+cultured+endothelial+monolayers+treated+with+tumour+necrosis+factor-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Vascular+Research%22%5BJournal%5D)">Kinetics of the different steps during neutrophil migration through cultured endothelial monolayers treated with tumour necrosis factor-alpha.</a> Journal Vascular Research. 36 (6), 477-485 (1999).</li>
<li>ibidi GmbH. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Shear+Stress+and+Shear+Rates+for+ibidi+%C2%B5-Slides+-+Based+on+Numerical+Calculations%22">Shear Stress and Shear Rates for ibidi µ-Slides - Based on Numerical Calculations</a>. , (2014).</li>
<li>Yang, L., Froio, R. M., Sciuto, T. E., Dvorak, A. M., Alon, R., Luscinskas, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ICAM-1+regulates+neutrophil+adhesion+and+transcellular+migration+of+TNF-alpha-activated+vascular+endothelium+under+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">ICAM-1 regulates neutrophil adhesion and transcellular migration of TNF-alpha-activated vascular endothelium under flow.</a> Blood. 106 (2), 584-592 (2005).</li>
<li>Yang, C. -R., Hsieh, S. -L., Ho, F. -M., Lin, W. -W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoy+receptor+3+increases+monocyte+adhesion+to+endothelial+cells+via+NF-kappa+B-dependent+up-regulation+of+intercellular+adhesion+molecule-1%2C+VCAM-1%2C+and+IL-8+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Decoy receptor 3 increases monocyte adhesion to endothelial cells via NF-kappa B-dependent up-regulation of intercellular adhesion molecule-1, VCAM-1, and IL-8 expression.</a> Journal of Immunology. 174 (3), Baltimore, Md. 1647-1656 (2005).</li>
<li>Wong, D., Dorovini-Zis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+vascular+cell+adhesion+molecule-1+%28VCAM-1%29+by+human+brain+microvessel+endothelial+cells+in+primary+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">Expression of vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) by human brain microvessel endothelial cells in primary culture.</a> Microvascular Research. 49 (3), 325-339 (1995).</li>
<li>Bradfield, P. F., Nourshargh, S., Aurrand-Lions, M., Imhof, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JAM+family+and+related+proteins+in+leukocyte+migration+%28Vestweber+series%29%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis+Thrombosis+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">JAM family and related proteins in leukocyte migration (Vestweber series).</a> Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 27 (10), 2104-2112 (2007).</li>
<li>Bradfield, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergent+JAM-C+Expression+Accelerates+Monocyte-Derived+Cell+Exit+from+Atherosclerotic+Plaques%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Divergent JAM-C Expression Accelerates Monocyte-Derived Cell Exit from Atherosclerotic Plaques.</a> PLoS One. 11 (7), e0159679(2016).</li>
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作者无竞争性财务利益。

本文报道了一种详细研究单核细胞亚群如何穿过炎症激活的内皮单层的方法。该方法采用共聚焦显微镜，而非相衬显微镜——后者也常用于在流动条件下研究单核细胞的募集过程3,11,19。使用共聚焦显微镜进行延时成像的一个主要优势在于，能够明确区分单核细胞的跨内皮迁移与强黏附状态。尽管基于相衬显微镜的方法同样可靠，但其应用需要操作者具备一定经验，以避免将已迁移的细胞与强烈黏附的细胞混淆。在此情况下，必须建立严格的分析标准，以清晰区分单核细胞募集级联过程中的这两种状态。此外，还应通过共聚焦显微镜进行终点分析，以验证相衬显微镜所观察到的整体趋势。因此，直接采用共聚焦显微镜在流动条件下研究单核细胞募集，可对所捕获单核细胞的实际跨内皮迁移状态提供清晰明确的结果。
在流动条件下使用相差显微镜进行白细胞募集实验时，主要瓶颈之一是分析过程耗时较长，需要从捕获到穿过内皮细胞间连接发生跨内皮迁移的整个过程中追踪单个细胞。尽管此类分...

单核细胞是先天免疫系统中具有吞噬功能的重要组成部分，在抵御病原体、清除受损组织、血管生成以及多种疾病（包括癌症）的病理生理过程中发挥关键作用1,2,3。单核细胞来源于骨髓，是一类具有异质性的细胞亚群，可在血液中循环，并通过特定的分子机制被募集至外周组织的炎症部位。单核细胞的募集过程与白细胞总体类似，涉及多个连续步骤，包括捕获、滚动、爬行、停滞、跨内皮迁移（即转迁移）以及穿过血管壁（包括基底膜和壁细胞）的迁移4。这些步骤主要依赖于内皮腔面在炎症诱导下表达的分子，如选择素、糖蛋白配体、趋化因子、细胞间黏附分子和连接黏附分子，以及白细胞表面相应的受体，例如选择素配体和整合素。白细胞可通过内皮细胞间的连接处（旁细胞途径）或直接穿过内皮细胞本体（跨细胞途径）穿越内皮屏障5。尽管历史上记录单核细胞主要通过跨细胞途径进行转迁移，但随着单核细胞不再被视为均一的细胞群体，其迁移路径可能存在差异的观点也逐渐被提出。目前日益明确的是，不同单核细胞亚群的特性可通过其在渗出级联反应中的差异与共性加以定义3,6。因此，为了明确区分不同的单核细胞亚群，至关重要的是在募集过程中对各亚群的行为进行可视化观察并表型分析。
人、猪、大鼠和小鼠的单核细胞被划分为具有特定功能和特异性迁移行为的表型亚群7,8,9例如，在人类中，单核细胞可根据其表面表达的CD14（细菌脂多糖的共受体）和CD16（Fc-γ受体III）分为三个亚群。人类单核细胞亚群包括经典的CD14+CD16-，中间型 CD14+CD16+ 非经典CD14暗淡CD16+ 细胞6,9经典CD14+CD16- 单核细胞被证明主要具有炎症特性，而CD16阳性单核细胞群体则+ 单核细胞被发现普遍表达TIE2并具有促血管生成功能10一致地，使用人肿瘤坏死因子（TNF）α或白细胞介素（IL-1）β等炎性细胞因子刺激内皮细胞（传统性炎症）足以触发经典CD14的完全募集+CD16- 单核细胞。然而，需要血管内皮生长因子（VEGF）A和TNFα的共同作用（由促血管生成因子驱动的炎症）才能引发CD16阳性单核细胞的跨内皮迁移+ 促血管生成单核细胞群3历史上，传统的Transwell系统在静态条件下、平行板流动腔以及µ-slide流动腔已被用于定量分析单个白细胞群体的募集。 体外11,12,13尽管这些方案已经过验证，但能够同时分析多种单核细胞亚群的更稳健方法将更具洞察力。此类方法必须考虑多种相互作用以及各亚群不同的频率，同时提供对定义每种单核细胞亚群募集级联过程中共性与特异性的机制性理解。
本文介绍一种基于在流动条件下对单核细胞募集进行延时成像的方法，该方法结合共聚焦显微镜，可同时研究不同单核细胞亚群的迁移级联过程。该方法整合了若干关键特征，能够模拟内皮细胞炎症状态以及后微静脉中循环单核细胞的血流动力学环境——后者是体内白细胞募集的主要部位。本方法采用人脐静脉内皮细胞（HUVEC），这些细胞通过已建立的从人脐带中分离提取的标准方案获得。这一临床资源作为生物副产品易于获取，同时可从脐静脉中分离获得数量可观的内皮细胞。我们还使用荧光染料和免疫荧光技术以区分不同的细胞组分，并通过共聚焦显微镜随时间明确界定单核细胞的位置（管腔侧 vs. 管腔外侧）。本文所述方案旨在同时测定单核细胞亚群的跨内皮迁移水平。此外，需注意的是，通过采用不同的生物标志物和标记方法，该技术还可拓展用于研究其他白细胞亚群及其募集过程。

<table><tbody><tr><td>75 cm² 组织培养瓶&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>TPP</td><td>90076</td><td>分离的HUVEC常规培养</td></tr><tr><td>&amp;micro;-滑片 VI 0.4</td><td>IBIDI</td><td>80606</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>TPP</td><td>191015</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>TPP</td><td>191050</td><td></td></tr><tr><td>胶原蛋白 G</td><td>Biochrom</td><td>L 7213</td><td>用于细胞培养瓶的包被</td></tr><tr><td>明胶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1393</td><td>用于细胞培养瓶的包被</td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;无氯化镁磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffered Saline, PBS）&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 和 CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;含MgCl的磷酸盐缓冲液（PBS）&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 和 CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 培养基</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>三通旋塞阀</td><td>BIO-RAD</td><td>7328103</td><td></td></tr><tr><td>青霉素 10,000 &amp;mu;/mL 链霉素 10,000 &amp;mu;g/mL 药物真菌素 25 &amp;mu;/mL</td><td>AMIMED</td><td>4-02F00-H</td><td></td></tr><tr><td>I型胶原酶</td><td>沃辛顿</td><td>LS004216</td><td></td></tr><tr><td>含Earle's盐、L-谷氨酰胺、25 mM HEPES的Medium 199 1x</td><td>GIBCO</td><td>22340020</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白第五组分</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15260037</td><td></td></tr><tr><td>内皮细胞生长补充剂，150 mg</td><td>Millipore</td><td>02-102</td><td></td></tr><tr><td>肝素钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149RT</td><td></td></tr><tr><td>氢化可的松</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6909</td><td></td></tr><tr><td>L-抗坏血酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A 4544</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 二钠盐二水合物 C10H14N2Na2O8 &amp;middot; 2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>APPLICHEM</td><td>A2937.0500</td><td></td></tr><tr><td>CD144（VE-钙黏蛋白），人重组克隆：REA199，FITC</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-100-713</td><td>AB_2655150</td></tr><tr><td>CD31-PE 抗体，人源重组克隆：REA730，PE</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-110-807</td><td>AB_2657280</td></tr><tr><td>抗Podoplanin-APC，人重组单抗：REA446，APC</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-107-016</td><td>AB_2653263</td></tr><tr><td>BD Accuri C6 Plus</td><td>BD生物科学</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;micro;-滑动式鲁尔接头</td><td>IBIDI</td><td>80176</td><td></td></tr><tr><td>CMFDA（5-氯甲基荧光素二乙酸酯）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>C2925</td><td></td></tr><tr><td>重组人TNF&amp;alpha;</td><td>Peprotech</td><td>300-01A</td><td></td></tr><tr><td>重组人 VEGFA</td><td>Peprotech</td><td>100-20</td><td></td></tr><tr><td>NE-1000 可编程注射泵</td><td>KF技术</td><td>NE-1000</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll&amp;nbsp;Paque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD14-PE，人重组克隆：REA599，PE</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-110-519</td><td>AB_2655051</td></tr><tr><td>人全单核细胞分离试剂盒</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-096-537</td><td></td></tr><tr><td>抗人 CD16-PE，人重组克隆：REA423，PE</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-106-762</td><td>AB_2655403</td></tr><tr><td>LS 柱</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>QuadroMACS 分离器</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342三盐酸盐三水合物</td><td>ThermoFisher</td><td>H1399</td><td></td></tr><tr><td>硅胶管</td><td>IBIDI</td><td>10841</td><td></td></tr><tr><td>肘型鲁尔接头</td><td>IBIDI</td><td>10802</td><td></td></tr><tr><td>女性鲁尔锁接头</td><td>IBIDI</td><td>10823</td><td></td></tr><tr><td>鲁尔锁母接头</td><td>IBIDI</td><td>10825</td><td></td></tr><tr><td>直通式鲁尔注射端口</td><td>IBIDI</td><td>10820</td><td></td></tr><tr><td>Ar1 共聚焦显微镜</td><td>尼康</td><td></td><td></td></tr><tr><td>40倍物镜</td><td>尼康</td><td>40倍 0.6 数值孔径 CFI 超长工作距离平场荧光物镜 工作距离：3.6–2.8 mm 校正范围 0–2 mm</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 软件</td><td>美国国立卫生研究院</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

在体外流动条件下同时研究单核细胞亚群的募集

Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro

单核细胞从血液中募集至特定外周组织，在组织损伤、肿瘤发生和自身免疫性疾病过程中的炎症反应中起着关键作用。这一过程通过单核细胞从自由流动状态被捕获到活化的内皮细胞管腔表面，随后黏附并穿越内皮层（即跨内皮迁移）进入下方受累组织而实现。然而，支持单核细胞亚群在特定条件下优先募集的机制目前尚未完全阐明。因此，我们建立了一种可在流动条件下同时可视化并定量不同单核细胞亚群募集过程的方法。该方法基于延时共聚焦成像技术，能够明确区分黏附的单核细胞与已发生跨内皮迁移的单核细胞。本文详细描述了如何利用该方法在体外同时研究促血管生成型与非血管生成型单核细胞的募集级联过程。此外，该方法还可拓展用于研究最多三种单核细胞群体募集过程中的各个步骤。

确定TNFα诱导的HUVEC活化状态
炎性细胞因子TNFα的生物活性可能因批次不同以及冻融循环次数而有所变化。因此，检测TNFα处理后HUVEC的活化状态非常重要。可通过平行染色检测汇合的HUVEC样本中选择素、ICAM-1和VCAM-1的炎性诱导情况来实现15,16,17。另一种更简便的方法是观察内皮细胞在炎性刺激下发生的形态学变化，以判断HUVEC的活化状态。如图3所示，在TNFα存在条件下培养6小时后，HUVEC相较于未刺激细胞出现明显的伸长现象。当HUVEC受到TNFα与VEGFA混合刺激时，也可观察到类似的伸长变化。记录HUVEC的活化状态至关重要，因为单核细胞跨内皮迁移实验的最终结果将取决于内皮细胞活化...

本文介绍了一种整合性实验方案，通过特异性表面标志物和共聚焦荧光显微镜，在体外流动条件下检测单核细胞亚群的迁移行为。该方案可用于研究单核细胞募集的连续步骤，也可通过其他特异性表面标志物对其他白细胞亚型进行分析。

单核细胞从血液募集至靶向外周组织在组织损伤、肿瘤发生等过程中的炎症反应中至关重要……

该方法有助于解答炎症与免疫学领域中的关键问题。例如，白细胞黏附和跨内皮迁移的分子机制是什么。该技术的主要优势在于，能够无限次地区分单核细胞的跨内皮迁移与对内皮单层细胞的牢固黏附。尽管该方法可提供有关单核细胞在流动条件下募集的信息，但也可适用于造血系统中的其他细胞，如T细胞、B细胞或其亚群的衍生物。洗涤后，用30微升37摄氏度、添加1微摩尔CMFDA的M199培养基在37摄氏度和5%二氧化碳条件下对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）标记10分钟。孵育结束后，用150微升完全M199培养基洗涤细胞，并在150微升新鲜完全M199培养基中继续培养30分钟。然后将上清液替换为150微升含有适当实验添加剂的完全M199培养基，并将载玻片培养室放回培养箱中继续孵育6小时。对于人PAN单核细胞的分离，取新鲜采集的血液样本，按1:1比例用添加1毫摩尔EDTA的PBS稀释，小心地将20毫升血液溶液叠加于20毫升密度梯度分离介质上，通过离心进行密度梯度分离。收集中间的外周血单个核细胞-血小板层至一个新的50毫升离心管中，管内预先加入40毫升含1毫摩尔EDTA的PBS，并用额外的PBS-EDTA补至终体积50毫升。计数后，按照试剂盒生产商的说明，使用PAN单核细胞分离试剂盒分离单核细胞。用添加了0.5%牛血清白蛋白（BSA）的M199培养基洗涤细胞三次，以去除EDTA的任何残留。单核细胞分离的质量对于确保可靠的跨膜迁移和黏附结果至关重要。因此，严格遵循制造商提供的分离方案非常重要。将沉淀重悬于新鲜M199培养基中，调整浓度至每毫升含6×10⁶个单核细胞，并添加0.5% BSA。根据趋化实验所需，将细胞分装至各微量离心管中，每管200 µL。随后将细胞于37°C孵育20分钟，再注入流式腔室。为准备流体系统进行分析，首先将一个雄性鲁尔接头插入一段长8 cm、直径3 mm的硅胶管一端，另一端连接至管内鲁尔注射装置。然后将鲁尔接头连接到一段长40 cm、厚3 mm的硅胶管的一端。接着，将20 ml注射器连接到一段长1 m、厚3 mm的硅胶管的一端，并在另一端插入一个雄性鲁尔接头。然后将两个雄性鲁尔接头插入一个雌性鲁尔锁紧耦合器中，并将硅胶管的游离端放入含有37°C M199培养基的储液器中，该培养基添加有0.5% BSA。回抽活塞，使管路充满流动缓冲液，并将注射器固定在注射泵上。然后将泵设置为抽取模式，并设定流速。连接载玻片腔室时，将硅胶管夹紧在雌性鲁尔锁接头耦合器周围，并断开耦合器上的两个雄性鲁尔接头，以便将其连接到载玻片的储液池上。气泡不仅会干扰成像质量，还会对细胞产生毛细管剪切应力，导致细胞死亡。为避免气泡产生，在将鲁尔接头插入储液池前，需确认管路已正确夹紧。随后打开夹子，检查连接处无泄漏，再将载玻片置于显微镜下。为在流动条件下成像单核细胞的募集过程，将5微升荧光标记的抗CD16抗体和适量的核染料加入每份分装的单核细胞中，室温孵育10分钟，随后短暂离心收集细胞。将细胞沉淀重悬于250微升流动缓冲液中，并启动注射泵。取30微升单核细胞悬液加入载玻片的一个腔室中，在共聚焦显微镜下选择40倍物镜开始观察。启动适当的荧光激光器，并使用含有标记单核细胞的腔室设定共聚焦显微镜的采集参数。接下来，在半厘米半径范围内选择三个视野进行多点共聚焦成像，设置Z轴堆栈范围为10至12微米，时间推移采集间隔为每分钟一次。成像3分钟后，通过串联鲁尔注射口注入200微升单核细胞，开始成像细胞相互作用过程。至少30分钟后，停止成像和流动，夹闭管路以便将其从载玻片上断开。为了确定细胞穿过经刺激的 HUVEC 的迁移率，打开 ImageJ 软件，计数每个视野中黏附的单核细胞总数，以确定每平方毫米的细胞数量。然后计数位于内皮细胞下方基底层平面上的已迁移单核细胞数量，这些细胞可通过其细胞核周围存在黑色空晕区来识别。一种简便的方法是通过观察 HUVEC 在炎症应激条件下是否发生伸长，来评估其激活状态。延时共聚焦成像可实现对位于顶端层面单核细胞的可视化观察，从而评估其表型。发生跨内皮迁移的迁移细胞会移向细胞间连接处，随后从顶端层面消失，并在基底层面重新出现。随时间变化对单核细胞募集进行定量分析证实，单核细胞黏附之后即发生跨内皮迁移。当内皮细胞仅受到TNF alpha刺激时，CD16阳性单核细胞的跨内皮迁移率较低；但当内皮细胞同时受到TNF alpha和血管内皮生长因子（VEGFA）刺激时，迁移率增加。与CD14阳性单核细胞相比，HUVEC在受到TNF alpha以及TNF alpha联合VEGFA刺激后，对CD14阴性T细胞、B细胞和NK细胞的黏附能力增强。此外，HUVEC的刺激仅诱导单核细胞群体发生跨内皮迁移，而在TNF alpha或TNF alpha联合VEGFA的刺激条件下，T细胞、B细胞和NK细胞均不发生跨内皮迁移。为了进行最佳的单核细胞趋化实验，重要的是您需要提前规划实验，并在同一天完成操作。在分离细胞时，请确保显微镜处于37摄氏度，以避免实验过程中将细胞转移至不同温度环境。为了深入掌握该操作流程，还可开展其他方法，如HUVEC细胞因子和趋化因子表达谱分析以及趋化迁移研究，以进一步探究维持特定单核细胞群体跨内皮迁移和黏附的分子机制。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

体外流动下单核细胞亚群的同时研究

本视频演示了一种 体外 探索间充质干细胞（MSCs）对效应T细胞增殖免疫调节作用的检测方法。该检测包括将MSCs与外周血单个核细胞（PBMCs）共培养，以诱导单核细胞群体获得免疫调节表型，进而分泌白细胞介素-10（IL-10）。随后与活化的CD4+...

一种体外评估单核细胞对白细胞增殖免疫调节作用的实验方法

该视频展示了一种研究基质细胞对白细胞募集影响的方法。在平行板流动腔模型中，促炎性细胞因子诱导内皮细胞表达黏附受体，从而促进中性粒细胞的募集和迁移。基质细胞与内皮细胞之间的相互作用会减弱中性粒细胞向内皮细胞的募集。...

基质细胞对白细胞募集影响的体外流动研究

白细胞向肝脏的募集发生在由独特的肝窦内皮细胞衬覆的肝窦特殊通道中。在生理剪切应力条件下，通过相差显微镜观察白细胞跨越人肝窦内皮的过程，有助于阐明该过程背后的分子机制。...

一种在剪切应力条件下研究白细胞向人肝窦内皮黏附的流动黏附实验

此处，我们介绍一种可用于评估白细胞募集动态的实验方案 离体...

在流动条件下评估白细胞-内皮细胞相互作用 离体 自动灌流微流控腔室检测法

炎症内皮从血流中募集白细胞的能力受到间充质基质细胞的调控。我们描述了两种 体外...

分析基质细胞对流动中白细胞募集的影响

单核细胞是人类先天免疫系统的重要组成部分，在活化时依赖糖酵解代谢。本文介绍一种流式细胞术方案，用于检测新鲜全血中总单核细胞及单核细胞亚群的葡萄糖转运蛋白表达和葡萄糖摄取能力。...

一种简单的流式细胞术方法用于检测全血中单核细胞亚群的葡萄糖摄取及葡萄糖转运蛋白表达

用于定量评估淋巴细胞趋化性和迁移性的实验方案是免疫学研究中的重要工具。此处，一个 体外 该方案可实现对细胞迁移进行实时、多重评估，以及一种互补的 体内...

量化人单核细胞趋化性 体外 和小鼠淋巴细胞迁移 体内

我们描述了一种用于测量单核细胞穿过人内皮单层并进一步成熟为泡沫细胞的跨内皮迁移实验方案。该方法可灵活评估来自不同疾病状态个体的单核细胞的致动脉粥样硬化特性，并可用于评价血液中可能增强这种倾向的各类因素。...

慢性炎症状态下单核细胞跨内皮迁移及泡沫细胞形成的定量分析

血管壁损伤或炎症期间，白细胞会积极地与血管细胞和血小板相互作用。本文介绍一种基于层流的简便检测方法，用于表征白细胞与其细胞伙伴之间相互作用的分子机制。...

基于层流的检测方法用于研究白细胞在培养的血管细胞和黏附血小板上的募集作用

本文介绍了一种通过全血流式细胞术对单核细胞亚群进行表征的实验方案。内容包括如何设门圈定各亚群、检测其表面标志物的表达水平，并以检测M1型（促炎）和M2型（抗炎）标志物的表达为例进行说明。...

通过全血流式细胞术分析表征人单核细胞亚群

本文介绍了一种在小鼠模型中定量检测血液单核细胞趋化活性的实验方案，用于评估营养、药物和遗传干预对血液单核细胞的影响，并利用单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）负载的基底膜来源凝胶塞来表征小鼠模型中由血液单核细胞衍生的巨噬细胞。...

体内单核细胞趋化活性的定量分析及血液单核细胞来源巨噬细胞的表征

学习利用共聚焦荧光显微镜和特异性表面标记，在体外流动条件下同时研究单核细胞亚群的黏附与跨内皮迁移机制。该方法可扩展应用于其他造血细胞类型的分析。

在体外流动条件下同时研究单核细胞亚群的募集

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